组织培育技术2.docx
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组织培育技术2
六、试述体细胞胚胎发生的实际应用。
(1)无性繁衍
(2)人工(合成)种子的制备
(3)分离可再生的原生质体的材料
(4)遗传转化
(5)代谢产物的合成
(6)遗传资源的保留
单细胞培育方式有平板培育法、看护培育法、微室培育法和条件培育基培育法。
五、试述细胞培育的应用。
1突变体选择
2植物次生代谢产物的生产(细胞的工厂化生产、高产细胞系的成立、“种子”培育、细胞的大量培育)
3生产天然的植物成份
4生物转化
5细胞固定化
二、简述花药培育的一样程序。
(1)取材:
一样而言,单核后期花药对培育反映较好。
(2)预处置:
适当的预处置能够显著提高花药的愈伤组织诱导率。
经常使用的预处置方式是低温冷藏,具体的处置温度和时刻长度因物种而异:
烟草7~9℃,7~14d;水稻7~10℃,10~15d;黑麦1~3℃,7~14d;大麦3~7℃,7~14d。
但低温预处置对小麦成效不稳固,有时还有负成效。
(3)消毒:
通常只要以70%酒精喷洒或擦拭花器或包被着麦穗的叶鞘表面,即可达到灭菌要求。
(4)接种(5)培育方式和培育条件:
培育方式:
花药的培育方式要紧有3种:
一是在琼脂固化培育基表面培育,二是在加入30%Ficoll(水溶性聚蔗糖)的液体培育基表面飘浮培育,三是利用固体一液体双层培育基培育,以便既能维持较高的接种密度,培育基又不易失水干枯。
培育条件:
要紧包括温度和光照。
(6)花粉植株的诱导
三、简述花粉分离与纯化的方式及花粉培育的方式。
将小孢子从花药里游离出来的要紧方式有
(1)自然散落法
(2)挤压法(①直接挤压法、②研磨过滤搜集法)
(3)机械游离法(①磁搅拌法、②小型搅拌(超速旋切)法)
纯化方式:
过筛、离心搜集、利用聚果糖等制成不持续梯度等方式。
花粉培育方式:
平板培育、液体培育、双层培育、看护培育、微室培育、条件培育基培育
四、阻碍雄核发育的因素有哪些?
1)基因型:
植物基因型是阻碍花药离体培育诱导单倍体成功的最重要的因素之一。
迄今为止,花药培育的成功要紧局限于3个科的植物—茄科、禾本科和十字花科。
2)植株生理状态和生长条件:
供体植株的年龄及其所处的生长条件(如光周期、光强、温度和矿质营养)也能阻碍花药对离体培育的反映。
一样来讲,幼年植株的花药反映能力较好。
在开花末季搜集的花药不但形成孢子体的频率很低,而且发生反映的时刻也较迟。
3)花粉发育时期:
花粉发育时期的选择对雄核发育也是相当重要的。
一样而言单核后期花药对培育反映较好,但不同物种最适的发育时期不同。
4)预处置:
接种前或后对花药采纳适当的方式进行预处置,能使绿苗产量大量增加。
在花药培育中采纳的预处置方式很多,有高低温、化学物质、离心、射线等方式。
5)培育基
6)药壁因子
7)培育条件:
培育条件如温度、光照、板植密度等对雄核发育也有必然的阻碍。
五、试述单倍体植株的鉴定方式及其染色体加倍的方式。
1)花粉和花药植株的倍性鉴定:
染色体直接计数法、间接鉴定(扫描细胞光度仪鉴定、细胞形态学鉴定法、植株形态学鉴定法、高/低温胁迫法、杂交鉴定法分为自交鉴定和测交鉴定、分子标记鉴定分为①生化标记鉴定②分子标记研究)
2)花粉和花药植株的染色体加倍
茎段培育:
单倍体愈伤组织培育进程中会有必然频率的核内有丝割裂(没有核割裂的染色体复制)及花粉核的融合,形成二倍体细胞,可成心识地利用这一特点来取得纯合的二倍体植株。
化学试剂诱变:
单倍体植物染色体加倍用得最多的是化学诱变法,经常使用的诱变剂有秋水仙素和Oryzalin(黄草消)、trifluralin(氟乐灵,一种除莠剂)、APM(amiprophosmethyl)等除草剂,其中秋水仙素应用最普遍。
二、简述离体授粉的程序。
①确信开花、花药开裂、授粉、花粉管进入胚珠和受精的时刻;②去雄后将花蕾套袋隔离;③制备无菌子房或胚珠;④制备无菌花粉;⑤胚珠(或子房)的试管内授粉。
三、什么是胚珠培育和子房培育?
简述胚珠培育和子房培育的技术措
概念:
①胚珠培育:
是将胚珠从母株上分离出来,在人工操纵的条件下,进行离体培育,使其生长发育形成幼苗的技术。
依照培育目的的不同,可将胚珠培育分为受精胚珠培育和未受精胚珠培育。
②子房培育:
是指将子房从母体上分离下来,置于培育基上,使其进一步发育成幼苗的技术。
依照培育的子房是不是授粉,可将子房培育分为授粉子房培育和未授粉子房培育。
技术方法:
①胚珠培育:
(1)材料的选择和灭菌.
(2)培育基:
多为White、Nitsch、MS等,Nitsch利用更普遍。
离体胚珠发育中,培育基的渗透压起着重要的作用,专门是对幼嫩的胚珠。
不同发育时期的胚珠对培育基的要求也不同。
(3)胎座和子房对胚珠培育的阻碍:
胎座或子房的某些组织在胚珠发育初期起着重要的作用。
(4)胚发育时期的阻碍:
合子和初期原胚期的胚珠较难剖取和培育,对培育基成份也要求严格。
培育发育到球形胚期的胚珠,较容易取得种子,对培育基的要求也不高。
②子房培育:
(1)子房外植体的制备.
(2)培育基:
用于子房培育的培育基有MS、White、B5、N6、Nitseh等。
另外,培育基的成份对子房的生长发育及成熟有专门大的阻碍。
(3)培育子房的发育.(4)阻碍子房培育的因素:
能够通过操纵培育基及激素条件调剂子房发育的方向。
五、离体胎座授粉技术有哪些方面的应用?
①克服自交不亲合性.②克服杂交不亲合性:
离体胎座授粉方式最重要的应用潜力,是在那些由于受精前不亲合性障碍从未形成过杂种的植物间成立杂种。
③通过孤雌生殖产生单倍体:
能通过未受精子房培育产生孤雌生殖单倍体的植物已知有大麦、烟草和小麦等。
④培育抗逆性植物.
一、什么是植物的胚胎培育?
什么是合子胚培育?
简述胚培育的方式和应用。
(1)植物胚胎培育:
是指对植物的胚、子房、胚珠和胚乳进行离体培育,使其发育成完整植株的技术。
(2)合子胚培育:
是指在无菌条件下分离和培育有性胚,以期取得可育植株的一种技术。
(3)方式:
成熟胚培育:
①培育基和培育条件:
培育基只需含无机盐和糖即可;提供适合的生长条件及打破休眠.②操作:
受精后的果实或种子(带种皮)表面消毒剥离种胚培育完整植株.幼胚(未成熟胚)培育:
①幼胚指的是尚未成熟即发育初期的胚。
在人工培育基上幼胚培育难成功,利用胚乳看护培育,可显著提高幼胚的成活率.可用同种胚乳,也可用异种胚乳.进行幼胚培育时,关键是维持胚性生长。
此途径为需要途径.②操作:
表面消毒(对受精后子房进行表面消毒)切开子房壁掏出胚珠剥离胚珠掏出完整幼胚培育完整植株.
(4)应用:
①通过“胚拯救"取得远缘杂种。
通过“胚拯救”即可克服这种受精后障碍,产生远缘杂种。
“胚拯救”的方式有3种:
一是杂种幼胚在人工培育基上培育,二是杂种幼胚的胚乳看护培育,三是杂种幼胚的愈伤组织培育。
其步骤是:
有性杂交杂种幼胚培育杂种愈伤组织形成愈伤组织增值茎芽分化植株再生。
②取得单倍体。
在远缘杂交以后,通过染色体的定向排除而产生单倍体,是胚培育的另一项新用途。
③打破种子休眠,缩短育种周期。
在有些情形下,园艺植物如落叶树的育种工作,会因种子休眠期太长而延误。
通过胚的离体培育,可使休眠期缩短。
许多植物的种子发育不完全或有抑制物存在而阻碍种胚发芽。
④提高种子萌生率。
长期营养繁衍的植物具有形成种子的能力,但其生活力较低,萌生成苗率低下,胚培育可增进这种种子萌生和形成幼苗。
⑤种子生活力的快速测定。
通过胚培育能够打破种子休眠,因此也能够利用这项技术进行种子生活力的快速测定。
三、植物超低温保留的概念是什么?
它的大体操作程序如何?
一、植物超低温种质保留的概念;指将植物的离体材料包括茎尖(芽)、分生组织、胚胎、花粉、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等,通过必然的方式处置后在超低温(一196℃液氮)条件下进行保留的方式。
二、大体操作程序;
一、简述单倍体在遗传研究和植物育种中的意义和单倍体取得的途
所谓单倍体,指的是具有配子染色体数的个体或细胞。
(一)意义:
(1)单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。
在诱导频率较高时,单倍体能在植株上较充分地显现重组的配子类型,可提供新的遗传资源和选择材料。
显著缩短了育种年限。
(二)途径1整体操作技术
①雌核发育。
通过阻止授粉途径(利用预先离子辐射处置的花粉或利用不亲和花粉),引发未受精卵细胞发育成单倍体植株。
②胚珠雄核发育。
由有雄核的卵细胞发育成单倍体植株。
在这种发育途径中,卵细胞核在受精前发生消失或失活。
③通过远缘杂交排除一个亲本的基因组。
这种情形出此刻属间和种间杂交中,在受精以后的发育进程中双亲之一的基因组被选择性排除。
于是,形成的胚只具有一亲本的基因组,由此发育形成的植株理所固然属于单倍体。
④半受精。
杂交进程中,卵细胞核与萌生花粉粒产生的精核不发生融合,各自独立地进行割裂,产生嵌合的单倍体植株。
⑤化学处置。
一些化学试剂如氯霉素和对氟苯丙氨酸,可能诱导体细胞或组织中的染色体丢失,产生单倍体。
用甲苯蓝、顺丁烯二酰肼、一氧化二氮和秋水仙素也可能产生类似的结果。
⑥高低温处置。
高低温处置,能够起到抑制配子融合,诱导单倍体的作用。
⑦辐射效应。
据报导,X射线或紫外线能诱导染色体断裂,致使亲本的染色体丢失,形成单倍体植株。
2花药、花粉的离体培育技术
花药和花粉培育都指在合成培育基上,改变花粉的发育途径,使其不形成配子,而像体细胞一样进行割裂、分化,最终发育成完整植株。
花药的离体培育进程中,花粉粒的命运会离开常轨,最终发育成一个单倍体的孢子体。
什么缘故会如此呢?
这涉及到花粉小孢子的发育途径。
五、试述单倍体植株的鉴定方式及其染色体加倍的方式。
1)花粉和花药植株的倍性鉴定:
染色体直接计数法、间接鉴定(扫描细胞光度仪鉴定、细胞形态学鉴定法、植株形态学鉴定法、高/低温胁迫法、杂交鉴定法分为自交鉴定和测交鉴定、分子标记鉴定分为①生化标记鉴定②分子标记研究)
2)花粉和花药植株的染色体加倍
茎段培育:
单倍体愈伤组织培育进程中会有必然频率的核内有丝割裂(没有核割裂的染色体复制)及花粉核的融合,形成二倍体细胞,可成心识地利用这一特点来取得纯合的二倍体植株。
化学试剂诱变:
单倍体植物染色体加倍用得最多的是化学诱变法,经常使用的诱变剂有秋水仙素和Oryzalin(黄草消)、trifluralin(氟乐灵,一种除莠剂)、APM(amiprophosmethyl)等除草剂,其中秋水仙素应用最普遍。
二、简述离体授粉的程序。
①确信开花、花药开裂、授粉、花粉管进入胚珠和受精的时刻;②去雄后将花蕾套袋隔离;③制备无菌子房或胚珠;④制备无菌花粉;⑤胚珠(或子房)的试管内授粉。
胚珠培育的意义为:
①通过受精前胚珠培育和未受精的胎座或子房培育,能够作为试管受精的基础;②利用胚珠培育技术,使杂种及早培育,避免杂种胚初期败育,取得杂种植株;③未受精的胚珠培育能和花药培育一样,诱导出大孢子或卵细胞增殖,形成单倍体植株,用于单倍体育种。
技术方法:
①胚珠培育:
(1)材料的选择和灭菌.
(2)培育基:
多为White、Nitsch、MS等,Nitsch利用更普遍。
离体胚珠发育中,培育基的渗透压起着重要的作用,专门是对幼嫩的胚珠。
不同发育时期的胚珠对培育基的要求也不同。
(3)胎座和子房对胚珠培育的阻碍:
胎座或子房的某些组织在胚珠发育初期起着重要的作用。
(4)胚发育时期的阻碍:
合子和初期原胚期的胚珠较难剖取和培育,对培育基成份也要求严格。
培育发育到球形胚期的胚珠,较容易取得种子,对培育基的要求也不高。
②子房培育:
(1)子房外植体的制备.
(2)培育基:
用于子房培育的培育基有MS、White、B5、N6、Nitseh等。
另外,培育基的成份对子房的生长发育及成熟有专门大的阻碍。
(3)培育子房的发育.(4)阻碍子房培育的因素:
能够通过操纵培育基及激素条件调剂子房发育的方向。
四、阻碍植物离体快繁的因素;
一、外植体;起始的外植体状况如外植体的来源、发育时期、大小及预处置等,是决定植株繁衍速度和再生植株质量的最重要因素。
具有拟分生组织的外植体如茎尖、带芽茎段等是最正确的植物快繁外植体,沿植物主轴,越近下部生理发育年龄越小,远离发育上的成熟,不易形成花器官,但易分化,再生能力强。
茎尖离体成活的临界大小应为携带1~2个叶原基,为0.2~0.3mm;叶片、花瓣等约为5mm2;茎段那么为0.5cm。
二、培育基;,依照培育的植物种类、组织或器官及培育目的的不同,设计不同培育基配方。
MS培育基是植物组织培育中应用最普遍的一种培育基。
这种培育基中的无机盐含量足以知足多种植物组织培育时期I和时期Ⅱ的营养需求。
蔗糖和葡萄糖是良好的碳源,其浓度为2%~4%,可知足时期I和时期Ⅱ的需求,时期Ⅲ所需糖浓度较低,为1%~3%。
植物生长调剂剂是完成时期I、时期Ⅱ和时期Ⅲ进程所必需的物质,其浓度的高低及其种类的配合决定着植物的快繁进程可否顺利进行。
不同的培育材料可选用不同物理状态的培育基。
3、培育条件;有光照、温度和湿度、培育瓶内的气体状况
4、继代培育;在时期Ⅱ中,应注意调整培育基激素浓度。
对生长速度快或繁衍系数高的植物,继代时刻应短,时期Ⅱ以培育细胞或愈伤组织方式继代增殖的植物,形态发生能力易随继代时刻延长而减弱或丧失。
五、移栽;试管苗出瓶移栽后致使其死亡的因素包括:
(1)根系结构不完善的试管苗移栽后,易造成死亡。
(2)叶表皮组织不发达或结构不正常的试管苗,移栽后也易造成死亡。
三、试述培育基选择的方式。
选择适合的培育基要紧从以下两个方面考虑:
一是大体培育基;二是各类激素的浓度及相对照例。
组织培育中对培育物阻碍最大的是外源激素,在大体培育基确信以后,实验中要大量进行的工作是用不同种类的激素进行浓度和各类激素间彼此比例的配合试
四、简述培育基配制的大体进程。
一、药品及用具的预备;
(1)MS培育基母液的配制
(2)用具、用品的预备
二、MS培育基配置步骤
(1)称量琼脂,假设适量蒸馏追,加热溶解
(2)加入规定用量的母液、蔗糖、生长调剂物质等
(3)调剂培育基的PH至5.8,加蒸馏水至所需体积
(4)培育基的分装
(5)培育基的灭菌
愈伤组织分为三种类型
(1)亢进割裂型,结构松脆,生长旺盛,色泽鲜艳,增值专门快
(2)保守割裂型:
结构致密,生长缓慢容易分化成苗
(3)衰败型:
结构疏松,生长缓慢,色泽暗淡
三、试述阻碍胚培育的因素。
(1)培育基。
①无机盐。
成熟胚培育中,要紧采纳一些较简单的培育基,如Tukey、Randolph、White等。
幼胚培育的培育基要紧有MS、B5、Nitsch、Rijven、White、Rangaswang、Norstog等。
未成熟胚的生长和存活之间并非存在相关性。
培育基中的NH4+关于大麦未成熟胚的正常生长和分化是必需的。
②碳水化合物和培育基的渗透压。
胚培育中蔗糖是最好的碳水化合物。
蔗糖不仅是作为一种能源,而且是为了维持适当的渗透压,后者关于未成熟胚的培育来讲尤其重要。
在长期的培育进程中,随着培育时问的增加,必需把胚转移到蔗糖水平慢慢降低的培育基中。
③氨基酸和维生素
在胚培育中加入氨基酸,不管是单一的仍是复合的,都能刺激胚的生长。
加单一氨基酸时,以谷氨酰胺最有效。
水解酪蛋白(CH)是一种氨基酸复合物,一直被普遍用于胚培育。
胚对水解酪蛋白的灵敏性因物种而异。
经常使用于胚培育的维生素类有硫胺素、吡哆醇、烟酸、泛酸钙等。
维生素对发育初期的幼胚培育是必需的,罢了萌生生长的胚,因其细胞能合成自身需要的维生素,维生素的加入可能对其形态发生有抑制作用。
④植物生长调剂剂。
除在某些植物中为了打破休眠之外,没有证听说明离体的成熟或未成熟胚的正常发育需要外源生长调剂物质。
生长素关于胚的生长通常表现抑制作用。
若是为了由胚和胚段诱导愈伤组织,那么通常都须在培育基中加入生长素或细胞割裂素,或二者都加。
⑤天然有机物。
加入一些天然的胚乳或种子提取物,对离体胚的生长有增进作用。
⑥培育基的pH。
培育基的pH对胚的培育也有必然的阻碍。
(2)培育条件:
①温度。
大多数植物胚培育的温度为25~30℃。
②光照。
一样以为在黑暗或弱光下培育幼胚比较适宜,光对胚胎发育有轻微的抑制作用。
(3)胚柄。
有研究指出在幼胚培育中,胚柄的存在对幼胚的存活是关键。
活体小孢子发育途径
一个花粉母细胞通过持续2次细胞分离(第一次减数割裂,第二次有丝割裂),形成4个子细胞,称为四分体,四分体分散成单核花粉粒。
在正常情形下,单核经第一次有丝割裂,产生一个大而疏松的营养核和一个小而致密的生殖核,称二核花粉粒。
第二次有丝割裂仅限于生殖核,形成两个精子,它们处在花粉或花粉管中(图6-1D),称为三核花粉粒。
最后花粉粒进一步膨大,花粉进入成熟期
离体小孢子发育途径
在离体培育条件下,花粉是产生花粉植株的原始细胞,咱们把花粉形成植株的途径称为“花粉孢子体发育途径”。
A.第一次有丝割裂为非均等割裂,形成一个营养核、一个生殖核
A-V.营养核重复割裂而生殖核败育
A-G.生殖核重复割裂而营养核败育
A-VG.生殖核和营养核一起割裂
C.营养核、生殖核别离或同时进行核内复制,有丝割裂后核融合别离形成二倍体、三倍体、四倍体胚
B.第一次有丝割裂为均等割裂,形成两个相似的营养型核,进而重复割裂形成单倍体胚或先核融合然后重复割裂形成多倍体胚
D.自然条件下小孢子的第二次割裂、淀粉粒及萌生形成的花粉管
二、阻碍体细胞胚胎发生的要紧因子有哪些?
关于体细胞胚胎发生专门重要的是培育基中的两种成份,即生长素和氮源。
(1)在培育基中添加生长素,通常对体细胞胚诱导是必不可缺少的。
(2)除生长素外,培育基中氮源的形态也会显著阻碍离体条件下的胚胎发生。
体细胞胚诱导和成熟需要大量氮素,一样为还原态氮如铵盐。
(3)其他因子:
在培育基中加入活性炭也能提高胡萝卜细胞胚胎发生的频率;某些组织释放挥发性和非挥发性物质到培育基中,能抑制愈伤组织中的体细胞胚胎发生。
乙醇是这些挥发性抑制物质中的一种,非挥发性抑制物包括IAA、ABA和GA3。
二、试述合子胚培育的操作流程。
合子胚培育的操作流程包括材料的选择与灭菌,胚的分离和胚的培育。
(1)材料的选择与灭菌:
幼胚培育:
对受精后子房进行表面消毒.成熟胚培育:
取成熟的果实或种子进行表面消毒.
(2)胚的分离:
成熟胚的剥离较容易。
幼胚的剥离:
表面消毒(对受精后子房进行表面消毒)切开子房壁掏出胚珠剥离胚珠掏出完整幼胚培育。
(3)胚的培育:
①成熟胚的培育:
只需提供适合的生长条件及打破休眠,即可在比较简单的培育基上萌生生长,形成幼苗。
故培育基只需含无机盐和糖即可。
②未成熟胚的培育:
在人工培育基上幼胚培育难成功,利用胚乳看护培育,可显著提高幼胚的成活率.可用同种胚乳,也可用异种胚乳。
四、离体授粉中阻碍结实的因子有哪些?
①外植体:
柱头和花柱的阻碍,胎座的阻碍,外植体的生理状态.由雌蕊上剥离胚珠的时刻关于离体授粉后的结实率有明显阻碍。
在剥离胚珠或雌蕊时,雌蕊的生理状态对离体授粉后的结实率也有阻碍。
在离体授粉中,能够把剥离胚珠的时刻选择在雌蕊授粉后和花粉管进入子房之前,从而增加离体授粉成功的机遇。
在进行柱头授粉的时候,应当幸免弄湿胚珠和柱头的表面,不然将会阻碍花粉萌生,致使花粉管破裂,造成结实不良。
②培育基:
培育基最重要的作用在于增进受精胚珠的正常发育。
经常使用于离体授粉的培育基为Nitsch、White、MS等。
培育基中蔗糖的浓度一样为4%~5%③培育条件:
在离体授粉中,培育物一样都是在黑暗或光照较弱的条件下培育的。
④基因型:
离体子房培育与结实之间的效应取决于植物的种类。
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