ST6Gal1shRNAi对乳腺癌细胞粘附力及紫杉醇的敏感性调节作用研究.docx
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ST6Gal1shRNAi对乳腺癌细胞粘附力及紫杉醇的敏感性调节作用研究
ST6Gal1--shRNAi对乳腺癌细胞粘附力及紫杉醇的敏感性调节作用研究
温州医学院硕士学位论文
ST6Gall.shRNAi对乳腺癌细胞粘附力及紫杉醇的敏感性调节作用研究
目的:
1.考察ST6GAL1及在不同肿瘤细胞中的表达情况;
2.考察较低浓度紫杉醇持续刺激卵巢癌细胞OVCAR3对其ST6GAL1表达的影响:
3.考察利用sh.RNAi技术下调乳腺癌细胞ST6GAL1表达后,其细胞迁移能力、对ECM粘附能力和紫杉醇诱导的细胞凋亡等的变化,并探讨其内在的分子机制。
方法:
1、用荧光定量PCR技术检测不同肿瘤细胞的ST6GAL1的表达水平。
2、使用25nM和lOOnM的Paclitaxel持续刺激OVCAR3肿瘤细胞,在用药后的1,
7,14,21天后,用荧光定量PCR技术检测其ST6GAL1表达水平的变化。
用lOOnM的paclitaxel分别处理MDA-MB-435、Hela、PM8910等细胞24个小时
后,检测各组细胞的ST6GAL1mRNA的表达情况。
3、构建ST6GAL1基因的sh.RNAi干扰载体,利用Lipofectamine2000转染MDA-MB.435细胞。
4、用细胞损伤愈合实验检测转染后各组细胞的迁移能力。
待细胞密度大于95%时,用200¨1的枪头划板,检测转染后各组细胞在划板后24,48小时的愈合率。
‘
5、检测转染后各组细胞对collagenIV和fibronectin的粘附力。
6、检测转染后各组细胞对paclitaxel细胞毒性的敏感性。
7、检测转染后各组细胞对paclitaxel诱导细胞凋亡率的变化。
8、转染后各组细胞与ECM的粘附后,对paclitaxel细胞毒性的抵抗作用。
9、转染后各组细胞与ECM的粘附后对paclitaxel诱导细胞凋亡的抵抗作用。
10、通过考察各组细胞的ST6GAL1、k-ras、paxillin、p-paxillin、FAK、p-FAK的蛋
白水平的表达,初步探讨下调肿瘤细胞ST6GAL1表达对促进paclitaxel敏感性的分子机制。
结果
2
温州医学院硕士学位论文
1、MDA.MB一435的5T6GALlmRNA表达水平最高,而Hela和PM8910则居中;而OVCAR3细胞则最低,OVCAR3与其他各组细胞的ST6GAL1mRNA表达水平相比均有显著性的统计学差异(P 2、OVCAR3细胞的ST6GAL1mRNA表达水平与paclitaxel作用时间成正相关;与 未加药组相比,OVCAR3细胞的ST6GAL1mRNA表达水平被上调,而 MDA-MB-435、Hela、PM8910细胞的ST6GAL1mRNA表达水平均被下调。 3、sh.ST6GAL1细胞的ST6GAL1mRNA表达水平明显低于MDA-MB一435细胞(P MDA-MB.435细胞与Sc—Vector细胞相比,在ST6GAL1mRNA水平(P >0.05)和蛋白水平(P>0.os)均无统计学意义。 4、在24小时后,sh.ST6GAL1细胞的愈合率最低,且与MDA-MB-435细胞相比 有统计学意义(P<0.05),但与Sc—Vector细胞相比无统计学意义(P>0.os);在48小时后,sh.ST6GAL1细胞的愈合率明显低于MDA-MB-435细胞(P<0.01)和Sc-Vector细胞(P<0.05)。 . 5、ECM(collagenIV或fibronectin)浓度与细胞和ECM粘附力成正相关,而 sh.ST6GAL1细胞和ECM的粘附力最弱。 6、各组细胞的IC50值分别为: MDA-MB一435细胞(97nM)、Sc-Vector细胞(88nM)、 sh.ST6GAL1细胞(44nM),提示sh.ST6GALl细胞对紫杉醇更加敏感7、流式细胞仪定量各组细胞的凋亡率分别为: 对照组: MDA-MB-435细胞 (s.17%)、Sc-Vector细胞(6.41%)、sh.ST6GAL1细胞(7.02%);紫杉醇药物处理24h后,: MDA.MB435细胞(27.44%)、Sc-Vector细胞(30.700/o)、sh—ST6GAL1细胞(42.24%)。 经紫杉醇处理后,各组细胞的凋亡率均明显增加(vs自身对照),且在实验组中,sh-ST6GAL1细胞的凋亡率明显高于MDA-MB.435细胞(P<0.01)和Sc-Vector细胞(P<0.05),都具有统计学意义。 8、与无ECM粘附作用相比,在collagenIV粘附组,paclitaxel对sh—ST6GAL1细胞的细胞毒性下降了2S.65%,而在MDA.MB-435细胞和Sc-Vector细胞则分别下降了57.53%、56,56%,sh.ST6GAL1细胞细胞毒性下降差值明显低于MDA-MB.435细胞(P<0.001)和Sc-Vector细胞(P<0.001),具有统计学意义。 在fibronectin组,paclitaxel对sh.ST6GAL1细胞的细胞毒性差值下降了73。 34%,而在MDA—MB一435细胞和Sc.Vector细胞则分别下降了88.58%、 88.16%,sh—ST6GAL1.细胞下降的细胞毒性同样明显低于MDA.MB-435细胞(P <0.001)和Sc.Vector细胞(P<0.001),具有统计学意义。 9、与无ECM粘附相比,在collagenIV粘附组,paclitaxel诱导sh·ST6GAL1细胞 3 温州医学院硕士学位论文 的凋亡率下降了36.69%,而在MDA_MB一435细胞和Sc—Vector细胞则分别下降了51.86%、48.13%,sh.ST6GAL1细胞下降的凋亡率明显低于MDA-MB·435细胞(P<0.05)和Sc.Vector细胞(P<0.01),具有统计学意义。 在fibronectin组,paclitaxel诱导sh.ST6GAL1细胞的凋亡率下降了36.67%,而在MDA-MB.435细胞和Sc-Vector细胞则分别下降了50.60%、56.02%,sh-ST6GAL1细胞下降的凋亡率同样明显低于MDA-MB.435细胞(P 10、用紫杉醇处理后,各组细胞ST6GAL1的表达均有一定程度降低,在sh-ST6GAL 1处理组下降更为显著。 , 11、ST6Gall被shRNA沉默后,k-ras的表达亦随之下讽同时ST6下调后只发现在FAK和Paxillin的磷酸化水平发生了改变,而非磷酸化的FAK和Paxillin的表达则没有显著性变化。 结论 (1)较低浓度的paclitaxel能下调高表达ST6GAL1肿瘤细胞的ST6GAL1mRNA 的表达,而上调低表达ST6GAL1肿瘤细胞的ST6GAL1mRNA的表达。 肿瘤细胞与ECM的粘附可降低paclitaxel对乳腺癌细胞的杀伤作用。 (2)下调乳腺癌细胞ST6GAL1的表达后,可以抑制其细胞迁移的能力,降低 其与ECM的粘附力,促进paclitaxel的杀伤作用。 (3)Paclitaxel可下调乳腺癌细胞ST6GAL1mRNA水平和蛋白水平的表达。 另外,shRNAi联合Paclitaxel可显著抑制k-ras的表达,进而抑制FAK和Paxillin的活化而增强Paclitaxel对乳腺癌细胞的凋亡诱导作用。 关键词: RNAiST6GAL1紫杉醇细胞粘附细胞迁移细胞凋亡药物敏感性 4 温州医学院硕士学位论文 Effectofmediatingcell-ECMadhesionandsensitivityof breastcancercellstopaclitaxelbyST6GAL1-shRNAi 0bjectives 1.InvestigatingtheexpressionofST6GAL1inseveralkindsoftumorcells;2.InvestigatingtheexpressionofST6GAL1inOVCAR3tumorcellsunderlinedthe ;: onsistentlyexposingtolowerdosepaclitaxel;’ 3·AfterdownregulatingST6GAL1inbreast.ca.ncer“导。 e..1。 lsMDA-MB-4。 3,5,weinvestigatethechangesofcellularmigrationabIljty,,c譬_IkECM: adhesionand paclitaxel—inducedapoptosis,thenexplorethemechanismsinvolved. Methods 1.QuantifytheexpressionofST6GAL1inseveralkindsoftumorcellsbyreal—time PCR·; ConsistentlyexposingOVCAR3tumorcellsto25nM.andl。 OOnMpaclitaxel,andthenassaytheexpressionofST6GAL1byreal·timePCRinthedayof1,7J14and21.Ontheotherhand,wequantifythechangeofST6GAL1expressioninMDA-MB-435,HelaandPM8910tumorcellsaftertreatingwithlOOnMpaclitaxel for24hours. 、 ConstructionRNAirecombinedvectorofST6GAL1gene.andthentransfectingtherecombinedvectorintoMDA-MB-435tumorcellsbyLipofectamine2000.Woundhealingassayformigrationofthethreegroups“cells.Inbrief,whencells' densityisupto95%,microscopicobservationwasrecordedat0,24and48hoursafterscratchingthemonolayercellsbya2001.dpipettetip. 5.Detectingtheadhesionofthecell—CollagenIVorcell·Fibronectin. 6.Detectingthecytotoxicityofthethreegroups’cellsinducedbypaclitaxel. ● 7.Detectingthepaclitaxel-inducedapoptosisinthethreegroups’cells. 8.Aftertransfection,enhancingadhesionofcelI-ECMagainstcelIcytotoxicity inducedbypaclitaxel. 9.Aftertransfection,enhancingadhesionofcell-ECMagainstcellapoptosisinducedbypaclitaxel. 10.InvestigatingtheexpressionofST6GAL1,k-ras,paxillin,p-paxillin,FAKandp-FAK, 5 温州医学院硕士学位论文 andthenexplorethepotentialmechanismsinvolvedinsensitizingpaclitaxelto tumorcellsdown—regulatedtheexpressionofST6GAL1. Results 1.ThehighestexpressionmRNAlevelofST6GAL1isMDA—MB-435cell,HelaandPM8910cellsaremedian,andtheOVCAR3cellistheIowestone,andthedifferenceoftheexpressionmRNAIeveIofST6GAL1isstatisticallysignificantbetweenOVCAR3cellsandtheothercells《allP<0.05).: 2.Extendingthetimeofexposingtopaclitaxelresultsintheincreasingexpression 。 jrnRNAlevelofST6GAL1inoVcAR3cells.Aftertreatment。 vIf_|妣1—00删.paclitaxel.: for24hinHela.MDA-MB-435,PM8910andOVCAR3cells,comparedtountreatedgroup,theexpressionmRNAlevelofST6GAL1inOVCAR3cellsareincreasing,but theexpressionmRNAIeveIofST6GAL1inHela,MDA-MB-435.PM8910cellsare decreasing. 3.TheexpressionmRNAIeveIofST6GAL1insh—ST6GAL1isstatisticallysignificantlowerthantheMDA-MB-435cells"IP (P<0.oi}.NeithertheexpressionmRNAnorproteinIevelofST66AL1are observednostatisticallysignificantdifferencebetweentheMDA-MB-435cells (P>0.05)andtheSc·Vectorcells(P>O.os). 4.After24hours,thewoundhealingratioofsh·sT6GAL1cellswasthelowest,thereisastatisticallysignificantbetweenthesh··ST6GAL1cellsandMDA-MB··435 cell(P healingratioofsh-ST6GAL1cellsisstillthelowest,anditisstatisticallysignificantlowerthantheMDA—MB-435cells’(P 5.ThereisapositivecorrelationbetweentheconcentrationofECM(collagenIVorfibronectin)andtheadhesionofcell-ECM;otherwise,theadhesionofsh-ST6GAL1cellstoECMiStheweakest. 6.TheIC50valuesareasfollowing: MDA-MB-435cells(97nM),Sc-Vectorcells(88nM),andsh—ST6GAL1cells(44nM).Resultsshowsthatsh-ST6GAL1isthemostsensitivecelItopaclitaxelamongthethreecells. 7.QuantitiveapoptosisbyFASCisasfollowing: forthecontrolgroups,MDA-MB0435 6 温州医学院硕士学位论文 cells(5.17%),Sc—Vectorcells(6.41%),sh—ST6GAL1cells(7.02%kaftertreatingpaclitaxelfor24h,MDA-MB-435cells127.44%),Sc-Vectorcells(30.70%),sh—ST6GAL1cells(42.24%).Apoptosisratioofallgroupsarestatistically significantincreasewhencomparetoselfcontrolledgroups',otherwise,amongtheexperimentalgroups,Apoptosisratioofthesh·ST6GAL1cellsisstatisticallysignificanthigherthantheMD卢卜MBl435cells’(P 8.Comparedtothenon-ECMexperience,inthecollagenIVgroups,paclitaxel-inducedcytotoxicityratioofthesh—ST6GAL1cellsdecreaseby25.65%while57.53%ofMDA-MB.435cells;and56.56%ofSc-Vectorcells’;thedecrease ’ofpaclitaxel·inducedcytotoxicityratioofthesh·ST6GAL1cellsisstatistica'llVsignificantlowerthantheMDA-MB一435cells’(P 9.Comparedtothenon-ECMexperience,inthecollagenIVgroups,paclitaxel·inducedapoptosisratioofthesh·ST6GAL1cellsdecreaseby36.69%,while51.86%ofMDA-MB-435cells;and48.13%ofSc-Vectorcells’: thedecreaseofpaclitaxel·-inducedcytotoxicityratioofthesh·ST6GAL1cellsisstatisticallysignificantlowerthantheMDAoMB-435cells’(P<0.05)ortheSc-Vectorcells(P<0.0z).inthefibronectingroups,paclitaxel-inducedcytotoxicityratioofthe sh.ST6GAL1cellsdecreaseby36.67%.while50.60%ofMDA-MB-435cells;and56.02%ofSc—Vectorcells',thedecreaseofpaclitaxel-inducedcytotoxicityratioofthesh—ST6GAL1cellsisalsostatisticallysignificantlowerthantheMDA-MB-435cells’(P<0.01)ortheSc-VectorcellsIP<0.001). 10.AftertreatingwithlOOnMpaclitaxelfor24hours,theproteinexpressionlevelsofalIcellsdecreasetoadifferentextent,butstill,thesh-ST6GAL1istheIowest.11.decreaseintheproteinexpressionIevelsofk-rasisobservedwhentheST6GAL1 expressionwassilence,andthephosphorylationofFAKandpa
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