引物篇引物合成与各种问题总结.docx

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引物篇引物合成与各种问题总结

引物篇

1•引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。

DNA合成仪有很多种，主要都是由ABI/PE公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相栽体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3端向S端合成的，相邻的核昔酸通过磷酸二酯键连接。

第一步是将预先连接在固相栽体CPG上的活性基团被保护的核昔酸与三氯乙酸反应，脱去其S-軽基的保护基团DMT,获得游离的軽基；

第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核昔酸单体，与活化剂四氮瞠混合，得到核昔亚磷酸活化中间体，它的3端被活化，5、轻基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5二轻基发生缩合反应。

第三步，带帽（capping）反应，缩合反应中可能有极少数3氓基没有参加反应（少于2%）,用乙酸酹和1-甲基咪哇终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷醸形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核昔酸被连接到固相栽体的核昔酸上。

再以三氯乙酸脱去它的S-務基上的保护基团DMT,重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。

合成过程中可以观寮TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC,PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。

沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。

2•引物纯化方式有哪些，如何选择？

♦C18柱脱盐：

有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不矣被水洗脱，所以能有效地去除盐分。

它不能有效去除比目的片段短的小片段。

实际上，它是一种脱盐的作用。

这种方法一般不矣对普通PCR反应产生影响。

对于需要用干测序、克隆的引物不能使用这个级别。

♦OPC纯化：

OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。

OPC法纯化的DNA纯度大于95%。

适用干40mer以下引物的纯化。

♦PAGE纯：

PAGE纯化法是便用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。

PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%,对长链OligoDNA（大于50mer）的纯化特别有效。

♦HPLC纯化：

HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。

纯度可以大于99%O主要用干短链和修饰引物的纯化。

该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。

3•引物的OD数如何定量？

答：

引物合成引物OD数是这样测定的：

用紫外分光光度计，波长260nm,石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。

测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。

DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用lml水稀释测OD值。

需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。

4•需要什么级别的引物？

答：

引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。

根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。

应用引物长度要求纯度级别要求

一般PCR扩增<45baseOPC

>45basePAGE

诊断PCR扩增<40baseOPC,PAGE

DNA测序20base左右OPC

亚克隆，点突变等根据实验要求定OPC,PAGE,HPLC

基因构建（全基因合成）根据实验要求定page

反义核酸根据实验要求定page

修饰引物根据实验要求定PAGE,HPLC

5•最长可以合成多长的引物？

答：

引物越长，出现问题的概率就越大。

我们合成过120base的引物，但是产率很低。

除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，

SOmer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不矣超过40%,后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。

6•需要合成多少OD数？

答：

根据实验目的确定。

一般PCR扩增，2OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。

如果是做基因拼接或退火后做连接，1OD就足够了。

但是有些研究人员，就做几次PCR,但是却要5-10ODo做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。

片段越长，最后全长得率就越低，出错的几率就越大。

超出需要之外的OD数要求，其实也是对社矣资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。

7•如何检测引物的纯度？

答：

实验室方便的作法是用PAGE方法。

使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。

取0.2-0.50D的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95°C,2mins）。

加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。

600V电压进行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。

如果条件许可，也可以用EB染色或银染方式染色。

8•如何计算引物的浓度？

答：

引物保存在高浓度的状况下比较稳定。

弓I物一般配制成10-50pmol/ulo溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。

如果不一致，请和我们联系。

我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。

一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul,加水的体积（微升）按下列方式计算：

V（微升）=OD数*（乘）33*（乘）*（乘）20000/（除）引物的分子量。

引物的分子量可以从合成报告单上获得。

如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。

注意：

1OD260=33ug/ml・9•如何计算引物的Tm值？

答：

引物设计软件都可以给出Tm,引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离于强度有关。

长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：

Tm=49（G+C）+2°C（A+T）对干更长的塞聚核昔酸，Tm计算公式为：

Tm=81.5+16.6xLoglO[Na+]+0.41（%GC）-600/size公式中，Size=引物长度。

Tm的定义：

Tm=Temperatureatwhich50%ofagivenoligonucleotideishybridizedto让scomplementarystrand・Intheabsenceofdestabilizingagents,likeformamideorurea,Tmwilldependon3majorparameters:

Thesequence:

aGC-richsequenceliasaliigliermeltingtemperature.Thestrandconcentration:

higlioligonucleotideconcentrationsfavorliybridformation,whichresultsinahigliermeltingtemperature.Thesaltconcentration:

higiiionicstrengthresultsinahiglierTmascationsstabilizetheDNAduplexes・

10•引物（含修饰）的分于量是如何确定的？

答：

非修饰的引物的MolecularWeiglit在随引物提供的报告单上都有明确的标示。

如果需要估计一个引物的分于量按每个碱基的平均分于量为324.5,引物的分于量=碱基数x碱基的平均分子量。

或按下列公式计算MW=（NA*WA）+（NC*WC）+（NG*WG）+（NT*WT）+（Nmod*Wmocl）+（Nx*Wx）+（Ni*Wi）+16*Ns-62.

NA,NG,NC,NT,Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA,WC,WG,W,Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分于量，Nmod,Wmod分别为修饰基团的数目和分子量「

对于混合碱基的分于量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分于量为（313.21+329.21）/2=321.21。

Ns为硫代数目，硫代每个位直增加分子量16。

常规碱基分于量

BaseMolecularWeiglit

A313.21

C289.18

G329.21

T304.19

I314.2

U290.17

常规修饰基团分子量

5'-Biotin405.453’-TAMARA623.60

11•如何溶解引物？

答：

干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。

根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mMTrispH7.5缓冲液，室温放直几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。

溶解引物用的水一般不要用蒸他水，因为有些蒸憎水的pH值比较低（pH4-5），引物在这种条件下不稳定。

12•如何保存引物？

答：

引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。

引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。

溶解后的引物-20度可以长期保存。

如果对实验的重复性要求较高,合成的OD数较大，建议分装，避免反負冻融。

修饰荧光引物需要避光保存。

13•合成的引物5'端是否有磷酸化

答：

合成的引物5'为務基，没有磷酸基团。

如果需要您可以用多核昔酸激酶进行3端磷酸化，或者要求我们合成时直接在S或3端进行磷酸化，需要另外收费。

14•引物片段退火后不能连接到栽体上是什么问题？

连接反应需要引物的5'磷酸基团°如果需要将合成的引物退火直接连接相应的栽体上，引物需要磷酸化。

磷酸化的产物如果还不能连接栽体上，需要检查栽体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。

SiRNA分于具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提髙退火温度。

15•测序发现引物有突变是怎么回事？

答：

测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物，发生的概率不大，但是肯定也矣发生。

用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的，碱基输错的机矣不多。

我们有一套控制办法，预防碱基输入错误。

发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法彻底解决这个问题。

引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以超脱。

引物合成是一种多步骤的化学反应，合成效率最高也就是99%,副产品不可以避免。

引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失DMT,导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。

至于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽（capping）反应不彻底造成的，Caping反应主要是封闭极少数3-務基没有参加反应单体。

被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。

对于碱基直换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能很好地与互补链配对，当扩増的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中，可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。

直换突变通常发生在G转换成其它碱基。

碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体（脱嚓吟），2,6d