细菌鉴定流程.docx

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细菌鉴定流程

细菌鉴定流程

细菌鉴定

细菌形态学鉴定16SrDNA鉴定生理生化鉴定

一、细菌形态学鉴定

1.从-80˚Ϲ冰箱中取出菌株放4˚Ϲ复苏，轻柔混匀后用接种环接一环菌液在培养基平板上划线活化，根据菌株来源选择适宜的培养基。

2.放入培养箱倒置培养，实验室一般采用28˚Ϲ培养，特殊菌株依据该菌最适条件（时间、温度）培养24-48h。

3.纯化：

从活化培养基平板上挑取单菌落继续划板培养。

4.观察记录菌落形态特征：

大小（mm）、形状、干湿、透明度、颜色、边缘整齐还是，，，，，，，

细菌

大小（mm）

形状

干湿

透明度

颜色

边缘

注意事项：

1接种划线应在酒精灯旁边操作

2培养时应倒置培养，防止污染

二、革兰氏染色

1.涂片固定

将纯化后的菌株进行革兰氏染色，滴一滴生理盐水于载玻片上，无菌条件下用接种环挑取少量菌落均匀涂布水滴中，使其自然干燥，菌面向上，经火焰固定。

注意事项：

菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。

固定时通过火焰1~2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2.染色

一般包括初染、没染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

（1）加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。

（2）加上碘液染色1分钟，水洗。

（3）加上95%酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约20~60秒，水洗，吸去水分。

（4）加上蕃红后，染色1分钟，水洗。

（5）吸干或在空气中晾干后，油镜镜检。

3.结果观察：

革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。

以均匀分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，都常呈现假阳性。

注意事项：

①标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。

若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。

②玻片通过火焰温度不能太高。

③碘液变透明，则不能使用。

④水洗时动作要轻，沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗，以免把菌体冲掉。

三、16SrDNA鉴定

（16SrDNA只能鉴定到属，需进行生理生化、药敏实验等鉴定到种）

1.细菌复苏、活化、纯化同细菌形态学鉴定

3.挑取单菌落至少2-3个接到含有1ml灭菌纯水的1.5ml离心管中混匀。

4.沸水浴10min，12000rmp离心2min，取1.5ul上清作为模板，上下游引物各0.5ul加到23ul体系中，每个样品做3个平行，进行PCR扩增。

注意事项：

①使用离心机时一定要配平，防止损坏离心机。

②实验前所用离心管、纯水、枪头要灭菌后使用。

（若结果不理想则用改良方法）

1．收集菌体，或直接从平板上刮取细菌（直径约1.5-2mm左右大小菌落的菌量），加入含20ul0.1-0.5%TritonX-100的200ulPCR管中，充分重悬。

2．对于较难散开的细菌则可采用500ul体积（同样含0.1-0.5%TritonX-100），使用超声重悬（菌体相应增加），处理后取出20ul加入200ulPCR管中。

3.将上述PCR管置于沸水中水浴处理5分钟，短暂离心（约30s）后，取1ul作为模板加入20ul（或25ul）体系中，进行PCR扩增。

0.1-0.5%TritonX-100的配置：

①30%储备液的配置

TritonX-1001.41ml

0.1mol/LPBS（pH=7.3）3.64ml

充分混合后，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀，备用。

②用前取该储备液稀释至所需浓度，取1-5ul储备液加入300ul双蒸水中。

普通PCR体系：

（23ul反应体系）50管×PCR体系配制

ddH2O918.5ul

10×buffer125ul

dNTP100ul

rTaq6.5ul

1.配制体系所用的200μlPCR管、1.5ml离心管、纯水、1ml枪头、200μl枪头、10μl枪头均需灭菌，且在无菌操作台中操作。

2.配制体系前先将50个200μl的PCR管放在冰盒上预冷。

3.取一个无菌的1.5ml离心管，依次将药品加入管中，在漩涡混合器上混合5~10秒。

4.每23μl分装入200μlPCR管中，放-20˚Ϲ备用。

5.使用体系之前先验证体系是否好用。

例如：

取实验室已知菌加16s上下游引物进行PCR反应，电泳后凝胶成像系统观察是否有已知条带。

注意事项：

（1）10×buffer、dNTP、rTaq用完尽快放回-20˚Ϲ保存。

（2）无菌操作

PCR程序：

94˚Ϲ5min

94˚Ϲ30s

35个循环55˚Ϲ30s

72˚Ϲ1min30s

72˚Ϲ10min

4˚Ϲ1min

PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳

1.先安装配胶槽，再将梳子插到槽中

2.缓冲液的配制：

（1）50×TAEBuffer储备液

Tirs12.1g、Na2EDTA.2H2O1.86g，加30ml去离子水搅拌溶解，加醋酸2.855ml充分混匀，去离子水定容至50ml。

（2）1×TAEBuffer

取10ml50×TAEBuffer储备液加490ml的纯水，摇匀，待用。

3.配胶：

琼脂糖0.15g

缓冲液（1×TAE）15ml

加热煮沸3次

待温度降低到50˚Ϲ~60˚Ϲ时加入1滴核酸染液（GoldView）摇匀倒入槽内待胶凝固约30min。

4.拔出梳子，将凝胶放入水平电泳槽中，保证缓冲液没过梳孔。

5.上样：

（1）取3ul标准DNAMaker点入左边第一个梳孔，从左到右顺序点样。

（2）取一只塑料手套，将1ul6×Loadingbuffer点到手套上

（3）取3ulPCR产物与1ul6×Loadingbuffer即3:

1混匀点入梳孔。

6．盖上电泳槽盖子，恒压120V电泳，至溴酚蓝跑到胶的1/3处停止电泳（约20min），用凝胶成像系统进行采集观察，其浓度与DNAMaker比较，即亮度和长度。

7.如果与预测结果相同时，填写送出测序的单子，并联系北京华大基因有限公司，同时将至少40μlPCR产物放4˚Ϲ保存待测序公司来取样。

8.PCR产物送进行测序。

*注意事项：

核酸染液属于致癌物质，配胶以及与胶有关的仪器一定要戴胶皮手套操作

测序结果分析：

将测序结果掐头去尾后在NCBI（http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站上进行BLAST比对。

具体操作步骤如下：

可参照相似度95%以上为可信结果。

结合细菌形态学鉴定、革兰氏染色、16SrDNA比对结果初步判定该菌是属于哪个属，进行以下实验。

四、生理生化鉴定

选用API相关菌属鉴定试剂盒，具体类型参照以下：

（1）API20E鉴定革兰氏阴性杆菌

（2）APIListeria鉴定李斯特菌

（3）API20NE鉴定非肠道革兰氏阴性杆菌

（4）API20CAUX鉴定酵母菌

（5）API20A鉴定厌氧菌

（6）APICoryne鉴定棒状杆菌

（7）API50CHB鉴定芽孢杆菌

（8）APICampy鉴定弯曲菌

（9）APIStaph鉴定葡萄球菌和微球菌

（10）APIStrep鉴定链球菌

（11）API50CHL鉴定乳酸杆菌

（12）APINH鉴定奈瑟氏菌、嗜血杆菌、布兰汉球菌

检测方法：

（具体参考说明书）

1.试剂条的准备：

准备培养盒（盘和盖子），向盘的蜂窝状孔中倒入约5ml蒸馏水或去离子水，创一种潮湿的环境。

将菌株参考号记录在托盘的长条上，从各个包装中取出试剂条，将试剂条放入培养盒中。

2.接种物的准备：

用0.9%的生理盐水将培养板上的菌冲下收集（建议使用早期培养物18~24h），该菌悬液制备好后必须立即使用。

3.试剂条的接种：

将菌悬液接种到微型管中，只填充试管部分，杯型器不填充（微型管留少许不充满）。

将试剂条稍前倾，将吸管或滴管的顶部靠在杯的侧面，以免管的底部形成气泡。

4.用矿物油填充杯形器，形成凸出弯月面，以保证ADH和URE实验的无氧环境。

5.在36˚Ϲ下培养18~24h。

五、药敏实验

1.将平板上纯化出的菌用2~3ml0.9%灭菌生理盐水冲下，制成菌悬液。

2.无菌条件下取100μl菌悬液到培养基平板上。

根据培养基的干湿程度适当调整菌悬液的用量。

3.三角玻璃刀蘸酒精后，经过酒精灯高温灭菌，待火灭后温度降低至20˚Ϲ左右，均匀涂布

4.将药敏纸片贴到平板上，每个平板上可贴4个药敏纸片，常用水产药物：

诺氟沙星（氟哌酸）、头孢曲松（菌必治）、庆大霉素、奥复星（氧氟沙星）、头孢哌酮、强力霉素、四环素、卡那霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星、链霉素、吡哌酸、先锋霉素、氨苄西林、青霉素、利福平、多粘菌素、磺胺甲基异恶唑

5.28℃恒温培养24h后测量抑菌圈直径大小。

注意事项：

1贴药敏纸片时字朝里

2正置培养

例如：

配制培养基

例如：

NA固体培养基

（1）称取蛋白胨3.3g放入三角锥形瓶中。

（海水培养基加NaCl至终浓度为20‰）

（2）蒸馏水定容至100ml，并放入转子，用锡箔纸封口，记号笔标注时间名称。

（3）将三角锥形瓶放在磁力搅拌器上高温搅拌，待液体透明并大量气泡产生时迅速拿下（戴手套，防止烫伤），用吸铁吸出转子。

（4）将三角锥形瓶、装有平板的铁桶放入高压灭菌锅中，121℃灭菌15分钟。

（5）将灭好的培养基及铁桶迅速放到操作台中，紫外通风，待培养基温度不烫手时倒板（在酒精灯旁操作）。

（6）打开平板盖子，紫外线通风约30min，待凝固后盖上盖子，平板放4℃保存。

注意事项：

①操作台使用前喷酒精，用无菌棉擦干，紫外通风约30min。

②放入灭菌锅前装有平板的铁桶的排气孔处于打开状态，灭菌完应迅速关闭排气孔后放入操作台中。