紫外光耐受性细菌筛选与鉴定建国科技大学.docx
- 文档编号:4041767
- 上传时间:2022-11-27
- 格式:DOCX
- 页数:9
- 大小:1.97MB
紫外光耐受性细菌筛选与鉴定建国科技大学.docx
《紫外光耐受性细菌筛选与鉴定建国科技大学.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《紫外光耐受性细菌筛选与鉴定建国科技大学.docx(9页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
紫外光耐受性细菌筛选与鉴定建国科技大学
紫外線輻射耐受型土壤細菌之篩選與鑑定
IsolationandIdentificationofanUltraviolet-Radiation-ToleranceBacteriumfromSoil
蕭蓉禎
Rong-JenShiau
建國科技大學美容系
DepartmentofBeautyScience,ChienkuoTechnologyUniversity
蕭蓉禎博士
建國科技大學美容系
彰化市介壽北路一號
Tel:
04-7111111ext.2628
Fax:
04-7111118
E-mail:
rjshiau@cc.ctu.edu.tw
摘要
紫外線輻射照射皮膚後,會造成皮膚老化、產生皺紋、以及黑色素沉澱等變化。
長時間暴露於紫外線輻射下,更會增加罹患皮膚癌的風險。
因此,防曬保養品成了保護皮膚對抗紫外線輻射的一種重要工具。
本研究的目的是篩選出對紫外線輻射具有耐受性的土壤菌株,用以研發新的抗紫外線輻射防曬商品。
在55個受測的土壤樣品中,有一個樣品含有紫外線輻射耐受性的菌群;接著,在此菌群中隨機挑選3個單一的菌落,培養後進行菌種鑑定。
經由比對其16SrRNA基因序列,發現這3個菌株均與假單胞桿菌屬的細菌非常相似(99%相似度)。
親源關係分析顯示此3個菌株與假單胞桿菌屬的螢光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens)分在同一群。
因而,將此具有紫外線輻射耐受性的菌株命名為Pseudomonassp.UVT8。
未來,可進一步探討Pseudomonassp.UVT8對抗紫外線輻射傷害的機制,並評估其作為新的防曬商品的潛力。
關鍵詞:
紫外線輻射耐受型細菌、親源關係、土壤、篩選
Abstract
Ultraviolet(UV)radiationcancauseskinaging,wrinkling,andpigmentation.ProlongedexposuretoUVradiationincreasestheriskofskincancer.Sunscreenproducts,therefore,havebecomeanimportanttoolforprotectionskindamageresultingfromexposuretoUVlight.TheaimofthisstudywastodiscoversoilbacteriawhichareresistanttoUV-dependentdamagesandcanbeusedfordevelopingnewsunscreenproductsagainstUVradiation.Oneoutof55soilsamplescontainedagroupofbacteriawhichhavetolerancetoUVradiation.Threerandomlyselectedisolatesfromthisgroupofbacteriaweresubjectedtospeciesidentification.Theresultsbasedon16SrRNAgenesequencesshowedthatallthreeisolatesaresimilartoPseudomonas(99%similarity).PhylogeneticanalysisdemonstratedthatthesethreeisolateswereclusteredwithPseudomonasfluorescens.Therefore,thisUV-radiation-tolerancebacteriumwasnamedasPseudomonassp.UVT8.ItisworthytofurtherinvestigatethemechanismofUV-radiation-toleranceofPseudomonassp.UVT8,andtoevaluatePseudomonassp.UVT8asanewpotentialsunscreenproduct.
Keywords:
ultraviolet-radiation-tolerancebacterium,phylogeny,soil,screening
壹、前言
輻射泛指具有能量的電磁波或高速粒子。
自然界的輻射來源有礦物、宇宙射線及太陽等。
在這些輻射來源中,太陽輻射對於維繫地球生態系統平衡,扮演著重要的角色(PaulandGwynn-Jones,2003)。
太陽輻射主要包含紫外線、可見光、以及紅外線等三種電磁波輻射(Diffey,2002),其中以紫外線對生物的影響較大。
紫外線,早期稱之爲紫外光(ultravioletlight),因為會使人誤以為是肉眼可見的光線,因此,近年來,科學家多將紫外線稱之爲紫外線輻射(ultravioletradiation)。
紫外線輻射波長範圍介於100-400nm之間。
國際光照委員會(InternationalCommissiononIllumination)依其對生物體的作用,將紫外線輻射進一步區分為UltravioletA(UVA)315-400nm、UltravioletB(UVB)280-315nm、以及UltravioletC(UVC)100-280nm(Diffey,2002)。
在電磁波的頻譜中,UVA是最接近可見光的紫外線輻射,UVA波長較長,且能量較低,具有高穿透力,能夠穿透水、空氣、玻璃、石英等物質,也能穿透人體皮膚表皮層,造成黑色素沉澱,此外,UVA也能夠激發螢光發物質產生螢光。
UVB屬於中波長的紫外線輻射線,UVB穿透介質的能力略低於UVA,UVB可穿透石英與空氣,但無法穿透玻璃。
雖然UVB的穿透力較低,但UVB所具有的能量高於UVA,因此,對自然界的生物危害較為嚴重。
UVC是波長最短、能量最高的一種紫外線輻射,但是UVC對介質的穿透能力卻是最弱的,太陽輻射中的UVC會被大氣層及臭氧層所吸收,因此,不會對地球生物造成傷害。
但由於UVC具有高能量的特性,因此,由人工光源(artificiallight)所產生的UVC,常被用做為物體表面殺菌及空氣消毒的工具。
細菌對於紫外線輻射所造成的傷害特別敏感,由於細菌體型小、缺乏細胞壁保護,紫外線輻射較易穿過細胞膜,進而破壞細胞質中的染色體。
UV-B對細菌染色體的傷害較為嚴重,主要是因為DNA會吸收低於320nm的光,(Boelenetal.2000,MitchellandKarentz,1993)形成cyclobutanepyrimidinedimmers(CPDs),CPDs會影響DNA複製的正確行性,造成基因突變。
此外,細菌屬於單套染色體生物,僅有少數功能重複的基因,因此,當染色體被紫外線輻射破壞時,受損的基因若無法立及修復,此時又沒有其它可替代的相似功能的基因,就會導致受輻射照射的細菌死亡(Garcia-Pichel,1994)。
除了造成DNA損傷外,紫外線也會使生物體產生自由基(ReactiveOxigenSpecies;ROS),ROS會造成脂質氧化,破壞蛋白質以及細胞膜,進而使細菌死亡。
目前研究指出,爲了減少傷害,細菌演化出高效率的DNA損壞修補機制,這些修補工作會在夜晚持續進行,有些細菌甚至在隔天日出前,即可將受損的DNA修復完成(Milleretal.1999)。
常見的修補機制有切除修復(excisionrepair)、容易出錯的修復反應(theerrorpronerepair(SOS)response)(Jagger1985,Hanawaltetal.1989,Friedbergetal.1995)、以及光反應(photoreactivation)(Godar,2005)等。
此外,有些細菌會製造具有光保護效果的化合物(photoprotectivecompounds)用以保護DNA避免紫外線輻射傷害,或是製造類胡蘿蔔素(carotenoids)等抗氧化物質用以清除體內的自由基。
因此,探討細菌如何避免紫外線輻射傷害,將有助於生物醫學以及美容醫學的發展。
由於分子生物技術學的進步,現今的微生物分類學者多藉由基因序列的差異,進行分類以及親源關係的研究。
其常用的基因是一種稱之為rRNA的基因序列。
rRNA普遍存在於微生物體內,親源關係相近的物種,其rRNA具有相似的基因序列,因此,可藉由分析其序列,將物種進行分類以及建構物種間的親源關係。
細菌rRNA可依其沉降係數分為5S、16S和23SrRNA,其中以16SrRNA使用最為廣泛。
16SrRNA同時具有高度保守的序列區域,以及高度變化的序列區域,其長度約1,540個核苷酸,易於選殖與序列分析。
利用聚合酶連鎖反應(polymerasechainreaction,PCR),可擴增16SrRNA基因的全長(或部份片段),選殖入適當載體後,藉由自動核酸定序儀,可在短時間內獲得基因序列,對於無法人工培養的微生物,也可以直接萃取其染色體DNA,進行PCR反應。
由於16SrRNA基因序列有極高的學術價值,近年來國內外學者皆將所得的基因序列,共同放在基因資料庫內(例如:
www.ncbi.nlm.nih.gov),提供研究學者查詢比對。
本研究的主要目的是篩選對紫外線輻射具有耐受性的細菌。
利用分離菌株的方式,從土壤中尋找出具紫外線輻射耐受能力的菌株,分析紫外線輻射對於菌株生長的影響。
再利用PCR增幅所篩選出的菌株之16SrRNA基因,以其DNA序列做為判斷細菌種類的依據。
本研究中所獲得的紫外線輻射耐受型細菌,可做為未來探討細菌對紫外線輻射耐受機制的基礎,以及評估發展防曬美容保養品的可行性。
貳、材料與方法
一、土壤樣本:
本研究的土壤樣品採集自臺灣本島之海邊、郊區、以及農村,共計55個樣區。
以鏟子直接挖取地表及深度約5~10公分處土壤,裝於夾鏈袋中,置放於4℃冰箱內保存。
二、紫外線輻射耐受型土壤細菌之篩選:
秤取2克的土壤樣品,加入2ml無菌水,搖晃均勻,靜置後,取100μl菌液塗抹在NA固態培養基上,NA固態培養基(nutrientagar)包含:
牛肉抽出物(beefextract)、蛋白質分解物(peptone)、以及瓊脂(agar)。
來自相同土壤樣品的菌液,分別塗抹在兩個固態培養基上,置於室溫下培養;將其中一個以紫外線燈照射,照射條件如下:
殺菌燈管為15WG15T8UVCgermicidallamp(SankyoDenke,Japan),培養皿至於殺菌燈管正下方,距離62公分,照射12小時。
另一個不予照射。
處理完成後,觀察培養基上是否有菌落產生。
再將這些培養基,置於室溫下再培養12小時後,觀察培養基上菌落生長狀態。
再次將經由紫外線燈照射後,長出的菌落,以滅菌過的牙籤點取至另一新的NA培養皿上,重復進行紫外線照射實驗。
觀察菌落生長情況。
三、菌種鑑定
挑選對紫外線輻射具有耐受性的單一菌落,接種於NA液態培養基中,進行隔夜培養。
將菌體離心沉澱後,去除培養液,利用Gene-SpinTM-V2GenomicDNAIsolationKit(Bio-Protech,Taiwan)抽取細菌染色體DNA,以抽取出的染色體DNA做為模板,利用BDAdvantageTM2PCREnzymeSystem(BDBiosciencs,USA.)進行PCR反應增幅16SrDNA。
使用的引子對為:
”AGAGTTTGATCCTGGCTCAG”與”GGCTACCTTGTTACGACTT“(Edwards,1989;Lane1991)。
PCR反應條件如下:
95℃反應1分鐘;接著進行35循環(95℃反應30秒;55°C反應1分鐘;68°C反應3分鐘)。
再將所獲得的PCR產物,委請源資生物科技公司進行DNA定序,所得的DNA序列再利用線上DNA資料庫(http:
//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行比對。
由比對結果推測相近菌種名稱。
四、親源關係分析
將所獲得的DNA序列以ClustalW程式進行alignement(Thompsonetal.1994),再以MEGA4.0軟體中的neighbor-joiningmethod(bootstraptest1000replicates)分析親源關析(SaitouandNei,1987;Tamuraetal.,2007)。
完成分析後,以樹狀圖呈現親源關係之遠近。
參、結果與討論
一、紫外線輻射耐受型土壤細菌之篩選
在本研究中,來自55個土壤樣品中的細菌,分別在室溫以及紫外線燈源下照射培養,經過12小時後,可觀察到絕大多數的培養基置於室溫時有許多菌落形成,而曝露於紫外線幅射下,則沒有菌落產生(圖一、B),除了編號T8的土壤樣品例外,在編號T8的土壤樣品中,經由紫外線幅射照射後的培養基上,有一些微小的菌落形成(圖一、D)。
進一步將那些照射處理後的培養基,置於在室溫下持續培養12小時後,可觀察到來自編號T8土壤樣品中的微小的菌落變大,而在其他的培養基上,依然沒有發現菌落。
這項結果顯示,經過紫外線幅射照射後,絕大多數的細菌均已死亡,而在編號T8的土壤樣品中的細菌,並沒有被殺死,只是生長受到抑制,待紫外線幅射光源移除後,即可恢復生長。
一般用於篩選抗紫外線輻射菌株的方式有兩種方式,一種是將細菌長在固態洋菜膠培養基的表面,另一種則是將樣品稀釋後進行液態培養,再接受紫外線輻射照射(Coohill1andSagripanti,2008)。
對生長在固態洋菜膠培養基的細菌而言,每一個細菌能均勻地接受紫外線輻射照射,這過程並沒有培養液的干擾,但若細菌往培養基內移動,就能避免紫外線輻射直接照射而存活。
因此,有些學者採用濾紙培養,防止細菌移動至培養基底部生長,但不同的材質的濾紙以及濾紙的潮濕程度,都會影響實驗結果(Gardneretal.,1998)。
液態培養的主要限制是培養液的光通透性差,可能會阻斷或吸收紫外線輻射,有些學者會在培養瓶內加入磁石進行攪拌(Morowitz,1950),這種方式雖然可使培養液中的細菌均勻地曝露於紫外線輻射之下,然而,培養液的紫外線輻射吸收性仍是決定實驗成功與否的主要因素(NicholsonandGaleano,2003)。
本研究中採用固態洋菜膠培養基的培養方式,在實驗過程中,我們發現培養皿的蓋子會遮斷紫外線輻射,進而影響實驗結果。
因此,為了避免培養皿蓋子或底部遮蔽紫外線輻射,我們在無菌操作台內,將培養皿蓋子移除,讓紫外線輻射直接由上方投射至生長在固態洋菜膠培養基表面的細菌,確保細菌能直接、均勻地接受紫外線輻射照射。
此外,在實驗結果中,並未觀察到生長至固態洋菜膠培養基內部深處的厭氧型細菌,以此可推知本實驗中所採用的樣品處理以及培養方式,應可適用於篩選對紫外線輻射具有抵抗性的土壤細菌。
二、紫外線輻射耐受型菌株之確認
為了再次確認在T8樣品中,經由紫外線燈管照射後仍能生長的菌株確實能抵抗紫外線輻射傷害,我們將同一個菌株分別點在兩個培養皿上,一個培養皿置於紫外線燈管下照射,另一個培養皿沒有接受照射。
培養12小時後,在接受照射的培養皿上,仍可觀察到菌落的形成,因此,可以確定紫外線輻射處理12小時無法殺死T8樣品中的細菌。
然而,我們亦注意到在沒有接受照射的培養皿上,長出的菌落明顯地大於暴露在紫外線輻射下的菌落(圖二)。
此實驗結果顯示,T8樣品中的菌株雖然不會被紫外線輻射殺死,但紫外線輻射確實會抑制T8樣品中的菌株的生長。
因此,嚴格地說,T8樣品中的菌株並不是抗紫外線輻射型菌株,而是紫外線輻射耐受型菌株。
上述實驗重複進行了三次,所得的結果皆相同。
為了確認T8樣品中的紫外線輻射耐受型菌株確實是來自T8樣品,而不是在實驗室中隨機污染所致,我們再次至T8樣品採集點附近重新進行採樣(圖三),按上述實驗步驟,對新的T8樣品(T8-S1~6)進行菌株分離及紫外線照射實驗。
結果顯示,除了T8-S6,在其他5個新的T8樣品中,皆有發現紫外線輻射耐受型菌株,此一結果,再次證實T8樣品採集點的土壤中,確實含有紫外線輻射耐受型菌株。
T8樣品採集點位於社頭鄉一戶農家的庭院,由於採集點的氣候環境因子並無特別之處,起初,我們並不知道為何這些紫外線輻射耐受型菌株,僅存在T8樣品採集點,後來進一步觀察採集點的植物相,發現之前的樣品採自一株未鑑定的植物根部附近土壤,因而,當重新進行採樣時,我們再次採集之前的植物根部附近土壤(T8-S1-5),以及一個距離植物根部較遠的土壤樣品(T8-S6)(圖三)。
如上所述,在T8-S1-5的土壤樣品中可再次分離到紫外線輻射耐受型菌株,而在T8-S6的土壤樣品並沒有紫外線輻射耐受型菌株。
此外,在植物葉片上,也未檢測到紫外線輻射耐受型菌株(資料未附)。
由此結果可推測,在田間的環境中,紫外線輻射耐受型菌株需生長在特定的植物根部附近的土壤內。
三、紫外線輻射耐受型菌株之鑑定
本研究的菌株鑑定是以比對16SrRNA基因序列的方式進行。
隨機挑選三個T8樣品中的紫外線輻射耐受型菌株,培養於LB液態培養基中,這三個株菌均能在LB中生長,因此,在培養24小時後,進行菌株的染色體DNA萃取。
再將萃取出的DNA作為模板,利用PCR增幅16SrRNA基因。
PCR的產物經由膠體電泳分離後,回收16SrRNA基因片段(約1.5kb),進行DNA定序。
三個菌株的定序都成功,去除掉定序結果中較不明確的鹼基序列,取900個鹼基,利用NCBI中的基因資料庫的BlastN程式,進行相似性比對。
結果顯示,這三個菌株的序列非常類似,且與假單胞桿菌屬的細菌的16SrRNA基因序列相似度(identity)高達99%。
因此,我將本研究中所分離的紫外線輻射耐受型菌株,命名為Pseudomonassp.UVT8-1、-2、3。
四、紫外線輻射耐受型菌株與其他菌株的親源關析
為了更清楚地了解Pseudomonassp.UVT8的分類地位,本研究利用親源關析分析軟體MEGA,進行親源關析樹的建製。
首先,選取完成全基因組定序(wholegenomesequence)的16株假單胞桿菌作為比對資料,同時也選取2株與假單胞桿菌屬親源關析相距較遠的大腸桿菌(Escherichiacoli)作為外群(outgroup)。
如圖四所示,大腸桿菌與假單胞桿菌可明顯地分成兩大群,本研究中所發現的Pseudomonassp.UVT8-1與螢光假單胞桿菌(PseudomonasfluorescensSBW25)分在一起;而Pseudomonassp.UVT8-2和Pseudomonassp.UVT8-3,則與螢光假單胞桿菌(PseudomonasfluorescensPf0-1)分在一起。
此一結果顯示,Pseudomonassp.UVT8與螢光假單胞桿菌非常相近。
前人研究指出,螢光假單胞桿菌存在土壤或植物表面,是一種好氧型的革蘭氏陰性菌。
螢光假單胞桿菌能產生包括抗生素在內的許多次級代謝物,能抑制部分在土壤中傳播的植物病原體(Compeauetal.,1988),保護並促進植物生長(Paulsenetal.,2005)。
本研究中所發現的紫外線輻射耐受型菌株Pseudomonassp.UVT8,其紫外線輻射的耐受機制,是否與菌體內的次級代謝物有關,值得進一步研究。
肆、結論
本研究主要是利用分離菌株的方式,尋找具有抗紫外線輻射能力的細菌。
經由多次試驗,篩選出一個紫外線輻射耐受型的菌株,命名為Pseudomonassp.UVT8。
目前,對Pseudomonassp.UVT8如何對抗紫外線傷害的保護機制仍然未知,未來將進行更深入的研究,並評估Pseudomonassp.UVT8(以及其代謝產物)應用於研發抗紫外線輻射的美容商品之可行性。
伍、致謝
感謝本實驗室的學生賴靜瑜、蕭庭荔、李素惠、楊伊婷、黃詠瑄、張瀞文以及國立彰化師範大學生物學系吳政育先生的協助,特此致謝。
陸、參考文獻
Boelen,P.,deBoer,M.K.,Kraay,G.W.,Veldhuis,M.J.W.,Buma,A.G.J.(2000)UV-BRinducedDNAdamageinnaturalmarinepicoplanktonassemblagesinthetropicalAtlanticOcean.Mar.Ecol.Prog.Ser.193:
1-9.
Compeau,G.,Al-Achi,B.J.,Platsouka,E.,andLevy,S.B.(1988)Survivalofrifampicin-resistantmutantsofPseudomonasfluorescensandPseudomonasputidainsoilsystems.Appl.Environ.Microbiol.54:
2432-2438.
Coohill,T.P.,Sagripanti,J.L.(2008)Overviewoftheinactivationby254nmultravioletradiationofbacteriawithparticularrelevancetobiodefense.Photochem.Photobiol.84:
1084-1090.
Diffey,B.L.(2002).Sourcesandmeasurementofultravioletradiation.Methods28:
4-13.
EdwardsU.,RogallT.,BlöckerH.,EmdeM.,BöttgerE.C.(1989)Isolationanddirectcompletenucleotidedeterminationofentiregenes.Characterizationofagenecodingfor16SribosomalRNA.Nucl.AcidsRes.17:
7843-7853.
Friedberg,E.C.,Walker,G.C.,Siede,W.(1995)DNArepairandmutagenesis.ASMPress,Washington,DC.
Gardner,D.W.M.,Shama,G.(1998)ThekineticsofBacillussubtilissporeinactivationonfilterpaperbyu.v.lightandu.v.lightincombinationwithhydrogenperoxide.J.Appl.Microbiol.84:
633-641.
Garcia-Pichel,F.(1994)Amodelforinternalself-shadinginplanktonicorganismsanditsimplications
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 紫外光 耐受 细菌 筛选 鉴定 建国 科技大学