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第十三章基因工程菌的发酵
第十三章基因工程菌的发酵
最近几年来,重组DNA技术(基因工程)已开始由实验室走向工业生产,走向有效。
它不仅为咱们提供了一种极为有效的菌种改良技术和手腕,也为攻克医学上的疑难杂症——癌、遗传病及艾滋病的深切研究和最后的治愈提供了可能;为农业的第三次革命提供了基础;为深切探讨生命的隐秘提供了有力的手腕。
此刻由工程菌产生的珍稀药物,如胰岛素、干扰素、人一辈子长激素、乙肝表面抗原等等部已前后面市,基因工程不仅保证了这些药物的来源,而且可使本钱大大下降。
可是从许多研究中发觉,工程菌在保留进程中及发酵生产进程中表现出不稳固性,因此工程菌不稳固性的解决已日趋受到重视并成为基因工程这一高技术成绩转化为生产力的关键之一。
第一节工程菌的来源和应用
一、何谓基因工程
基因工程(geneticengineering)是指在基因水平上,采纳与工程设计十分类似的方式,依照人们的意愿,主若是在体外进行基因切割、拼接和从头组合,再转入生物体内,产生出人们所期望的产物,或制造出具有新的遗传特点的生物类型,并能使之稳固地遗传给后代。
基因工程的核心技术是DNA的重组技术。
重组即利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因,通过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子,然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物,该种生物就能够够按人类事前设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。
除DNA重组技术外,基因工程还应包括基因的表达技术,基因的突变技术,基因的导入技术等。
基因工程一样分为4个步骤:
一是取得符合人们要求的DNA片段,这种DNA片段被称为“目的基因”;二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA;三是把重组DNA引入某种细胞;四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。
DNA分子很小,其直径只有20埃,约相当于五百万分之一厘米,在它们身上进行“手术”是超级困难的,因此基因工程事实上是一种“超级显微工程”,对DNA的切割、缝合与转运,必需有特殊的工具。
要把目的基因从供体DNA长链中准确地剪切下来,可不是一件容易的事。
1968年,沃纳·阿尔伯博士、丹尼尔·内森斯博士和汉密尔·史密斯博士第一次从大肠杆菌中提掏出了限制性内切酶,它能够在DNA上寻觅特定的“切点”,认准后将DNA分子的双链交织地切断。
人们把这种限制性内切酶称为“分子剪子”。
这种“分子剪子”能够完整地切下个别基因。
自70年代以来,人们已经分离提取了400多种“分子剪子”。
有了形形色色的“分子剪子”,人们就能够够为所欲为地进行DNA分子长链的切割了。
DNA的分子链被切开后,还得缝接起来以完成基因的拼接。
1976年,科学们在5个实验室里几乎同时发觉并提掏出一种酶,这种酶能够将两个DNA片段连接起来,修复好DNA链的断裂口。
1974年以后,科学界正式确信了这一发觉,并把这种酶叫作DNA连接酶。
从此,DNA连接酶就成了名符其实的“缝合”基因的“分子针线”。
只要在用同一种“分子剪子”剪切的两种DNA碎片中加上“分子针线”,就会把两种DNA片段从头连接起来。
把“拼接”好的DNA分子输送到受体细胞中去,必需寻觅一种分子小、能自由进出细胞,而且在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。
理想的运载体是质粒,因为质粒能自由进出细菌细胞,应当用“分子剪子”把它切开,再给它安装上一段外来的DNA片段后,它仍然如故地能自我复制。
有了限制性内切酶、连接酶及运载体,进行基因工程就能够够如愿以偿了。
运载体将目的基因运到受体细胞是基因工程的最后一步,目的基因的导入进程是肉眼看不到的。
因此,要明白导入是不是成功,事前应找到特定的标志。
例如咱们用一种通过改造的抗四环素养粒PSC100作载体,将一种基因移入自身无抗性的大肠杆菌时,若是基因移入后大肠杆菌不能被四环素杀死,就说明转入取得成功了。
二、工程菌的取得
1,确信目的产物。
2,找出产该产物的细胞。
3,将细胞破碎后提纯出全数信使RNA。
这些信使中包括了该细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。
4,利用基因扩增技术(PCR),找出所需的目的基因。
5,将目的基因连接到设计好的质粒载体,形成了重组DNA分子。
6,将重组后DNA分子引入到受体细胞内,然后选择适合的培育条件使细胞繁衍。
依照选择性标记,从菌落中挑选出目的基因的重组(工程)菌。
三、工程菌应具有的条件
1,发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的,同时是分泌型菌株。
2,菌株能利用经常使用的碳源,并可进行持续发酵。
3,菌株不是致病株,也不产内毒素。
4,代谢操纵容易进行。
5,能进行适当的DNA重组,而且稳固,重组的DNA不易脱落。
四、工程菌的应用
1,基因药物
例如,红细胞生成素、胰岛素、干优素、乙肝疫苗、生长激素和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等。
2,其它发酵产品
例如酶制剂、氨基酸(苏氨酸、色氨酸)、抗生素等。
第二节工程菌的培育
就生产流程而言,从发酵到分离、纯化目标产物,工程菌和常规微生物并无太多的不同。
但工程菌在保留进程中及发酵生产进程中表现出不稳固性,和平安性等问题,使得工程菌的培育有着自身所特有的特点。
一、平安问题
关于基因工程的社会问题,必需提到它的潜在危险性。
通过重组的菌和质粒一旦用于,工业化生产,就不可幸免地进入自然界。
这些菌能间接地危害人体健康,使医治药物失去效用,污染环境等。
因此,平安问题是极为重要的。
1974年,提出了DNA重组实验具有潜在生物危险性的问题。
后来,美、日等国都制定了有关DNA重组实验的准那么,即在试管内用酶等构建异种DNA的重组分子,并用它转入活细胞中的实验,和利用重组体的实验应遵循的规程。
其目的是保证明验的平安和推动重组DNA的研究。
这些准那么参照了避免病原微生物污染的方法,和依照对实验平安度的评定,采纳物理密封(P1~P4)和生物学密封(B1和B2)两种方式。
物理密封是将重组菌封锁于设备内,以避免传染给实验人员和向外界扩散。
实验规模在20L以下时,物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。
密封程度分为P一、P二、P3和P4级,数字越大,密封水平越高。
生物学密封要求用只有在特殊培育条件下才能生存的宿主,同时用不能转移至其它活细胞的载体,通过如此组合的宿主载体系统,能够避免重组菌向外扩散。
按密封程度分B1和B2级,B2级的密封要求最严格。
企业中进行重组菌培育时的设备标准有LS-1和LS-2。
LS-2相当严格,工业生产最少应在LS-1的设备标准下培育。
LS-1标准要点是:
(1)利用避免重组菌体外漏,能在密闭状态下进行内部灭菌的培育装置;
(2)培育装置的排气由除菌器排出;(3)利用易产气溶胶的设备时,要安装可搜集气溶胶的平安箱等。
设计用于基因重组菌的培育装置时,不仅要考虑外部杂菌的侵入,还要避免重组菌的外漏。
另外,培育后的菌体分离、破碎等处置也必需在平安柜内进行,或是采纳密闭型的设备。
二、基因工程细胞培育特点
前已述及,基因工程细胞培育进程与培育方式与天然细胞培育进程或方式大体—致。
但亦有其自身持点。
实践说明,基因工程细胞工业化培育中,产物的产率往往比实验室培育规模为低。
其缘故要紧与基因工程细胞特点有关,第一基因工程细胞的生长速度及表达率与其所载外源DNA的稳固性及产物分泌进程有关,其中重组DNA的稳固性尤其重要,重组DNA在宿主内表达方式有两种,其一是游离表达方式、其二是结合表达方式。
因此,基因工程细胞培育进程,重组DNA的丢失方式亦有两种,其一是细胞培育进程,由于答复突变或分派作用致使DNA丢失.称为脱落性不稳固,其二是重组DNA中编码的结构基因在宿主内发生再重组进程产生突变,再也不表达目的产物,此称加结构性不稳固。
第二为提高基因工程细胞表达效率,需采取适当方法,提高重组DNA在宿主细胞内的拷贝数及增进表达产物自细胞内向细胞外分泌。
另外,基因工程细胞的原宿主一般是某些培育物质(如某种氨基酸或维生素等)的缺点型,有些基因工程细胞生产进程亦产生某些抑制细胞生长的代谢物。
由此,在培育工程中应考虑操纵培育液营养成份及其浓度,同时采取方法,排除抑制细胞生长的代谢物,以保证细胞正常生长。
由此可见,在基因工程细胞培育进程,除—般培育条件外,必需考虑基因工程细胞的自身特点,确信最正确培育条件。
三、基因工程细胞的培育
前已述及,基因工程细胞的培育进程与一样需氧细胞培育大体一致,同时培育方式亦无不同,可采纳各类分批培育方式,亦可采纳持续培育、半持续培育及透析培育等方式。
至于阻碍基因工程细胞培育的细胞生物量得率与产物量的因素及有关参数。
亦可参照一般细胞相应培育方式求得。
目前关于动植物基因工程细胞培育工程的研究方才起步,有待进—步进展。
那个地址仅对基因工程菌的营养操纵、质粒稳固性、重组质粒拷贝数的操纵及表达效率作简单讨论。
1,底物浓度的操纵
在基因工程茵培育进程,至少要遵循PI级物理防护的规定,因此必需进行菌体的高密度培育。
一般E.coli培育时最高干重菌体收率可达12.5%,酿酒酵母可得%,浙枯草杆菌仅可得2%左右。
依照这些结果采纳枯草杆菌不太适合,除非其具有产物的高效分泌系统。
从生物平安性考虑,培育的基因工程菌一般是维生素或氨基酸的营养缺点型突变株。
培育进程细胞对维生素需求量甚微,在培育开始即加入必需量对细胞生长并无阻碍,但培育一开始即加入足够量氨基酸那么可能因氨基酸浓度过大而抑制细胞生长。
在此情形下,可采取培育进程中,在调剂pH值同时补加氨基酸混合物和葡萄糖的方式,以便培育进程葡萄糖及氨基酸浓度的大体恒定,从而实现高密度培育,如E.coliC600株培育时可取得6%干菌体。
但菌体对葡萄糖及氨基酸的收率因培育条件而异,如以葡萄糖及别离用苏氨酸、亮氨酸、组氨酸及色氨酸为底物时,那么平均每克底物所获干菌体量别离为、、1五、40及40g。
按每克干菌体本钱计,应用苏氨酸本钱最高,故应幸免应用苏氨酸缺点型菌株为宿主,最好选用维生素缺点型菌株为宿主。
二、质粒稳固性
重组质粒上通常载有Apr基因,取得该类重组质粒的基因工程菌在含氨苄青霉素培育液中能够生长,而非基因工程菌不能生长。
但在基因工程菌高密度培育时,外加的抗生素AP易于失活,阻碍培育。
为此考虑采纳抗生素依托性变异法替代抗生素添加法。
其方式是通过诱变使宿主成为某抗生素依托性突变株(如链霉素依托性Smd)。
只有在Sm存在下宿主才能生长,但重组质粒上含有Sm非依托性(Smid)基因,将重组质粒导入宿主细胞后,所获克隆菌可在不含抗生素培育基中生长,而丢失质粒菌株却不能生长。
此法很有有效价值,但缺点是宿主细胞易产生答复突变,造成培育工程复杂化,产物产率下降。
为考察质粒稳固性,在此引入质粒维持率Fn的概念,Fn表示分批培育中细胞割裂n次后,培育液中基因工程细胞数与总细胞数的比值,即
假定在分批培育进程中,细胞在对数生长期每次割裂时,其质粒丢失率为P,那么Fn为:
式中α-质粒丢失菌株与质粒维持率菌株μ的比值;
n-细胞割裂次数
理论上基因工程菌载荷外源性基因,培育进程细胞大量合成外源性产物,其负荷大于质粒丢失菌株,故基因工程菌株比生长速度μ通常较质拉丢失菌株小,固然亦有转变不大者。
依照以上方程计算结果,Fn转变情形如图7-20所示。
由图7-20可知.假定P=1%,当α=0时,说明质粒丢失菌株不能生长,培育处于最理想的稳固状态,亦为质粒最稳固状态,现在Fn接近于;但在无选择压力下,α值越大,Fn越低,即质粒稳固性越差。
在基因工程细胞的持续培育方式中,假设无选择压力,迪常不能取得恒定的稳固状态。
而在有选择压力下,那么可取得稳固状态。
可是培育基也与质粒稳固性有关,采纳天然培育基培产时质粒稳固件较用合成培育基为高,在天然培育基中即便无选择压力亦可维持质粒的稳固性,因此,用天然培育基进行持续培育是取得质粒稳固性的良好方式。
3,表达效率及质粒拷贝数操纵
在基因工程细胞培育工程中,表达效率与质粒拷贝数有关。
在质粒稳固基础上,应尽可能提高细胞内质粒拷贝数。
在工业生产中易于操作的方式是在培育的不同时期,采纳不同培育温度达到提高拷贝数量的,在前培育时期采纳低温,以减少细胞负荷,现在拷贝数较低,而比生长速度升高,在主培育半途升高温度,质粒拷贝数增加,目的基因产量提高。
如图7-21所示,在25℃下,培育含有穿梭质粒pCP3的E.coliC600/pCI857至浊度为5。
再将培育温度提高至37℃,那么质粒拷贝数增加,基因产物β-内酰胺酶活性增加37倍左右,但Fn急剧下降。
另外,利用λ噬菌体PL启动子的温度灵敏性,采纳二级持续培育方式,第1罐于低温下培育以降低表达效率,第2罐高温培育,对提高表达效率亦是有效的。
另外,当质粒拷贝数与某些化合物有关时,亦可采取添加或去除相应化合物的双时期持续过滤培育法以提高拷贝数和表达效率。
如用含有在色氨酸启动子下游接有β-半乳糖苷酶基因的重组质粒pMCT98的基因工程菌进行单级持续培育,并结合μm孔径陶瓷过滤器装置(图7-22),开始培育液含色氨酸,表达效率低,当生长浊度达到10时,进行交叉流动过滤,且供给不含色氨酸料液,结果如图7-23所示。
过滤达15min后培育液中已测不超卓氨酸,表达效率增加,β-半乳糖苷酶活力剧增。
最终浊度达150(相当于含6%干细胞),β半乳糖苷酶约占总蛋白量8%。
由此可知,在基因工程细胞培育工程中,需依照其固有特点和具体情形,采取相应方法、提高质粒稳固性,增加质粒拷贝数,实现培育条件优化,提高表达效率。
第三节工程菌分批培育动力学
关于质粒脱落性不稳固,细胞在割裂时丢失质粒的概率为p,那么
因此
关于底物
关于产物
第四节培育装置与产物的提取
工程菌的培育与一般微生物的培育方式类似。
在进行以工业化为目的的DNA重组实验,和为生产异种基因产物而培育重组菌时,固然应采纳简便易行的培育系统。
此刻多半利用大肠杆菌为宿主,而在一样的通气搅拌罐中大肠杆菌能生长良好。
一、培育装置
作为基因重组体的培育装置,与一直沿用的通气搅拌培育罐要有区别,即不仅要避免外部微生物侵入罐内,还必需采纳不使培育物外漏的培育装置。
按实验准那么,可把这种密闭型通气搅拌式培育罐划分为操作液量20L以上和20L以下两种。
现今利用的微生物培育装置,按其灭菌法又可分两类。
一是在高压灭菌器中进行培育基及培育罐的灭菌,罐本身一般是玻璃制的,容量在10L以下的占多数;另一类是20L以上的培育罐,一样为不锈钢制品,多采纳通新鲜蒸气进行灭菌。
前者是可移动的台式,罐本身不能经受高压;后者,蒸汽、空气等供给是用固定管道连接的,一样不能移动;这两类罐要充分考虑不使微生物由罐外进入罐内的问题,但并非必然要解决避免罐内微生物的外漏问题。
因此,采纳高压灭菌器灭菌的小型培育罐时应在平安柜内运转。
但培育罐稍大,该法就难以利用了。
二、基因重组菌外漏的防范
第一应了解培育微生物在一般通气搅拌罐中可能发生外漏的部位和操作。
归纳起来有:
(1)排气,
(2)机械密封,(3)接种,(4)取样,(5)培育后的灭菌(通入湿热蒸气),(6)排液(输至下一工序)。
针对这些均应采取一些方法以防菌体外漏。
现别离说明如下。
1,排气
排出的气中含有大量气溶胶,在猛烈起泡的培育时,培育液呈泡沫状。
它们从排气口向外排出,重组菌也容易随之外漏。
以往培育病原菌时;为避免菌体外流,采取加药剂槽的方式,但成效如何尚有疑问。
有人实验证明,排气中的微生物数量随着培育液中菌体浓度和通风速度等而转变。
用5L培育罐(装液量,以搅拌速度400r/min,通气速度1:
1(VVM),即min(换算成罐内通气速度为11cm/min)来培育大肠杆菌,发觉每毫升培育液中含109个菌体,每小时有150~400个菌随气排出;而培育酿酒酵母时,每小时从每毫升含108个菌体培育液的排气中检出30~70个。
由此可见,尽管培育液中菌体浓度相差专门大,但大肠杆菌和酵母菌仍以几乎相同程度从排气中漏出,并非取决于菌体个体的大小。
再有,提高通气速度时,单位体积的排气中,大肠杆菌和酵母菌菌数都增加,通气速度与漏菌数之间也紧密相关。
总之,排气进程中含有相当多的菌。
为此,在通用通气搅拌型培育罐上安装排气鼓泡器,以避免猛烈起泡时泡沫直接外溢和外部微生物侵入污染,同时还能肉眼观看通气状态等(图11-8)。
气体通过排气管到鼓泡瓶,再通过膜滤器。
进而考察了该排气鼓泡瓶中加入药剂(如2mol/LNaOH)的成效。
另外,为了解加热可否对排气灭菌,进行了与上述类似的实验。
图11-9的结果说明。
用电热器对排气进行加热时,在电热器出口处的排气温度被操纵在200°C左右。
电热器以后附有冷凝器,旨在使高温的排气冷却,以防膜滤器烧毁。
图11-8和图11-9的结果如表11-4所示。
表中数字为培育开始启12h中在膜滤器上捕集到的活菌数。
结果说明,排气仅通过药剂还不能完全灭菌。
利用药剂时假设能在排气鼓泡瓶内进行搅拌、消泡的话,是会有成效的。
用电热器将排气加热至200°C时,均末在膜滤器上检出大肠杆菌和酵母菌。
图11-10是基因重组菌培育装置中普遍采纳的排气除菌系统。
为减少培育液的蒸发量和降低排气的相对湿度。
在罐排气口外安装冷却冷凝器,其后才是加热器,排气气体经此加热至60~80°C。
相对湿度降低可预防滤器上凝结水汽。
除菌滤器与培育罐空气入口处的相同。
排气中的微生物(个)
菌种
鼓泡瓶
碱
电热器
大肠杆菌
酿酒酵母
980
71
611
40
0
0
除菌滤器有经多孔填料除菌的膜型滤器和深度型滤器。
后者要紧用于气体过滤,其原理与膜滤器不同,无筛网的成效,而是通过静电吸附、惯性冲撞等作用捕集气体中的粒子。
不管利用哪一种类型的滤器,都应付排气进行去湿处置。
利用膜滤器时,因滤器表面凝结水汽,压力损失骤增,深度型滤器除菌效率也会因水汽凝结而下降。
膜滤器原先多用于过滤液体,通过流水性滤器的开发,也能应用于气体过滤了。
2,机械密封
通气搅拌培育罐中贯穿罐的搅拌轴须与传动部连接。
作为这部份的轴封利用的是机械密封,有单机械密封和双机械密封之分。
前者由单密封面将罐与外界隔开。
此密封部份因高速旋转产生摩擦热,故需冷却和润滑。
如此一来,即便正常运转,培育液也会一点一点地渗入密封面,很有可能经此流出。
同时,灭菌时的热膨胀差也会使流出量增加。
这是培育终止后灭菌时最易外漏的所在。
还有,机械密封受利用寿命所限,在溢漏发生前就应按期改换。
因此单机械密封的培育罐不宜用于基因重组菌的培育。
双机械密封是用高于罐内压的压力,将贮存于另一润滑液槽中的无菌水压入机械密封部,用作轴封润滑液。
这时,上、下两部份即便有一部份的密封液渗漏,培育液也几乎无外漏危险。
但上、下两方同时溢漏时,培育液亦有可能外漏了。
因此,问题在于搅拌轴是由罐的上部仍是下部通入。
从培育装置的利用优势及搅拌轴长度等角度看,用下搅拌为宜。
但假设考虑培育液外漏的情形,培育基因重组菌时,以用上部搅拌的双机械密封为宜。
用磁力方式改变搅拌动力的传动就没必要担忧机械密封的外漏了。
10L以下的培育装置以往一直是用磁力进行动力传动的,但罐一大,会显现磁力不足、轴承磨损等问题。
目前大至90L培育罐,已能用强磁力进行动力传动。
现时,基因重组菌的培育罐仍采纳双机械密封的上搅拌方式为多,第二用双机械密封的下搅拌方式。
3,取样
一般培育罐的取样管道在取样时会流出样品。
取样后对样品管道灭菌时,未灭菌的培育液污水被排至排水管内。
对此,必需采取方法,如用取样工具进行取样(图11-11)。
此法可在培育液不接触外界的条件下取样。
用高压灭菌器使其灭菌或是连接后用蒸汽灭菌,灭菌终止后将样品从罐中掏出送入样品管中。
取完所需的样品,卸下之前对取样管道再次灭菌。
卸下经灭菌的连结器,在平安柜中卸下样品管。
取样中利用的排水管管道与废液灭菌贮罐相连,取样及灭菌时产生的排水一并贮存于罐内,经灭菌后排出。
另外还设计了各类平安取样用的器具。
例如,通过双层橡皮膜,用注射器取样;把可移动的完全密封型的球形箱与取样管连接,在此箱中取样等。
可是这些操作都由人工操纵,操作中不免犯错。
为了减少操作人员接近工程菌的机遇,尽可能不用人工操作而采纳自动取样装置最为平安。
图11-12为自动取样装置的流程图。
取样方式与人工取样程序大致相同。
同时,取样进程因采纳程序系统操纵而易于变更。
掏出的样品保留于冷库内,冷库内的空气经滤器过滤,内部也可进行灭菌。
4,培育后的灭菌
培育后对培育液和管道等进行灭菌时,一开始流出的末灭菌排水有可能存在活的重组菌。
取样、排液的管道中能产生这种排水,因此,必然要另行安装排水管并与废液灭菌贮槽等相连接,以便徘放污水。
5,接种
向罐内直接接种的方式是不平安的。
简单的平安接种法是将种子瓶与培育罐以管相连接后,用无菌空气加压压入的方式。
另一种方式是先把种子液在平安柜内移至供接种用的小罐内,再将其与培育罐连接,用蒸汽对连接部份灭菌后,把种子罐中的种子液接入培育罐内。
6,排液
培育后要将培育液输送至贮罐等下一道工序,这时也有可能产动气溶胶和重组菌的扩散。
平安的方式是在培育开始前就将排液口与下段工序相连接并进行灭菌,如此培育于终止即可直接输送培育液。
若是排液口未与下段工序相连那就应与连结废液灭菌罐的排水管道相接,如此就平安了。
三、培育罐的管道布局
图11-13表示重组菌培育罐(P二、P3级)的整体流程图。
重组菌培育罐中,凡有可能外漏重组菌的部份都与排污管道相连。
图中所示的管路能分离并排出污染重组菌的污水。
可是实际操作者必需警惕谨慎,不然难以避免因疏忽而造成的重组菌的扩散。
为减少操作误差和实验者接近重组菌的机遇,应安装连锁装置,实现自动化操作,人可在别的室内进行监视。
另外,必需设置警报系统监测培育罐压力,以避免发生异样。
另外,培育后的后处置工序中也必需采取防污方法。
例如,菌体的分离通常利用沙氏(Sharpres)型离心机;由于极可能产动气溶胶,故用膜分离法进行浓缩。
采取上述方法大体上就能够幸免培育罐中的基因重组菌外漏了。
估量能达到大量培育重组菌实验准那么中LS—一、LS-2等物理性密封实验的标准。
四、基因工程产品的提取和精制
传统的发酵产品和基因工程产品在提取和精制上的不同,要紧表此刻以下两方面:
(1)传统发酵产品多为小分子(工业用酶除外,但它们对纯度要求不高,提取方式较简单),其理化性能,如平稳关系等数据都已知,因此放大比较有依照;相反,基因工程产品都是大分子,必要数据缺乏,放大多凭体会。
(2)基因工程产品大多处于细胞内,提取前需将细胞破碎,增添了很多困难。
由于第一代基因工程产品都以大肠杆菌作宿主,无生物传送系统,故产品处于胞内。
而且发酵液中产物浓度也较稀,杂质又多,加上一样大分子较小分子不稳固(如对剪切力),故提取较困难,常需利用高分辨力的精制方式,如色层分离等。
在其它方面,基因工程产品的提取方式与传统发酵产品相似,详见下篇(下游加工进程)。
目前以为,基因工程产品的回收率达到30、40%就已相当不错。
因此,尽可能减少提取步骤是相当重要的。
另外,关于基因工程产品,还应注意生物平安(biosafety)问题,即要避免菌体扩散,专门对前面几步操作,一样要求在密封的环境下操作。
例如用密封操作的离心机进行菌体分离时,整个机械处在密闭状态,在排气口装有一无菌过滤器,同时有一根空气回路以帮忙平稳在排放固体时系统的压力,无菌过滤器用来排放过量的气体和空气,但可不能使微生物排放到系统外。
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