木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表达载体的构建.docx
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木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表达载体的构建
木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表达载体的构建
【摘要】 目的克隆木薯醇腈酶cDNA构建表达载体,以实现木薯醇腈酶基因的高效表达。
方法运用RT-PCR从木薯幼叶组织中扩增出HNL全长cDNA序列,将其克隆至质粒pBluescriptSK中进行序列分析,再利用PCR将其再克隆到酵母表达质粒上。
结果经测序分析表明,克隆的cDNA片段和文献报道的4个木薯HNLcDNA相比,核苷酸同源性最高为%,氨基酸同源性最高为%。
结论经双酶切鉴定的结果表明重组表达载体的表达载体构建成功。
【关键词】木薯;醇腈酶;甲醇酵母;表达载体
Abstract:
ObjectiveTostudythecloningofthecDNAofα-HNLandtheexpressionvectorconstructiontorealizehighlyefficientexpressioninNL Thelong-lengthsequenceofcDNAofα-HNLwasamplifiedbyRT-PCR,thenitwasclonedintopBluescriptSKandanalylizdinits,thecDNAwasclonedintoanexpressionvector by ThesequencingresultofthecDNAshowedthatthesequenceencodedfortheHNLwasnotfullyconsistentwiththose fullsequencesanalysisdemonstratedthatthehighesthomologyofcDNAsequenceisabout%andthehighesthomologyofaminoacidsequenceisabout%tothosefourreportedHNLgenesfrom Degestiondetectionof showedthatconstructionofrecombinationexpressionvectorwassuccessful.
Keywords:
cavassa;Hydroxynitrilelyase;Pichiapastoris;expressionvector
手性化合物中不同立体异构体具有不同的生理活性,许多医用药品要求必须是单一性化合物,不仅药效可提高,更为重要的是副作用小。
因此,研究和开发手性药物具有广泛的市场需求。
醇腈酶作为一种生物催化剂,能可逆的催化由HCN和醛或酮生成手性氰醇[1,2],从而克服了由于光学拆分而造成的成本较高的缺点。
以工业生产扁桃腈为例,传统方法是以苯甲醛为原料,与无水HCN反应后得到dl-扁桃腈,再进行光学拆分成为单一化学物,而采用HNL作为该反应的催化剂,直接催化HCN添加到醛或酮上,形成相应的具有光学活性的氰醇,从而实现扁桃腈的不对称合成,大大降低了生产成本,反应生成的光学活性氰醇还可转化成羟基化合物、胺化合物、羧基化合物等多种重要的手性中间体[3],后者可进一步转化成多种手性药物。
现已证实3000多种植物体内含有HNL。
相关研究主要集中在木薯、三叶胶以及蔷薇科的几种植物中[4],来自蔷薇科植物的HNL可催化R-型氰醇化合物的合成;木薯、三叶胶中的HNL则立体专一性催化脂肪族、芳香族和杂环族S型羟腈化合物的合成[5]。
从自然界中直接获取S型醇腈酶不仅得率低,且纯化较难。
因此,采用基因工程技术获得大量HNL以满足工业生产的需求,具有十分重要的经济意义,并有助于HNL的基础研究。
通过RT-PCR方法从木薯幼叶组织的总RNA中扩增出一种HNL基因的cDNA序列。
序列分析表明,与DNA数据库公布的已有木薯HNL编码序列不完全一致。
将其克隆至表达质粒中,构建重组表达载体,为下一步在甲醇酵母中实现高效表达,深入研究其作用机理以及开展工业生产奠定了基础。
1材料和方法
材料
植物材料木薯采自中国海南琼海,取当天采集的新鲜木薯的幼嫩叶子提取RNA。
菌种和质粒表达质粒购自Invitrogen公司;大肠杆菌(JM109),质粒BluescriptSK(pBS)由本实验室保存。
酶和试剂RT-PCR试剂盒、RNA提取试剂盒、DNA连接试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司;抗生素G418购自Sigima公司;限制酶、TaqDNA聚合酶,其它抗生素等分别购自华美生物工程公司、Promega等公司;其他化学试剂均为国产分析纯或进口分析纯。
培养基LB,LA,SOB,SOC培养基均按Invitrogen公司操作手册推荐方法配制。
方法
基因操作质粒DNA的制备、限制酶切、连接反应、细菌转化、凝胶电泳、DNA片段的回收等,参照文献[6]或按供应商提供的相关说明操作。
木薯幼叶组织总RNA的提取取木薯新鲜幼叶,用液氮研磨3~4次,用RNA提取试剂盒提取总RNA。
RT-PCR扩增HNLcDNA根据Haughes[7]等报道的木薯醇腈酶cDNA序列设计RT-PCR引物,由上海基康生物有限公司合成。
其中上游引物设计EcoRⅠ酶切位点,下游引物引入BamHⅠ酶切位点,具体序列如下:
上游引物Hnl-1:
5′-cggaattcatggtaactg
cacattttg-3′
下游引物Hnl-2:
5′-gtggatcctcaagcatat
gcatcagcc-3′
RT-PCR则参照试剂盒说明书按以下方法进行:
50℃30min合成cDNA第一链后,直接加入试剂盒提供的专一性TaqDNApolymerase进行PCR反应,PCR参数为:
94℃预变性3min后,按94℃变性1min,57℃复性1min,72℃延伸1min,进行30个循环,然后于72℃再延伸10min。
DNA序列的测定用ABI377全自动测序仪测序。
表达载体的构建用质粒提取试剂盒分别提取约20μg重组质粒和表达质粒,分别经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切,并用连接酶连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,涂布在含有氨苄青霉素的LB平板,培养过夜。
2结果
木薯HNLcDNA的克隆及序列测定
从木薯幼叶组织提取总RNA为模板(图1),按材料和方法中所述条件进行反转录,再进行PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,检测到一条约kb的DNA片段,正好与预期的扩增片段相符。
Lane3:
18SRNAand28SRNARNAofcassavaleave
图1木薯幼叶组织总RNA的电泳
ElectrophoresisanalysisofRNAofcassavaleave
RT-PCR产物经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切,和经同样酶切处理的pBS连接,转入JM109,筛选重组质粒,通过酶切鉴定(图2),获得阳性克隆,命名为pBS-HNL。
对插入的片段进行DNA序列测定(图3)。
该cDNA序列实际长度为777个碱基,编码258个氨基酸,与来自木薯的醇腈酶Me-HNL10基因的cDNA序列相比[7],123,252,373,435,628,660,683位的碱基T,C,C,C,G,A,C分别被C,G,T,A,A,T,T所代替,导致125,210位的氨基酸leu,val变为phe,Ile;与程树华等报道的醇腈酶clonhnlcDNA序列[8]比较:
337,373,435,476,628,634,636,660,683位的碱基A,C,C,T,G,T,A,A,C分别被G,T,A,A,A,C,T,T,T所代替,导致113,125,158,210位的氨基酸:
Ser,leu,phe,val变为Gly,phe,Tyr,Ile。
Lane1:
λDNA/HindIIImarker;Lane2:
RT-PCRproduct
Lane3:
pBS/EcoRI;Lane4:
pBS-HNL/EcoRI+BamHI
图2电泳分析RT-PCR产物及限制酶切分析阳性克隆
ElectrophoresisanalysisofproductbyRT-PCRandanalysisofpositivecloningbyrestrictiveenzymetechnique
表达载体的构建
为了在甲醇酵母中表达木薯HNL,根据质粒限制酶分布位点的特点,设计如下引物
上游引物Hnl-35′-gcggatccatggtaactg
cac-3′
下游引物Hnl-45′-gcgaattcaagcatatgc
atc-3′
其中上游引物引入BamHⅠ酶切位点,下游引物加上EcoRⅠ位点,以质粒pBS-HNL为模板进行PCR扩增,得到两端分别含有BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位点的HNL片段,将其双酶切后与经同样处理的连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,涂布含有氨苄的LB平板,培养过夜,待长出单菌落后,挑取单菌落于液体LA中,培养16h,提取质粒DNA,琼脂糖凝胶电泳,选取增大的质粒DNA,为可能的重组子。
用限制性酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行酶切鉴定,酶切产生了的片断,与预期相符。
证明为所需的重组子,命名
1道:
经HindⅢ酶切的λDNA标准;2道:
无;
3道:
/BamHⅠ+EcoRⅠ;4道:
/BamHⅠ
图4酶切鉴定重组子
Regestiondetectionof
为,其构建流程见图5。
图5重组质粒的构建流程
ThecourseofConstructionofrecombinantplasmid 讨论
已有的研究结果表明,木薯基因组中含有多个HNL基因成员,已确定序列的有至少3个成员,包括mehnl10,mehnl14,mehnl24以及clonhnl。
将本研究获得的醇腈酶cDNA与已报道的,同源性较高的序列进行了序列比较,结果显示与Me-HNL10cDNA序列的同源性为%,氨基酸序列同源性为%,与colnhnlcDNA序列的同源性为%,氨基酸序列同源性为%。
但根据同源性比较结果,我们还不能确定本研究中克隆的HNL属于其中的哪一类成员。
甲醇酵母表达系统是一种较好的外源基因表达系统,它的蛋白质加工方式和高图3克隆的木薯HNLcDNA序列及推测的氨基酸序列
Nucleotideanddeducedaminoacidsequencesofα-hydroxynitrilelyasecDNAfromcassava阴影部分表示:
克隆到的木薯HNLcDNA序列与Me-HNL10cDNA相比,碱基对不同的部分;黑体部分表示:
与colnhnlcDNA相比,碱基对不同的部分.方框部分表示:
根据克隆的木薯HNLcDNA序列所推测的其氨基酸序列与Me-HNL10相比不同的部分;下划线表示:
与colnhnl相比不同的部分。
Shadow:
thedifferentpartofbasepairsComparedtoMe-HNL10cDNA;Black:
thedifferentpartofbasepairscomparedtocolnhnlcDNA;Pane:
thedifferentpartofdeducedaminoacidsequencescomparedtoMe-HNL10;Underline:
thedifferentpartofdeducedaminoacidsequences
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- 木薯 醇腈酶 cDNA 克隆 及其 表达 载体 构建