最新PCR法检测HBV.docx

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最新PCR法检测HBV

PCR法检测HBV

PCR法检测HBV

摘要：

目的了解乙型肝炎病毒的相关知识及PCR技术在乙型肝炎病毒检测方面的应用，并通过实验的方法加深理解。

方法将已导入乙肝病毒特定段基因的质粒用基因扩增仪进行扩增，然后分两组进行电泳，并设置阴性对照、阳性对照、空白对照和Marker对照组。

电泳完毕后将胶板放在UVP凝胶成像系统下观察，对照。

结果实验组1弱阳性，实验组2阴性。

讨论分析了实验结果及误差产生的可能原因。

关键词：

HBVPCR琼脂糖凝胶电泳

一、引言

1.现状

乙型肝炎病毒感染是一个全球性的公共卫生问题。

据估计，全世界大约有20亿人是过去或现在的HBV感染者以及超过350万人长期感染乙肝病毒。

在受感染的青少年或成人中，5％-10％将发展成慢性携带者，而在受感染的新生儿达90％慢性化发展。

在慢性HBV感染者中，70％-80％可以持续正常多年或终身。

进一步持续病毒感染，可以导致慢性活动性肝炎，甚至可能发展至肝硬化和肝癌。

[1]在我国，乙肝病毒携带者约有1.2亿人。

2.HBV的形态与结构[2]

感染者血清中用电镜观察可见三种不同形态的HBV颗粒，即大球形颗粒、小球形颗粒和管形颗粒。

大球形颗粒亦称Dane颗粒，是具有感染型的完整成熟的HBV，呈球形。

病毒外层有7nm厚的包膜，内层为病毒核心（核衣壳）结构，成二十面体立体对称。

HBV核心内部含有双股不完全环状的DNA基因组和DNA多聚酶。

小球形颗粒，主要为HbsAg，不含HBVDNA和DNA多聚酶，无感染性。

管形颗粒，是由小球形颗粒“串联”而成，不含病毒核酸，无传染性。

3.HBV基因结构及抗原组成[3]

HBV-DNA分为负链（长链）及正链（短链），其中负链有4个开放阅读框架，分别称为S、C、P和X基因区，他们彼此间相互重叠，以不同的启动子编码多种蛋白。

S基因区：

S区基因有3个不同的启动子，分别形成S基因、PreS1基因与PreS2基因，分别编码HbsAg、PreS1Ag和PreS2Ag三种包膜蛋白多肽；

C基因区：

由前C基因和C基因组成,分别编码HBeAg及HBcAg；

P基因区：

P区基因最长，编码HBV-DNA多聚酶、反转录酶及RNA酶H（RnaseH）等；

X基因区：

X区基因编码的蛋白称为HbxAg，可反式激活HBV的基因，增强HBV基因的复制和表达。

4.HBV的检测

近二十年以来，人们在乙肝诊断方法方面做了大量的研究工作。

早期阶段主要应用生化检查方法即肝功能检查，还有免疫学方法，主要采用血清学方法检测血清HBV抗原、抗体，检测HBVDNA多聚酶等。

近来随着分子生物学的快速发展，分子生物学技术检测血清HBVDNA（HBV感染的直接标志）的方法开始被应用于乙肝的诊断，并且不断发展完善。

聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction,PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。

它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。

将PCR技术和琼脂糖凝胶电泳结合，可用于HBVDNA的检测，并且具有以上优点。

[4]

二、实验材料和主要实验仪器

1.模板：

重组质粒（将乙肝病毒特定段基因导入到质粒中）

2.特异性引物

上游引物：

5’-CACCTCCTCCTGCCTCCACCAATC-3’（1299-1322）24bp

下游引物：

5’-GGCCCCCAATACCACATCATCCAT-3’（2133-2157）24bp

3.DdH2O,缓冲液10×buffer+Mg2+，dNTP,Taq

4.溴酚兰：

BIOER，LotNO.20071002,storage-20℃

5.Marker：

BIOER，BioDL2000，LotNO.20071002

6.电泳仪，生产厂家：

北京百晶生物技术有限公司，型号BG-Power600

7.基因扩增仪，生产厂家：

EPPENDOF

8.UVPBioimagingsystems，AmericanUVPcorporation，GDS-8000system

9.微型漩涡混合器，上海康华仪器制造有限公司，型号WH861

10.微量加样器，生产厂家：

北京百晶生物技术有限公司

11.EP管

三、实验方法

1.PCR

将反应体系各成分加入EP管中，用微型漩涡混合器震荡混匀，各种成分的量见下表：

DdH2O

缓冲液

引物1

引物2

dNTP

Tap

总量

体积（μl）

99

15

6

6

12

1.2

139.2

从管中分别吸取23μl混合液加入到另外5个EP管中，然后分别向其中4个管中加入阴性对照、阳性对照、实验组1、实验组2四种模板2μl，另一管中加入2μlH2O做空白对照。

将以上五管放入离心机中离心，封口，放入基因扩增仪中扩增，反应条件如下：

94℃预变性5min

94℃变性45s

62℃复性45s

72℃延伸45s

72℃延伸10min

第二、三、四项设置为20个循环

2.琼脂糖凝胶电泳

（1）将琼脂溶化后浇到电泳板上，待其凝固。

（2）琼脂凝固后将胶板放入电泳槽中，注意有加样孔的一端放在阴极，然后向电泳槽中倒入缓冲液直至没过琼脂胶板。

（3）从各管中分别取出6μl混合液与1μl溴化乙锭混合均匀，加入到点样孔内，注意不能把胶插破，也不能让液体溢出到孔外。

（4）盖上电泳槽盖，接通电源，开始电泳。

3．UVP成像

电泳完毕后，将胶板放到UVP凝胶成像系统中成像，观察并对照结果。

四、实验结果及讨论

1.

实验结果

从左到右各区带依次为阴性对照、阳性对照、实验组1、实验组2、空白对照和Marker。

实验组1出现了特异性条带，但是比较模糊，呈弱阳性；实验组2没有出现特异性条带。

2.结果分析

除Marker外，其余各带均比较模糊，与缓冲液中Mg2+浓度有关。

出现非特异性扩增条带。

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现，其原因：

一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

其对策有：

必要时重新设计引物。

减低酶量或调换另一来源的酶。

降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。

假阴性，不出现扩增条带。

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

　　模板：

①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

　　酶失活：

需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

　　引物：

引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：

①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

　　Mg2+浓度：

Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

　　反应体积的改变：

通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

　　物理原因：

变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异：

如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

3.其他可能出现的问题及讨论

（1）假阳性

　　出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

　　引物设计不合适：

选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。

靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。

需重新设计引物。

　　靶序列或扩增产物的交叉污染：

这种污染有两种原因：

一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：

操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。

必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。

可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

（2）出现片状拖带或涂抹带。

　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

其对策有：

减少酶量，或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。

适当降低Mg2+浓度。

增加模板量，减少循环次数。

五、发展与展望

肝炎病毒基因PCR检测技术的推广应用对临床诊断病毒性肝炎及观察抗病毒治疗的疗效提供了一个有力的工具。

HBVDNA定量、HCVRNA定量、肝炎病毒基因型的检测及HBV变异的检测均使临床诊治病毒性肝炎获益匪浅。

由于各实验室所用仪器或试剂的差异,目前各家医院肝炎病毒基因PCR检测结果尚不全统一,给患者造成了不便,也浪费了国家宝贵的医疗资源。

希望在不久的将来PCR检测能够尽早达到标准化,重视并加强质量控制,提高其准确性,使之更适用于临床诊治应用。

[5]

六、参考文献

[1]HepatitisBvirusDNAismorepowerfulthanHBeAgin

predictingperipheralT-lymphocytesubpopulationsin

chronicHBV-infectedindividualswithnormalliverfunctiontests；WorldJGastroenterol2008June21;14（23）:

3710-3718；JingYou,HutchaSriplung.

[2]医学微生物学；贾文祥陈锦英江丽芳；人民卫生出版社；2005年8月第一版。

[3]乙型病毒性肝炎；张伟刘建伟；中国农村医学杂志2004年7月第2卷第4期。

[4]乙型肝炎和丙型肝炎的实验室检查方法进展；孙颖；哈尔滨医药2007年第27卷第2期。

[5]临床肝病研究十年回顾及展望；聂青和周天仇；实用肝脏病杂志2006年2月第9卷第1期。