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PCR实验室
建立PCR实验室的基本条件
临床基因扩增实验室采用PCR技术用于临床基因诊断,由于PCR技术对所检测的核酸模板进行大量扩增,容易出现实验室污染导致临床检测标本假阳性结果;另外由于PCR技术要求高、影响因素多(特别是RNA标本),实验过程处理不当易导致核酸模板无扩增现象,导致临床标本假阴性结果。
因此临床基因扩增检验实验室技术验收和规范化管理是PCR技术本身需要,也是在临床上顺利应用该技术前提。
二、PCR实验室验收准备工作
(一)硬件准备——实验室基本建设
1.根据文件要求,临床基因扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域:
试剂贮存和准备区;标本制备区;扩增反应混合物配制和扩增区;扩增产物分析区,如使用全自动封闭分析仪器检测,此区域可不设。
2.各工作区域必须有明确的标记,避免不同工作区域内的设备、物品混用。
3.进入各工作区域必须严格按照单一流向进行,即试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。
4.不同的工作区域使用不同的工作服(不同的颜色)。
工作人员离开各工作区域时,不得将工作服带出。
5.工作区域仪器设备配置标准
⏹试剂贮存和准备区2~8℃和-15℃冰箱:
混匀器;微量加样器(覆盖1~1000μl);移动紫外灯(近工作台面);消耗品:
一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心);专用工作服和工作鞋;专用办公用品等。
⏹标本制备区2~8℃冰箱,-20℃或-80℃冰箱;高速台式冷冻离心机;混匀器;水浴箱或加热模块;微量加样器(覆盖1~1000μl);可移动紫外灯(近工作台面);超净工作台,消耗品;一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心);专用工作服和工作鞋;专用办公用品等。
⏹扩增反应混合物配制和扩增区核酸扩增仪;微量加样器(覆盖1~1000μl);可移动紫外灯(近工作台面);消耗品:
一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心);专用工作服和工作鞋;专用办公用品等。
⏹扩增产物分析区视检测方法不同而定。
基本仪器设备如下:
微量加样器(覆盖1~200μl);可移动紫外灯(近工作台面);消耗品:
一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心);专用工作服和工作鞋;专用办公用品等。
(二)软件建设——质量手册编写与实施、人才资源(上岗证培训与相关知识学习)
1.临床基因扩增检验实验室的质量手册编写质量手册是阐明临床基因扩增检验实验室的质量方针,并描述过其质量体系的文件。
质量手册规定了质量体系的基本结构,是实施和保持质量体系应长期遵循的文件。
临床基因扩增检验实验室质量手册编写应依照卫生部下发两个文件,并结合本实验室实际情况编写适合本实验室的切实可行的质量手册。
质量手册的提纲应包括三部分:
质量方针和宗旨;工作制度;标准操作文件(SOP)
(1)质量方针和宗旨制定临床基因扩增检验实验室的质量管理目标和质量保证体系的结构体系和总方针。
(2)工作制度一般应包括以下文件:
实验室的设置、布局及组织结构;实验室内务管理制度;实验室的人员配置及管理制度;生物的防护与安全制度;实验室废弃物处理制度;实验室清洁消毒制度;仪器设备的管理制度;仪器、试剂、耗材购置程序及管理制度;临床标本的管理制度;实验室记录的管理制度;质量控制工作管理制度;结果报告管理制度;抱怨的内部处理制度;负责人及质检员职责;岗位设置和责任制等……
(3)标准操作程序(SOP)一般包括:
消毒液配制标准操作程序:
消毒标准操作程序;超净工作台使用标准操作程序;超净工作台维护和保养标准操作文件;PCR仪使用标准操作程序;PCR仪维护和保养标准操作程序;高速低温离心机使用标准操作程序;移液器使用标准操作程序;冰箱维护和保养标准操作程序;电热恒温水浴箱操作程序;电子天平使用和校正操作程序;可移动紫外消毒车使用操作程序;加样器校准标准操作程序;离心机维护保养操作程序;温度计校准程序;试剂的质检操作程序;标本唯一标识编号编制规则;临床标本的采集及处理操作程序;临床标本的保存程序;乙肝病毒核酸扩增荧光检测标准操作程序;丙肝病毒核酸扩增荧光检测标准操作程序;结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测标准操作程序;沙眼衣原体核酸扩增荧光检测标准操作程序等……
(4)引用图表:
PCR扩增可接受标本记录表;PCR扩增拒收标本记录表;室内质控结果记录表;室间质控记录表;消耗性材料验收记录表;试剂验收记录表;故障处理表;台阶式高速离心机使用记录表;台式高速冷冻离心机使用记录表;扩增仪维护保养记录表;人员培训计划及培训记录表;实验室工作人员一览表;主要设备一览表;实验室清洁消毒记录表;工作区温度、湿度记录表;抱怨记录表;标本超低温保存记录表;应急处理记录表;垃圾处理记录表;冰箱温度记录表;水浴箱温度记录表;移动紫外消毒车记录表;设备校正记录表;检测结果报告流程;报告单样张;临床送检标本流程图;实验室组织结构图。
为了对以个特定序列进行PCR做重复检测,需要三个不同的区域,每一个区域的具体技术操作和试剂在下面详细列出.
1、样品准备区
这个区域专门用作样品的准备,在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施:
1)PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。
2)组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理,以根据应用的需要提取DNA或RNA。
3)用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,也不能用作操作靶序列。
4)DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作,以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。
5)大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。
6)管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生,而且管子不能用力崩开,这样会产生气溶胶。
7)任何时候都应该穿实验服和带手套,手套要经常更换,尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。
实验服要专门用于样品准备间,经常清洗。
2、样品准备和RNA-PCR
RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作,这样增加了样品之间污染的机会。
为了避免这一问题,反转录一步可以在样品准备区进行。
在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。
3、前PCR区
必须有专门用于准备各种反应的区域,这个区域必须保持干净,而且没有来自克隆和样品准备的污染。
前PCR区必须要有试剂和准备,特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。
4、PCR实验室试剂的操作
1)所用的所有溶液都应该没有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。
μm过滤的,并且是高压灭菌。
3)在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂,在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。
4)所用试剂都应该以大体积配制,实验一下看试剂是否满意,然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。
5)所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。
6)新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。
7)样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。
5、在前PCR区建立PCR混合物
1)可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃,在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。
2)如果你的实验室使用多套引物,以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济,可以考虑分装保存够一天的PCR成分。
3)作为一个规则,应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。
而且,你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。
4)阴性样品要与每组样品同时做,以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染,阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。
5)当做阳性对照时,有两个理由决定了应该使用最少数量的核酸。
6)由于必须有对照反应,对照模板的特点应该予以考虑。
6、控制污染的方法
已设计出很有力的酶学方法用来消除一种形式的污染—使用UNG,这一技术能有效地消除由PCR产物引起的污染。
另一种控制污染的方法是使用紫外线,这种方法不能完全消除污染问题,但可以将污染降低几个数量级。
7、PCR仪的位置
8、后PCR区
PCR完成以后,需要分析样品并解释数据,应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。
后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的,决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动。
⏹荧光定量PCR实验室所需仪器设备清单(卫生部推荐)
序号仪器设备、辅助材料名称放置地点
1冰箱试剂准备区
2紫外线消毒灯试剂准备区
3混匀器试剂准备区
4可调式移液器(1-10µl),(5-40ul),(20-200ul)一套三把试剂准备区
5高速台式离心机试剂准备区
6专用工作服和衣柜试剂准备区
7冰箱样品准备区
8紫外线消毒灯样品准备区
9生物安全柜B2级样品准备区
10冷冻高速离心机(丙肝专用)样品准备区
11恒温金属浴样品准备区
12混匀器样品准备区
13可调式移液器(5-40ul),(20-200ul),(200-1000ul)一套样品准备区
14专用工作服和衣柜样品准备区
15紫外线消毒灯PCR扩增区和产物分析区
16可调式移液器(1-10µl),(5-40ul),(20-200ul)一套PCR扩增区和产物分析区
17专用工作服和衣柜PCR扩增区和产物分析区
18荧光定量PCR检测仪PCR扩增区和产物分析区
⏹所有四区均需准备的仪器设备为:
专用工作服和工作鞋
专用办公用品
一次性手套、一次性吸水纸
可移动紫外灯(近工作台面)
微量加样器一套(覆盖1~1000ul)
以上物品各一套。
●试剂贮存和准备区
2~8℃和-15℃冰箱
混匀器(可加热)
耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心)
天平
高压锅
●标本制备区
2~8℃冰箱和-20℃或-80℃冰箱
高速台式冷冻离心机
混匀器
水浴箱或PCR仪
耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心)
生物安全柜B2级
超净工作台
超声波水浴仪(处理大分子DNA用)
●三、扩增反应混合物配制和扩增区
核酸扩增仪
耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心)
国产离心机
●四、扩增产物分析区
酶标仪、洗板机、恒温箱(PCR—ELISA)
加样器吸头(带滤心)
电泳仪及电泳槽
杂交仪
核酸转移仪
国产离心机
PCR实验室
一、什么是pcr实验室:
Pcr实验室又叫基因扩增实验室。
PCR是聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)的简称。
是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段,可看作生物体外的特殊DNA复制。
通过DNA基因追踪系统,能迅速掌握患者体内的病毒含量,其精确度高达纳米级别,精确检测乙肝病毒在患者体内存在的数量、是否复制、是否传染、传染性有多强、是否必要服药、肝功能有否异常改变能及时判断病人最适合使用哪类抗病毒药物、判断药物疗效如何、给临床治疗提供了可靠的检验依据
二、开展pcr实验室应具备的条件:
1、必须拥有标准的的PCR荧光实验室;
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出
由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它
有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广
泛应用。
本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍
2、检测设备必须符合标准PCR荧光实验室设置要求;
荧光定量PCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件,构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。
3、必须通过国家临床检验中心的验收和认证;
4、检测人员必须通过国家临检中心业务培训并取得合格证书;
PCR实验室内工作人员必须参加由国家卫生部或各省临床检验中心举办的临床基因扩增培训班,并持证上岗。
PCR实验室通过验收,实验室至少必须应有两个以上持有“临床基因检测上岗证”。
PCR实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序(SOP)、建立系列质量管理文件等,确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求,确保检测结果准确、确保实验室卫生安全,确保实验室长期稳定运行
5、必须在无菌无尘环境下进行操作
三、pcr实验室的功能:
能够对患者病情进行科学、准确、实时的掌控,并结合抗HBV与T细胞免疫来打破免疫耐受,阻断肝病病毒复制的疗法、有效的分解肝炎病毒,解决了乙肝病毒易变异、耐药,病毒复制模板难以治疗,人体免疫耐受状态不易打破等医学难题,能迅速消除临床症状,而且有效抑制乙肝病毒复制,明显加快e抗原、抗体的血清转换速度,杀灭血液及肝细胞内的病毒,为防止再感染提供了长期保护,有效阻断和逆转肝纤维化、肝硬化进程。
四、怎样建立pcr实验室
1、建立样品准备区
这个区域专门用作样品的准备,在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施:
⑴PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。
⑵组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理,以根据应用的需要提取DNA或RNA。
⑶用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,也不能用作操作靶序列。
⑷DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作,以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。
⑸大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。
⑹管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生,而且管子不能用力崩开,这样会产生气溶胶。
⑺任何时候都应该穿实验服和带手套,手套要经常更换,尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。
实验服要专门用于样品准备间,经常清洗。
2、样品准备和RNA-PCRRNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作,这样增加了样品之间污染的机会。
为了避免这一问题,反转录一步可以在样品准备区进行。
在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。
3、建立前PCR区。
该去专门用于准备各种反应,这个区域必须保持干净,而且没有来自克隆和样品准备的污染。
前PCR区必须要有试剂和准备,特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。
4、PCR实验室试剂的操作。
⑴所用的所有溶液都应该没有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。
⑵所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的-新鲜蒸馏的去离子水,用0.22μm过滤的,并且是高压灭菌。
⑶在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂,在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。
⑷所用试剂都应该以大体积配制,实验一下看试剂是否满意,然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。
⑸所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。
⑹新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。
⑺样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。
5、在前PCR区建立PCR混合物。
⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃,在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。
⑵如果你的实验室使用多套引物,以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济,可以考虑分装保存够一天的PCR成分。
⑶作为一个规则,应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。
而且,你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。
⑷阴性样品要与每组样品同时做,以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染,阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。
⑸当做阳性对照时,有两个理由决定了应该使用最少数量的核酸。
⑹由于必须有对照反应,对照模板的特点应该予以考虑。
6、控制污染的方法。
已设计出很有力的酶学方法用来消除一种形式的污染—使用UNG,这一技术能有效地消除由PCR产物引起的污染。
另一种控制污染的方法是使用紫外线,这种方法不能完全消除污染问题,但可以将污染降低几个数量级。
7、PCR仪的位置
8、后PCR区PCR完成以后,需要分析样品并解释数据,应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。
后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的,决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动
标准的PCR实验室简介
1、 主体结构:
主体为彩钢板、铝合金型材。
室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝,从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。
结构牢固,线条简明,美观大方,密封性好。
2、 标准的三区分隔和气压调节:
将PCR过程分成试剂准备、标本制备和PCR扩增检测三个独立的实验区。
整个区域有一个整体缓冲走廊。
每个独立实验区设置有缓冲区,同时各区通过气压调节,使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。
可打开缓冲区Ⅰ,缓冲区Ⅱ和PCR扩增区的排风扇往外排气,在实验区的外墙上和各扇门上都安装有风量可调的回风口,空气通过回风口向室内换气。
3、 消毒:
在三个实验区和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯,供消毒用。
在试剂准备区和标本制备区还设置移动紫外线灯,对实验桌进行局部消毒。
4、 机械连锁不锈钢传递窗:
试剂和标本通过机械连锁不锈钢(不建议使用电子连锁方式)传递窗传递,保证试剂和标本在传递过程中不受污染(人物分流)。
5、 地面
地面建议使用PVC卷材地面或自流坪地面,整体性好。
便于进行清扫,耐腐蚀。
没有条件的也可采用水磨石地面,或大块的瓷砖(至少800mm×800mm)接缝需要小于2mm。
6、 照明
灯具要选用净化灯具,能达到便于清洗、不积尘的特点。
在建设的过程中应注意:
●规范的安装流程和全面的服务流程。
●严格按照规范科学设计的安装流程。
●安装前需要确定以下安装条件,如:
电源电压,电源进线位置,电话网络线进线位置,进水水压,最小安装空间,地面平整度,通风孔、进水管和下水管的位置等,理想状态的空间尺寸和通风口尺寸。
实验室净化工程[详细内容]
p2实验室就是PhysicalContainmentLevel2Laboratory
在PC2lab中工作一定要穿实验服鞋子要完全包住脚.不能吃东西和喝水.离开后一定要锁门.PC2lab可以处理unclearbiological.实验记录本要和实验台分开实验服不可以带出实验室(除非拿去洗).
P2实验室即二级生物安全实验室,相当于BSL-2实验室。
BLS-2实验室主要用于初级卫生服务、诊断和研究,其实验对象的危害等级为Ⅱ级(中等个体危害,有限群体危害),具体定义为“能引起人类或动物发病,但一般情况下对健康工作者、群体、家畜或环境不会引起严重危害的病源体。
实验室感染不导致严重疾病,具备有效治疗和预防措施,并且传播风险有限”。
BLS-2实验室规定了以下技术指标(静态):
1、洁净度:
无要求
2、最小换气次数:
可开窗通风
3、与室外方向相邻相通房间的压差:
无要求
4、温度℃:
18~27
5、相对湿度%:
30~70
6、噪声dB(A):
≤60
7、最低照度lx:
300
二.建筑、结构和装修要求
现在BLS-2实验室大多数是在原有建筑物内进行改建,不同于新建的BLS-2实验室(国标中,要求新建BLS-2实验室宜离开公共场所一段距离),在与相邻其他房间之间,存在着一个相对隔离问题。
所以在原有建筑物中改建BLS-2实验室,应重点注意以下几个问题。
1、在共用建筑物中建BLS-2实验室,应设可自动关闭的带锁的门,必要时,可设立缓冲区域,如缓冲间等。
2、如果没有机械通风系统,应有窗户进行自然通风,并应有防虫纱窗。
(一般情况下,应有机械通风系统,否则,温湿度指标难以保证)。
3、应有防昆虫、鼠等动物进入和外逃的措施。
三.空调、通风和净化
为满足BLS-2实验室温湿度要求,宜配备机械空调通风系统,有特殊要求的可增设设计要求,如增设净化要求并按净化要求进行送回(排)风系统设计等。
这方面,应重点处理好以下几个问题:
1、可以采用带循环风的空调系统。
如果涉及化学溶媒,感染性材料操作和动物实验,则应采用全排风系统。
2、生物安全柜与排风系统连接
I级排风比例100%,密闭连接。
II级A型排风比例30%,可排到房间或设置局部排风罩。
B1型排风比例70%,密闭连接。
B2型排风比例100%,密闭连接。
3、实验室内各种设备的位置应有利于气流由“清洁”空间向“污染”空间流动,最大限度减少室内回流与漏流(生物安全柜一般应置于室内气流最下游,即最远离送风口处)。
*生物安全柜的排风不能代替室内排风。
四.排水
含菌污水应经高温高压消毒或化学消毒后排放至市政污水排放公用系统。
五.电气设置
1、应设专用配电箱。
2、电源宜设置漏电检测报警装置。
3、应有可靠的接电系统,其接地电阻不宜大于1Ω。
4、实验室入口应有实验室工作状态的文字式灯光讯号显示。
5、应设紧急发光疏散指示标志。
六.消防
建筑物耐火等级不低于二级。
七.应配备的工艺设备
1、生物安全柜
(1)产生微生物气溶胶或出现溅出的操作,可使用I级生物安全柜。
(2)处理感性材料,应使用II级生物安全柜;
(3)处理化学致癌剂、放射性物质和挥发性溶媒,应使用Ⅱ/s。
压差:
主车间对相邻房间≥5Pa。
温度:
冬季16℃±2℃;夏季<26℃±2℃;
相对湿度:
45-65%(RH);噪声≤65dB(A);新风补充量:
总送风量的20%-30%;照度:
≥300Lux。
结构材料
1.洁净室墙、顶板材料一般采用50mm厚的夹芯彩钢板、净化专用的氧化铝型材制造。
门采用净化密闭门,窗采用铝合金玻璃固定窗。
2.地面采用环氧自流平或高级耐磨塑料洁净地板。
3.净化通风管道选用镀锌薄钢板制作,并采用“PEF”阻燃型的保温板做保温
如何建立一个PCR实验室?
为了对以个特定序列进行PCR做重复检测,需要三个不同的区域,每一个区域的具体技术操作和试剂在下面详细列出.
1、样品准备区
这个区域专门用作样品的准备,在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采
取预防措施:
1)PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。
2)组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理,以根据应用的需要提取DNA或RNA。
3)用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,也不能用作操作靶序列。
4)DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作,以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。
5)大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。
6)管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生,而且管子不能用力崩开,这样会产生气溶胶。
7)任何时候都应该穿实验服和带手套,手套要经常更换,尤其在抽提过程中每一步之间都要更换
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- PCR 实验室