第六章 同核磁实验方法.docx
- 文档编号:4285988
- 上传时间:2022-11-28
- 格式:DOCX
- 页数:14
- 大小:250.76KB
第六章 同核磁实验方法.docx
《第六章 同核磁实验方法.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《第六章 同核磁实验方法.docx(14页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
第六章同核磁实验方法
第六章同核核磁实验方法
通常所谓同核核磁谱指的是1H同核谱,因为一般有机物富含氢,而1H的天然丰度达99.98%,而且1H的旋磁比最大,因而核磁信号最强。
其他核的核磁信号的检测相对来讲都比较困难,尤其是蛋白质中有意义的如13C,15N的天然丰度分别只有1.11%和0.36%,相对1H的检测灵敏度只有0.0159和0.00104,因此要检测蛋白质中的13C及15N一定要有同位素标记才行,而且还需长时间累加。
一般同核谱可研究的蛋白质分子量的上限在1万左右,当然还要求蛋白质在溶液中有足够的溶解度,化学位移的分布比较分散。
蛋白质中质子的化学位移基本上是randomcoil的化学位移加上不同构象的影响。
如β折叠多的蛋白质同α螺旋多的蛋白质相比,化学位移更为分散,谱峰也更容易解析;同种氨基酸残基多的蛋白质,即使分子量较小,由于化学位移可能会比较密集,谱峰解析可能比稍大一些的蛋白质还要困难。
已经发表的脉冲序列有上百,但通常可以看作常规实验的为数不多。
6.1一维氢谱
在记录二维谱或三维谱等之前均需要记录一维氢谱,通常蛋白质溶于水或适当的缓冲液,加5-10%的D2O作为锁场介质。
一维氢谱可用于检查样品是否有足够浓度,通常16-32次采样要能得到足够信噪比的谱图,甲基由于快速旋转呈现窄峰,而酰胺质子由于化学交换及14N的标量弛豫呈现宽峰;
一维氢谱还可用于检查样品的共振峰宽是否合理,蛋白质在高浓度下容易聚集从而增宽谱线,严重时甚至1H谱上看不到明显的峰,样品在这种条件下显然无法进行核磁研究;一维氢谱还可用于判别样品的化学位移分布情况,可判别样品是否变性,同时也对研究工作的难度提供一些预测。
上图显示ubiquitin(一种蛋白质,76个残基)的一维谱:
a水溶液中,b箭头所指甲基区的放大,c8M尿素溶液中,显示变性谱。
蛋白质的一维氢谱一般不应该有非常尖的峰,若出现这种峰,往往是残留的小分子杂质,当然蛋白质的末端及loop区由于分子运动较快也会出现一些较尖的峰。
当样品条件不佳时,一维谱(以及若干信号强的二维谱)可用来探索适合的样品条件。
6.2COSY型实验
6.2.1COSY
ACOSY(correlatedspectroscopy),是人们发明的第一种二维谱,同时也是研究蛋白质的最有用的二维谱之一。
二个有J偶合的核在COSY上可产生一个交叉峰,由于蛋白质(包括多数其他有机物)中有J偶合意味着这两个核最多通过3个共价键连接,所以COSY谱对于分子结构的拓扑连接可提供非常有价值的信息。
左图是COSY的脉冲序列,只由2个90度脉冲组成,两脉冲之间是演化期,理想脉冲本身不产生其他杂信号,故不需相循环抑制:
因此基本的相循环为:
φ1=x;φ2=x;φref=x
实际上由于演化期的弛豫以及第一个90度脉冲的不准确会产生轴峰,需要用2步循环抑制:
第一个脉冲及接收机相位同时反转
通常还加上CYCLOPS循环以抑制硬件不平衡产生的其他杂信号
这样形成8步循环:
φ1=02132031
φ2=00112233
φref=02132031
二维谱有幅度谱和相敏谱之分,由于相敏谱的分辨率高,通常要尽量用相敏谱。
B以下是可以在Bruker核磁谱仪上用于记录蛋白质COSY谱的脉冲程序,脉冲序列在Bruker谱仪上称作微程序:
;cosyprst.WJH
#include
“p2=p1*2”
“d0=in0/2-p1*4/3.14159”
“d11=30m”
“d12=20u”
“d13=3u”
“l3=(td1/2)”
1ze
2d11
3d11
4d12pl9:
f1
d1cw:
f1
d13do:
f1
d12pl1:
f1
p1ph1
d0
p1ph2
go=2ph31
d11wr#0if#0ip1zd
loto3times2
d11id0
loto4timesl3
exit
ph1=02201331
ph2=00221133
ph31=02201331
C脉冲序列分析
a二自旋体系考虑相循环的第一步
第一项为纵向磁化,第二项为多量子项,均不能被观测到;
第三项仍然是第一核的横向磁化,在检测期的频率同演化期类似,均是第一核的,对应于对角峰;
第四项是第二核的反向磁化,在检测期的频率为第二核的化学位移,与演化期不同,对应于交叉峰,这是二维谱最有意义的峰。
进一步将后两项的系数分解:
可见,对角峰在F1维位于Ω1,同相裂分成两个成分,距离2πJ12;
而交叉峰在F1维也位于Ω1,但反相裂分成两个成分,距离也是2πJ12。
由于一个信号为正弦调制,另一个为余弦调制,对角峰信号与交叉峰信号在相位上相差90度,故在F1维两者不能同时调相成吸收型信号。
再看F2维,对角峰为同向磁化
,在检测期呈现同相裂分,距离2πJ12;
交叉峰在F2维为反向磁化
,在检测期呈现反相裂分,距离也是2πJ12。
由于一个信号在x方向,另一个在y方向,两者在相位上也相差90度,故在F2维两者也不能同时调相成吸收型信号。
COSY的交叉峰为反相峰,这一点非常重要,决定了COSY型实验采样及处理时需要注意的问题。
而交叉峰与对角峰在相位相差90度,对于谱图在对角线附近的质量有重要的影响。
b多自旋体系考虑I1和I2间的交叉峰,类似的计算可得其系数为:
其中的余弦项表明在F1维第一核相对除第二核(称为主动偶合)外的其他核(称为被动偶合)呈现同相裂分;同样在F2维由于交叉峰的密度算符为第二核相对第一核的反相磁化,其中没有出现被动偶合核的算符,即相对于被动偶合核为同相磁化,因此也呈现同相裂分。
当其中一个核为甲基时,由于磁全同的缘故,出现多重裂分:
同相峰可用pascal三角形描述;反相峰用反pascal三角形描述。
D实验方案
同其他二维谱相同处
如确定谱宽,照射频率,测定90度脉宽,选择循环延迟时间等
反相谱的特殊处
1由于两维的交叉峰均是反相峰,因此两维都要有足够的分辨率,否则正负两部分的信号产生部分重叠,而使信号减弱;
2交叉峰的观测信号包含
,由于同核偶合常数不大,通常几Hz至十几Hz,因此t1及t2的最大值要达到
至
,这样才能获得足够强度的信号,这相当于62-125ms(假定4Hz的偶合常数)。
对于t2一般不成问题,但t1则不然:
因为t1的增量由谱宽确定,t1的最大值越大意味着F1维的数据点数也越大,而实验时间与F1维点数成正比。
对一般蛋白质而言,通常置照射频率在水峰处,谱宽大致10ppm,接近5000Hz,因此t1的增量为0.2ms,若F1维点数取512,t1的最大值可达50ms左右;若F1维点数取1024,t1的最大值可达100ms左右。
因此一般F1维点数取512至1024。
左图显示不同F1维点数的效果:
at1max=69ms,NS=16;
bt1max=34.5ms,NS=32;
ct1max=17.2ms,NS=64
E数据处理
通常交叉峰总是调相成吸收线型,此时对角峰呈色散线型。
由于色散峰的长拖尾对靠近对角线的交叉峰产生干扰,所以必须加适当的窗函数,通常以不带相移或略有相移的正弦函数或正弦平方函数。
左图显示不同相移的正弦窗函数作用于F1维的效果:
a30度;b20度;c10度;d5度
F应用
在高场区由于化学位移的简并,谱峰的重叠,对角峰的干扰,通常不容易由COSY辨认整个自旋系统,在蛋白质COSY特别有用处是用于检查所谓的指纹区特别是酰胺质子与α质子的交叉峰。
在这个区域,脯氨酸由于没有氨基没有交叉峰;甘氨酸有两个α质子故有两个交叉峰(除非两者的化学位移相同);N端残基上的NH由于与水交换快也没有交叉峰。
除特殊情况外,对于不大的蛋白质,所有的峰都应该能找到。
蛋白质COSY上的几个主要区域
leucine,isoleucine,valine侧链交叉峰
alanine,threonine甲基区
1HN-1Hα指纹区
GJ偶合常数的测量
在没有被动偶合时,COSY的精细结构可以用于测定J偶合常数,但直接由谱峰的裂分得到的值有较大的误差。
显示表观裂分与线宽的关系
HCOSY的变型
1COSY-β第二个90度脉冲用小于90度的脉冲代替,其结果是:
对角峰被减弱
多核体系中被动偶合产生的某些交叉峰被减弱,导致精细结构的变化,起到简化图谱的作用
上图比较COSY-35同普通COSY的图谱,GLY的1HN-1Hα交叉峰结构发生变化,因而有利于J偶合常数的测定
2pre-TOCSYCOSY预饱和同时抑制接近水峰的αH信号,因而从αH到其他质子特别是NH的交叉峰减弱甚至消失,而NH到αH的交叉峰往往淹没在水峰产生的t1噪声中。
在pre-TOCSYCOSY中,在COSY序列前插入一个短时间的TOCSY混合脉冲,使其他质子的信号先传递给αH,这样可部分恢复αH到其他质子的信号。
6.2.2RelayedCOSY(R-COSY)
A所谓接力谱,COSY的一种扩展,在COSY的二个脉冲后加一个延迟,使反向磁化进一步传递给第三个核,最后一个90度脉冲完成第二核至第三核的相干传递,这样观测的第一核同第三核的交叉峰,虽然两者可能并没有J偶合。
显然,接力谱中的交叉峰表明两个自旋同属一个自旋系统。
左图为R-COSY的脉冲序列,基本相循环为8步:
φ1=02020202
φ2=00002222
φ3=00000000
φ4=00220022
φref=02020202
整个循环由二步φ1,二步φ2,二步φ4组成,而φref=φ1,选择条件变成
,即
,由于三者均是完整的二步循环,因此得选择的相干传递途径为:
∆p1=±1;∆p2=0,±2;∆p4=0,±2
需要时可加上CYCLOPS扩展成32步循环
B脉冲序列分析
考虑三核体系,1,2核间以及2,3核间有J偶合,而1,3核间无J偶合。
同样只考虑第一步相循环。
经过前二个脉冲作用,第一核产生的信号如COSY中所计算,在回波序列的作用下:
最后一个90度脉冲产生:
其中第4项是不可观测信号,第6项为接力信号,这个信号在F2维位于Ω3处,相对第2核反向,在F1维位于Ω1处,相对第2核也是反向。
通常在调相时将这种峰调成吸收线型。
第1项和第3项均是对角峰,但两者分别为同相和反相峰,且相位差90度。
第2项和第5项为普通COSY中可见的交叉峰,但相位及线型不同。
C实验及处理同普通COSY类似,通常τ取几十ms。
6.2.3Double-RelayedCOSY(DR-COSY)
在R-COSY序列后再加一个回波及90度脉冲就形成双接力谱。
下图显示COSY中交叉峰的精细结构
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 第六章 同核磁实验方法 第六 实验 方法
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)