SiemensAdvia系列生化仪参数详细讲解.docx
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SiemensAdvia系列生化仪参数详细讲解
SiemensAdvia系列生化仪参数详解
本详解主要针对的是市场上常见的四种西门子机型:
ADVIA1200/1650/1800/2400。
大致分为五个章节:
简介、基本参数介绍、读点前移、前带监测、参数设置。
一、简介:
ADVIA1650是最早进入中国的拜耳生化仪,虽然师出日本,也是日本电子制造,但还是能看出拜耳的设计理念在里面。
后来拜耳被西门子收购,ADVIA生化也保留了下来。
ADVIA系列生化仪都是将ISE作为标配安装,ADVIA1200生化速度是800测试每小时,ISE400测试每小时;ADVIA1650和升级版1800的生化速度都是1200测试每小时,ADVIA2400的生化速度是1800测试每小时。
Advia系列的操作控制软件都大同小异,几乎没有什么本质上的变化,所以延续性较强。
加上西门子特有的流水线兼容性,使ADVIA系列的生命力变得异常顽强,在国内流水线市场里占据相当大的份额。
在ADVIA老版本的程序中,是支持四种试剂的,也就是R1、R2、R3和R4;但在后续版本中,四种试剂变为2种,只有R1和R2,这一点厂家并没有说明为什么。
所有的Advia系列,都是两个试剂盘,两个试剂针,反应盘是单盘,塑料反应杯,一根样本针。
除ADVIA1200外,都有一个稀释盘和稀释样本针,稀释样本针将原始样本加入到稀释样本盘中,按照最高可达1:
75的比例进行样本稀释,然后通过样本针将稀释后的样本转移到反应盘中。
同样,在反应盘上也可以进行最高1:
75的样本稀释,这样二者相乘,样本的稀释比例高达1:
5625。
稀释样本盘也是塑料杯,有自己单独的搅拌器、冲洗站。
ADVIA的试剂也可以进行稀释,所以节省试剂。
但由于设计理念的关系,其孵育介质有孵育油,也就是油浴。
3M生产的孵育油价格较贵,而且需要半年更换。
除常规的清洗剂外,反应杯空白比色也需要单独的活化剂,加上稀释样本或试剂用的生理盐水,总体下来ADVIA的耗材较多,而且总成本也不少。
所有的ADVIA系列都是R1+S+R2方式。
反应时间可选择:
3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、长程反应21分钟和31分钟。
ADVIA1200没有稀释样本盘,所以样本直接被转移到反应杯上。
加样速度4.5秒,读点13.5秒,R1+S后读第一点,10分钟反应读点42个,R2在19点前加入。
反应杯总数231个,反应体积为80-430ul,R1和R2加入体积范围在5-300ul之间。
反应时间可选择:
3分钟(最后读点14)、4分钟(最后读点18)、5分钟(最后读点21)、10分钟(最后读点42)、15分钟(最后读点63)、长程反应21分钟和31分钟。
ADVIA1650和1800加样速度为3秒,读点时间是6秒,R1+S后读第一点,10分钟反应读点98个,R2在49点前加入。
反应杯总数221个,反应体积为80-300ul,R1和R2加入体积范围在15-150ul之间。
ADVIA2400加样速度为2秒,读点时间是14秒,R1+S后读第一点,10分钟反应读点41个,R2在22点前加入。
反应杯总数340个,反应体积为60-180ul,R1和R2加入体积范围在10-100ul之间。
二、基本参数介绍:
主读点:
M.DET.Pm/n也就是MainDetectpoint的简写,m和n是主读点区的起止点,0 子读点: S.DET.Pp/r。 也就是subsidiaryDetectpoint的简写,p和r是子读点区的起止点,0 子读点是指需要读取反应空白的区域,一般指启动反应之前的试剂和样本空白,在双试剂中是指R2加入前的一组时间点。 读点: N,在终点法反应中,读点不小于三个,如果小于三个,系统自动前移满足三个。 在速率法当中,读点不能少于六个,如果小于六个,系统自动前移满足六个。 根据反应方法,子读点可以选择也可以不选择。 u/d和U/D旗标: U和u表示上限,D和d表示下限,当超过小写u/d范围时,用大写U/D显示。 空白: Blank(u/dU/D),这里指的是试剂空白的上下限。 就是以去离子水为样本的检测,主要用来监测试剂性能,是以主读点区主波长的吸光度值为基准的,当试剂的空白吸光度超过u/d上下限范围,就会用U/D显示出来,提醒操作人员注意试剂问题。 试剂空白是可以选择是否进行监测的。 Blanku/d的定义是,在下降速率当中,Blanku也就是空白上限为2ABS,Blankd为主读点吸光度的50%;在上升速率当中,Blanku也就是空白上限为最高主读点吸光度的150%,Blankd为主读点吸光度的50%。 图1Blanku/U/d/D示意图 修正点: E2。 E2表示试剂和样本加入后的几个点的吸光度值,用来进行LIH(乳糜、黄疸、溶血等标本)或底物耗尽的监测。 E2都将监测试剂空白以及样本加试剂的结果,也就是说E2=样本+R1的E2吸光度减去试剂空白的E2吸光度。 读点前移: Point-Forwarding。 在速率法中,高浓度样本往往很快消耗完反应物,而底物却大量存在,速率反应很快停止。 当系统监测到这种情况时,会自动将主读点前移至发生速率反应的区域。 在使用读点前移的技术时,需要增加一个主读点M.DET.Pl,l 如果m和n主读点被监测到发生底物耗尽,那么自动前移读取l和m之间的读点。 图2读点前移示意图 图2所示中,m和n点之间出现底物耗尽现象,由于设置了l点,所以自动将读点移至l和m之间读取。 同样,l和m以及m和n之间要多于6个读点。 如果判断底物耗尽,就要借助样本吸光度限制这个概念。 样本吸光度限制: Sampleu/d。 Sampleu或d只能选择一个,这是根据反应方向的不同而设定的,下降速率反应将只有Sampled,上升速率反应将只有Sampleu。 其要求监测R2加入之前和之后的数个读点的吸光度值,依然是主波长的吸光度值。 R2加入之前的监测点就是我们前面说的E2,R2加入之后的监测点是主读点区的最后两个点,叫做选择点。 E2和选择点进行计算: Sampleu/d=选择点的吸光度-(E2*K) 其中: E2=样本和R1的E2点吸光度值–试剂空白的E2点吸光度值 K=(R1+S)/(R1+S+R2)是体积系数。 当E2用于底物耗尽探测时,读点自动选取第7点,这样会避开LIH因素干扰。 判断依据,在下降速率反应中,当Sampled大于选择点吸光度时,认为是底物耗尽;在上升速率反应中,当Sampleu小于选择点吸光度时,认为是底物耗尽。 图3底物耗尽示意图 图3的所示中,Sampled大于主读点区m和n最后两点的吸光度值,所以判断为底物耗尽,自动将读点前移到l和m点。 这里有一个问题,如果m点也处于底物耗尽的区域怎么办? 前移的结果也会不准确。 所以ADVIA的读点前移技术并不是那么可靠,为了保证可靠,其采用了非常复杂的计算方式,目的只有一个,规避东芝的弹性速率法。 这里简单的介绍一下弹性速率法。 其原理是监测速率反应的主读点区,并根据设置的吸光度差值进行没两个相邻读点的吸光度差,当实际读取的吸光度差值小于设定的吸光度差值时,就会判断为底物耗尽。 而底物耗尽判断后自动将读点前移至预先设置的两个点的区域,这样可以充分避开ADVIA中的如果m点也在底物耗尽区域的可能。 读点前移不在这里做详细介绍,后面有单独的章节。 反应方法: 有五个选择,EPA、RRA、2PA、CRA和IMA; EPA反应方法: 就是常说的终点法,可以是一点终点法,也可以是两点终点法。 一点终点法时,子读点p和r无效,填为0;两点终点法时,子读点p和r要填写,而且要在R2加入之前。 终点法读点要求至少三个点,不足三个点时,系统自动前移补足。 图4EPA终点法示意图 RRA反应方法: 也就是常说的速率法,可以是单速率法,也可以是双速率法。 采用单速率法时,读取主读点区的m和n的区域进行每分钟速率计算。 采用双速率法时,还要读取R2加入之前的子读点区p和r的区域进行每分钟速率计算,然后主读点和子读点相减再进行浓度计算。 使用速率法时,系统将自动进行E2吸光度计算。 但在参数设置,可以选择是否选择E2corre,也就是是否选择E2修正。 用DO或NotDo选择。 在速率法当中,Blanku/d必须输入,并且可以选择在R2加入前一点插入检查点CHECKD.P.I,此检查点将于试剂空白数据进行比较,借以判断试剂是否有问题。 但此法仅在下降速率法和IMA方法中使用。 如果不使用,则填写0。 当然,在速率法当中,也可以选择底物耗尽监测而增加的主读点M.DET.P.l。 图5RRA速率法示意图 2PA反应方法: 也就是常说的两点速率法。 也是速率法的变种,区别在于不进行主读点间的两个点的线性监测。 其余与速率法完全一样。 图62PA两点法示意图 CRA反应方法: 官方说法为随着时间的变化反应接近恒定,曲线由最小二乘法拟合,也有称为固定点法。 大致意思是选择读点区的两个点进行吸光度值得最小二乘法计算。 是根据时间和吸光度的数值进行计算的,无论是速率法还是终点法均可采用。 当子读点被采用时,p=r≠0,或p≠0,r=0时,是速率法,速率计算是根据两点间曲线的正切线;当p 当不采用子读点时,为终点法,采用最大时间吸光度和空白吸光度进行计算。 说实话,真不知道这个方法是做什么项目的,中文没有解释,英文的解释很少,也没发现实例。 图7CRP固定点法示意图 IMA反应方法: 也就是免疫比浊法。 是采用最小二乘法计算的速率法。 对于R1的加入量太少,无法进行E2计算时,这个方法就变得有用了。 也就是说,在很多免疫比浊项目里,R1的加入量往往小于R2的量,所以引发了一系列的计算和判别上的困难,IMA就是为了解决这个难题的。 样本和第一试剂加入量太少,就无法进行E2的计算,没有E2就无法进行前带监测和底物耗尽的监测,所以在IMA方法中R2之后插入监测点CheckD.P.I,用于弥补R1和S的不足。 采用IMA方法设置检查点后,系统自动计算limitvalues值(设备默认0.003),此法对浑浊样本的处理很有成效,所以用在免疫比浊项目上。 图8IMA免疫比浊法示意图 图9IMA应用示意图 IMA的其它使用方法与速率法一样,仅限于R1+S低于反应杯最小容量的测试项目里。 如果不存在这样的项目,那么即便是免疫比浊项目,也应该采用常规速率法或终点法。 定标方法: 因数定标、线性定标和非线性定标; 在参数界面里的Calcmthd,也就是计算方式里,有ABS和STD/MSTD选择,表示吸光度和单点定标/多点定标计算。 在ADVIA的所有机型里,定标中的零浓度点用试剂空白替代,所以在定标之前要做试剂空白,如果不做试剂空白,仪器会认为试剂空白就是原点。 注意这个差别,与奥林巴斯的不同。 奥林巴斯的试剂空白和零浓度校准点是两个概念,而在adiva里合二为一。 参数界面里的Formula,也就是公式才是选择定标方法的地方。 因数定标: 如果在Calcmthd里选择ABS,那就意味着你要采用因数定标,那么在Formula里只有一个可以选择,那就是Linear,因数定标只能用于线性定标。 因数定标也就是直线方程里的Y=KX+B中的K,所以也叫K值定标法。 而B的确定则需要试剂空白,所以因数定标法必须做试剂空白,然后结合给出的K值进行定标曲线的绘制,然后依据这个曲线进行浓度计算。 在Advia中,K值的给出是在参数界面的Standardssetting中的FV中。 线性定标: 线性定标需要两个点才能决定一条直线,我们一般给出一个零浓度点,一个带有浓度的标准点,这样仪器就会自动进行计算。 而Advia中零浓度点在试剂空白里给出了,所以对于两点线性定标来说,只需要在给出一个校准点就可以了。 所以在Advia的手册里,线性定标叫做一点线性。 而且Advia的所有校准点,无论是线性还是非线性,零浓度点都不计算在内,只数带有浓度的校准点,比如5点定标,加上零浓度点其实就是6点;而6点定标,加上零浓度点就是7点。 不过,要指出的是,Advia的试剂空白并不是强制性的,这一点与奥林巴斯不同。 不进行试剂空白检查的项目,默认试剂空白也就是零浓度点的值是通过原点的。 下面给出两张图,一张做过试剂空白的线性定标,一张是没有做过试剂空白的线性定标。 图10没有做试剂空白的线性定标 由于假设所有没有做过试剂空白的线性定标的零浓度点都通过原点,所以图中的蓝线则是默认的校准曲线,但实际上并非如此。 如果提前没有做试剂空白,仪器也会自动做上,这样就会出现两个点,图中的两个红点就是。 左下角是零浓度点,右上角是标准店。 但蓝色的定标曲线却是右上角的红点和原点的连接,而不是与零浓度点连接。 这样的结果我们都知道会有错误,因为真正计算的是按照蓝色直线计算,而红色的我自己画上去的示意线条才是真正的计算直线。 要解决这个问题,只有重测试剂空白重新执行定标才行。 下图是做过试剂空白的线性定标图例 图11做过试剂空白的线性定标示意图 而在statisticalData里的FV就不是因数了,而是定标点的浓度。 上面两张图很清楚的告诉我们,一点线性定标,有一个Blank试剂空白,FV为0.00,而STD值只有一个,就是标准点的值。 图12Advia一点线性定标示意图 在线性定标中也有多点定标,例如同工酶法。 在Advia中,线性多点定标多是用来拟合一元三 (二)次直线方程。 对此有三种方法,由于很少使用,所以仅仅图示,不做解释。 图13无变换一元三次直线方程定标 图14对数线性变换的一元三次线性方程定标 图15对数变换的一元三次线性方程定标 同时,Advia还提供一元二次线性方程定标。 非线性定标: Advia的非线性定标有Logit-Log1、Logit-Log2、Logit-Log3和Spline样条曲线、Iinegraph折线五种。 图16Logit-Log1非线性定标示意图 图17Logit-Log2非线性定标示意图 图18Logit-Log3非线性定标示意图 图19Iinegraph折线非定标曲线示意图 图20Spline样条非定标曲线示意图 在多点定标中,由于试剂随着使用时间的推移性能会发生改变,其中包括颜色的改变。 所以每天开机画面中会提供简单定标(Simplifiedcalibration)这个选项,原理是根据前后试剂空白修正整条定标曲线。 图21Simplifiedcalibration简单定标示意图 在图11中,左侧是定标细则的选项,其中,Calc.mthd表示计算方法,有ABS(因数法)、1-Point(1点定标)和Multi-Point(多点定标)三个选项; 在AxisConv.轴线变换中,有NoConv.(不变换)、Log.-Linear(对数线性)和Log.-Log.(对数)三种选择; 在MultipointFormula(多点公式)中,有Linear(线性定标)、quadratic(一元二次直线方程定标)、Cubic(一元三次直线方程定标)、Spline(样条曲线)、LineGraph(折线)、Logit-Log1、Logit-Log2和Logit-Log3等8种方式; 在#calStds里,要填写包括试剂空白在内的校准点数量。 图22多点非线性定标示意图 从图中我们看到,四个校准品的数值成梯度倍比关系,但无法做出满意的样条曲线,是否需要改为对数曲线还需要观察。 图23原厂试剂多点非线性定标示意图 这是原厂的IgM定标曲线,没有做试剂空白。 定标浓度并非梯度倍比稀释,但只有这样才能保证Logit-Log3曲线的完美。 好像国外很少使用样条曲线定标。 而这个项目恰恰是样条曲线。 如果用最高浓度倍比梯度稀释,就会得到一幅漂亮的样条曲线。 三、读点前移: 前面说过,Advia的读点前移技术是为了应对底物耗尽的速率反应,采用样本吸光度限制Sampleu/d和试剂空白限制Blanku/d来进行计算和判断。 要知道是,底物耗尽有时并不是因为样本的浓度或活性太高导致的,试剂污染或失效也有可能。 所以读点前移技术和底物耗尽判断,从另一个方面讲,也是对试剂性能的一个监测。 由于底物耗尽仅仅存在于速率法的反应当中,所以这里描述的均为速率法。 下面两张图就是超过Sampleu/d限制后的底物耗尽图例: 图24间接或相反反应超过Sampled限制的底物耗尽反应图示 图25直接反应超过Sampleu限制的底物耗尽反应图示 注意图25中27点出现的拐点,这已经是不明显的底物耗尽的表现。 样本吸光度限制和试剂空白的配合使用,加上检查点checkD.P.I的介入,可以很容易的判断试剂性能。 下图是极端情况下的试剂空白限制的图例 图26试剂空白图例 通过试剂空白计算出来的Blanku/d值与样本测试时主读点区主波长吸光度值进行比较,如果超出这个范围将会用U/D来标示结果,以提示操作人员该结果不可靠。 检查点checkD.P.I的选择一般在R2也就是启动反应物加入之前或之后的一个点,而E2的吸光度计算点则选择在6、7、8这三个读点上。 注意这仅仅是用来监测底物耗尽的,如果用E2来监测LIH样本,则读点应该在2、3、4、5这些地方。 在直接反应中,也就是单试剂项目里: 当checkD.P.I的主波长吸光度值大于Blanku的值时,结果用u标示; 当checkD.P.I的主波长吸光度值小于Blankd的值时,结果用D标示; 在间接反应中,也就是双试剂项目里: 当checkD.P.I的主波长吸光度值大于Blanku的值时,结果用U标示; 当checkD.P.I的主波长吸光度值小于Blankd的值时,结果用d标示; 这就是结果里“U/u/D/d”这四种旗标的来历。 下面举例说明读点前移技术的使用: 图27读点前移举例1 图27中的三个曲线: 红色是试剂空白,蓝色是正常样本曲线,绿色是异常样本曲线。 图中有两天竖线,一个E2,一个是checkD.P.I,那么根据图示可以得到以下数据: E2吸光度值试剂空白修正E2(E2-试剂空白) 试剂空白0.10- 正常样本0.500.40 异常样本0.600.50 那么经过体积修正过的E2是要计算修正系数的,而修正系数=(R1+S)/(R1+S+R2)。 这里假设R1是80,S是16,R2也是16,这样修正系数就是0.875。 那么经过体积修正过的正常样本E2就是0.343,异常样本E2就是0.429。 同时我们也知道,CheckD.P.I在R2之后,其正常样本为0.55,异常样本为1.00。 那么体积修正过的CheckD.P.I-E2的值是: 正常样本是0.207,异常样本是0.571。 根据试剂空白的原则,Blanku应该是0.40,Blankd应该是0.05。 那么我们用CheckD.P.I和E2的差值与Blanku值的0.40进行比较,正常样本的差值0.207小于Blanku值的0.40,而异常样本的差值0.571大于Blanku值的0.40,又是间接反应,所以结果报告U。 图28读点前移举例2 图28的例子里,红色为试剂空白,绿色为异常标本2,蓝色为异常标本1。 很明显,异常标本1是典型的底物耗尽反应,而异常标本2貌似没有问题,但R2加入之前就过高了。 E2吸光度值试剂空白修正E2(E2-试剂空白) 试剂空白-0.0041- 正常样本2.61192.6160 异常样本1.71541.7195 经过体积修正后的E2分别是: 异常样本1为2.242,异常样本2为1.474; CheckD.P.I值为: 异常样本1为2.4665,异常样本2为1.4670; E2和CheckD.P.I的差值为: 异常样本为0.224,异常样本2为-0.007; Blanku值设为0.20,Blankd值设置为0.01。 异常样本1的差值0.224大于Blanku的0.20,又是间接反应,所以结果报告U; 异常样本2的差值-0.007,小于Blankd的0.01,又是间接反应,所以结果报告d。 这是两个利用试剂空白限制和E2以及CheckD.P.I检查点进行底物耗尽判断的例子。 在这两个例子中,试剂空白放的很宽,并不是严格按照150%和50%最高最低计算公式计算的,但即便是这样,例子中还是判断为底物耗尽。 而在参数设置里,Blanku/d往往被设置成±9.9999,这也就意味着不进行底物耗尽判断和试剂空白判断,那么CheckD.P.I和M.DET.P.l的设置也就变得毫无意义了。 样本吸光度限制Sampleu/d在底物耗尽中的用途呢? 其与试剂空白Blanku/d可以同时,也可以单独使用,监测底物耗尽依然有一定的作用。 图29样本吸光度限制Sampleu/d在底物耗尽判断中的示意图 图29的上图是选择点吸光度值大于Sampleu,下图是选择点吸光度值小于Sampled,所以都被判断为底物耗尽。 下面举例说明计算方法: 图30Sampleu/d判断底物耗尽的例子 图中红色为试剂空白,蓝色为异常样本。 试剂空白的E2为-0.004,样本的E2为0.6127; Sampleu/d=1.25-[0.6127-(-0.004)]*{[16(S)+80(R1)]/[16(S)+80(R1)+16(R2)]}=0.7215; 经过修正后的曲线就是蓝色虚线部分,那么主读点区的最后两个点的吸光度也就是选择点的吸光度值只有0.250,远远小于Sampled的0.7215(图中放宽到0.750),所以判定为底物耗尽。 (下降反应是Sampled,上升反应是Sampleu)。 判断底物耗尽后,就需要读点前移。 而采用读点前移,还需要一个M.DET.P.l读点。 图31读点前移的各种可能图示 在这个图示中,主读点M.DET.P.m和M.DET.P.n之间出现底物耗尽现象,读点前移就是读取M.DET.P.l和M.DET.P.m之间的吸光度速率。 图中给出的M.DET.P.m正好在拐点上,这种可能性太小了。 红色箭头才是更多的M.DET.P.m可能性之一。 当然最理想的状况是左侧的红色箭头,如果是右侧的红色箭头,即便是读点前移也毫无意义。 由此可知,Advia的读点前移技术相当的复杂,并不是那么容易掌握,而且在前移点的选择上也很令人抓狂,远不如东芝的弹性速率法简单。 不过,利用这种技术不仅可以判断试剂问题,也可以判断反应过程中的问题,还是很有帮助的。 我们要清醒的知道,利用读点前移技术,必须进行试剂空白检测,并且计算出Blanku/d和Sampleu/d,还要知道检查点CheckD.P.I的设置和前移点M.DET.P.l的设置,否则无法使用这一技术。 四、前带监测: Prozone前带监测功能是几乎所有生化仪都拥有的,Advia系列也不例外。 更何况Advia强调免疫比浊功能,所以前带监测的设置与IMA的设置在一起,同在参数界面的一个区域里。 图32前带监测界面示意图 前带现象可能会导致实际结果偏低,这与底物耗尽类似,但在曲线上,而且截然不同。 在前带监测选择里,前带计算公式可以选择前带公式(用于终点法项目),也可以选择速率公式(用于速率法项目)。 无论选择什么公式,ProzoneLimit前带范围都要输入,这也是前带发生反应的实际吸光度值,超过这个值就会判定是前带反应。 Prozonejudge是前带的反应方
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