高速逆流色谱仪.docx
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高速逆流色谱仪.docx
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高速逆流色谱仪
高速逆流色谱仪
原理
高速逆流色谱(high-speedcountercurrentchromatography,HSCCC)是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液—液分配色谱分离技术,它不用任何固态的支撑物或载体。
它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡,当其中一相作为固定相,另一相作为流动相,在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。
由于不需要固体支撑体,物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现,因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等,不仅使样品能够全部回收,回收的样品更能反映其本来的特性,特别适合于天然生物活性成分的分离。
而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触,使得样品的制备量大大提高,是一种理想的制备分离手段。
它相对于传统的固—液柱色谱技术,具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。
目前HSCCC技术正在发展成为一种备受关注的新型分离纯化技术,已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域,特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技术;适合于中小分子类物质的分离纯化。
我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家,俄罗斯、法国、英国、瑞士等国也都开展了此项研究。
美国FDA及世界卫生组织(WHO)都引用此项技术作为抗生素成分的分离检定,90年代以来,高速逆流色谱被广泛地应用于天然药物成分的分离制备和分析检定中。
1.逆流色谱是20世纪50年代源于多极萃取技术(非连续性)
但是多极萃取设备庞大复杂、易碎、溶剂体系容易乳化,溶剂耗量大,分离时间长。
2. 20世纪70年代,出现了液滴逆流色谱(DCCC)
特点:
(1)流体静力学原理(Hydrostaticequilibriumsystem,HSES)
(2)分离时间过长、连接处容易出现渗漏等
3.20世纪70年代出现了离心分配色谱仪(Centrifugalpartitionchromatography,CPC)
特点:
(1)基于流体静力学原理(Hydrostaticequilibriumsystem,HSES),利用公转产生的单一力场
(2)连接处较多而且容易出现渗漏,清洗维护复杂
4.20世纪80年开始出现了现在的高速逆流色谱,可称为最先进的逆流色谱
特点:
(1)基于流体动力学原理(Hydrodynamicequilibriumsystem,HDES)
(2)通过公转、自转(同步行星式运动)产生的二维力场,保留两相中的其中一相作为固定相
(3)通过高速旋转提高两相溶剂的萃取频率,1000rpm旋转时可达到17次/s频率的萃取过程
5.HSCCC分离流程图
举例
1.高速逆流色谱分离黄柏中的小檗碱和巴马亭
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
HSCCC2TBE300型高速逆流色谱仪,深圳同田生化有限公司;
HD2212C2B核酸蛋白检测仪,上海康华生化仪器厂;
R2201旋转蒸发器,上海申胜生物技术有限公司;
LC210AT高效液相色谱仪,日本岛津色谱仪器公司;
氯仿、甲醇、正丁醇、乙酸均为国产分析纯,水为重蒸水,黄柏购于杭州胡庆余堂,为川黄柏。
1.2 样品的处理
把黄柏1000g粉碎过20目筛,用5倍量工业酒精浸泡24h,连续3次,过滤,合并滤液浓缩后加适量盐酸酸化至pH等于2,放置过夜,过滤得滤液,滤液再用NaOH碱化至pH等于10,然后用等量氯仿萃取3次,氯仿浓缩得浸膏3.2g,该浸膏用于高速逆流色谱分离的样品。
1.3 HSCCC溶剂系统选择
溶剂系统参照文献[4,5]选择氯仿:
甲醇:
0.2molöl稀盐酸组成溶剂体系,按照各种比例混合,总体积为4ml,每次取样品10mg溶于溶剂体系,充分溶解后分层,取上下相分别点板(硅胶板,展开剂为:
正丁醇∶乙酸∶水=7∶1∶2),看两相中斑点的大小,最后发现当氯仿∶甲醇∶0.2molöl稀盐酸的体积比为2∶1∶1时,斑点大小大约相等,所以选氯仿∶甲醇∶0.2molöl稀盐酸=2∶1∶1为溶剂体系。
2 结果及讨论
2.1 分离结果
溶剂体系为:
氯仿∶甲醇:
0.2molöl稀盐酸=2∶1∶1,将其室温下在分液漏斗中充分混合后静置分层(总体积1000ml),然后取上相为固定相,下相为移动相。
每次进样200mg溶于20ml的溶剂系统上相,用注射器一次进样,流动相流速2mlömin,仪器转速800römin,检测器波长254nm,进样4h后,停止主机转动,用氮气把固定相推出,测得保留比为91.4%。
图1 高速逆流色谱分离黄柏中的生物碱图
经高速逆流色谱分离后显示有三个主要的峰(见图1),我们用分部收集器对每个峰都进行了收集,间隔时间为6min每试管,并用TLC进行监测,去掉组分重叠的试管结果得到20.4mg的组分É,64.8mg的组分Ê,经HPLC检测组分É和Ê的纯度分别为99.6%和99.3%,组分Ë16.9mg为一混合物。
2.2 结构鉴定
组分I:
黄色针状结晶(乙醇),熔点198~200℃(分解)。
IRTmax(KBr)cm-1:
2923,1605,1510,1364(芳香核),1H2NMR(DMSO2d6)D:
3.25(2H,tr,J=6.0Hz),4.98(2H,tr,J=6.0Hz),3.88,3.94,4.08及4.11(12H,4×OCH3,s),7.10(1H,s),7.73(1H,s),8.06(1H,d,J=910Hz),8.21(1H,d,J=9.0Hz),9.07(1H,s),9.89(1H,s);MSmöz:
352,337,322,308,为盐酸巴马亭。
组分II:
黄色针晶,熔点201~203℃(分解)。
IRTmax(KBr)cm21:
1600,1505,1364(芳香核),1H2NMR(DMSO2d6)D:
3.22(2H,tr,J=5.6Hz),4.95(2H,tr,J=5.6Hz),4.07及4.09(6H,s),6.17(2H,s),7.08(1H,s),7.78(1H,s),8.02(1H,d,J=9.0Hz),8.20(1H,d,J=9.0Hz),8.94(1H,s),9.89(1H,s);MSmöz:
337,321,306,292,278,为盐酸小檗碱。
3 结 论
本文用半制备型高速逆流色谱,进样量可达200mg,对黄柏中生物碱进行分离,能一次性得到,说明该方法特别是大制备量的高速逆流色谱仪,是分离天然产物的一种好方法。
参考文献:
[1] 王衡奇,秦民坚,余国奠.黄柏的化学成分及药理学研究进展[J].中国野生植物资源,2001,20(4):
628.
[2] 张天佑.逆流色谱技术[M].北京:
北京科学技术出版社,1991:
2742386.
[3] 戴德舜,王义明,罗国安.高速逆流色谱研究进展[J].分析化学,2001,5:
5862591.
[4] 袁黎明,吴 平,夏 滔,等.高速逆流色谱制备分离中药黄柏中的生物碱[J].色谱,2002,20
(2):
1852186.
[5] WalterD.ConwayandYoichiroIto.Highspeedcountercurrentchromatography[J].LiquidChromatogr,1984,7
(2):
2912302.
2.高速逆流色谱技术制备石杉碱甲单体
1.仪器及试剂
本论文的研究工作所应用的仪器设备均为华南理工大学与广州普源生化科技有限公司合作组建的华工-普源天然产物分离纯化技术开发中心所配备的实验仪器,主要为:
高速逆流色谱系统:
TBE300A高速逆流色谱主机+AKTAPrime系统(主要含泵、检测器及收集器等)+MultiTempⅢ(恒温水浴)+PrimeView2.0(色谱工作站),上海同田生化技术有限公司+AmershamPharmaciaBiotech;高效液相色谱系统:
HP1100+HPChemStation,HPCorporation;千层塔植物提取物:
约5%石杉碱甲含量,宁波立华制药有限公司;石杉碱甲对照品:
99.1%石杉碱甲含量,宁波立华制药有限公司;n-Hexane:
分析纯,天津市津沽工商实业公司;n-BuOH:
分析纯,天津市化学试剂一厂;Methanol:
HPLC色谱纯,上海凌峰化学试剂有限公司;Triethanolamine:
分析纯,天津市博迪化工有限公司;双蒸水及反渗透水:
均为自制获得。
2.高速逆流色谱分离实验
2.1实验步骤
取n-Hexane、n-BuOH及H2O按4:
1:
5的比例配制约2000ml的两相溶剂体系,并于室温下平衡过夜;根据石杉碱甲的结构特性,利用一定的方法把千层植物提取物处理成石杉总碱;取少量石杉总碱用高速逆流色谱溶剂体系配制样品溶液;按如下2.2的工作流程进行高速逆流色谱分离实验。
2.2工作流程
图1高速逆流色谱实验的工作流程
图1表示出了本研究工作所采用的高速逆流色谱系统的工作流程。
实验过程
中,溶剂在泵的作用下经过六通上样阀,按一定的通路,进入水平行星式高速旋
转的螺旋管分离柱中,样品在其中进行分配分离,流分通过紫外检测器等进行检
测,并通过分布收集器收集,实验过程的参数及实验结果通过色谱工作站监控并
记录。
本论文的研究工作根据选定溶剂体系的特性,首先采用正向洗脱方式把目
标组分及其周围的组分洗脱出分离管柱,之后把仪器的运作方式切换为反向洗
脱,以把存留在管柱里的易溶于固定相的组分洗脱出来,这种操作方式即有利于
缩短分离时间又有利于降低多次实验间的相互影响。
2.3分离结果
利用选定的溶剂体系——n-Hexane/n-BuOH/H2O(4:
1:
5)及优化后的高速逆流色谱工艺参数(螺旋管柱转速700RPM正向洗脱;流动相流速2.0ml/min;恒温水浴循环水温度45℃;紫外检测波长280nm;另外反向洗脱时螺旋管柱的转速依然为700RPM)上样386mg石杉总碱进行高速逆流色谱分离实验,其结果如图2所示,其中实线为紫外检测线、点画线为电导检测线、虚线为上相溶剂的体积百分率曲线。
图2石杉总碱在选定条件下的HSCCC分离谱图
3.分离结果的高效液相色谱分析测试
图2中第3部位流份经高效液相色谱分析,其结果如图3-a所示。
另外往这一流份中加入少量的石杉碱甲对照品在同样的色谱条件下进行高效液相色谱分析,其结果如图3-b所示。
分析所用的色谱条件为:
色谱柱(HypersilODS5μm,4.6*250mm,Agilent);流动相(Methanol/H2O/Triethanolamine=60:
40:
0.02,V/V/V);流动相流速(1.0ml/min);柱温(40.0℃);紫外检测波长(310nm);样品溶媒(HPLC流动相);样品溶液经0.45μm微孔滤膜过滤。
a)第3部位流份的HPLC色谱图
b)第3部位流份稀释液
以上的分析结果说明图2中对应的第3部位流份的主成分为石杉碱甲,且其在相应的HPLC色谱条件下,除主成分峰外在20min内未显示出杂质峰并与对照品在相同的色谱条件下具有相同的高效液相色谱峰特性。
另外经过对照品外标法定量测定,本研究成果所得的石杉碱甲产品纯度高于98%且高速逆流色谱工艺的目标成分回收率为81.3%。
4.结论
利用选定的溶剂体系——n-Hexane/n-BuOH/H2O(4:
1:
5)及优化后的高速逆流色谱工艺参数(700RPM正向洗脱、2ml/min及45℃),在分析与半制备型高速逆流色谱仪上,从千层塔植物提取物中分离制备获得了石杉碱甲单体。
工艺的分离周期较短、产品纯度高、分离量较大,而且经实验验证工艺的稳定性较高。
3.制备型高速逆流色谱分离中药中的生物碱
1 实验部分
1.1 仪器与试剂HSCCC2TBE300型高速逆流色谱仪,深圳同田生化有限公司.HD2212C2B核酸蛋白检测仪,上海康华生化仪器厂.R2201旋转蒸发器,上海申胜生物技术有限公司.LC210AT高效液相色谱仪,日本岛津色谱仪器公司.四氯化碳、氯仿、甲醇、正丁醇、乙酸均为国产分析纯,水为重蒸水,黄连、黄柏、十大功劳、金果榄购于杭州胡庆余堂.
1.2 样品的处理
把4种中药各1000g粉碎到20目,分别用工业酒精浸泡24h,连续3次,过滤,合并滤液浓缩后加适量盐酸酸化至pH=2,放置过夜,过滤的滤液再用NaOH碱化至pH=10,然后用氯仿萃取数次,氯仿浓缩得浸膏,该浸膏用于高速逆流色谱分离的样品.1.3 HSCCC溶剂系统选择溶剂系统以文献[1]中氯仿∶甲醇∶0.1mol/L稀盐酸组成最初的溶剂体系,按照各种比例混合,总体积为4mL,每次取样品10mg溶于溶剂体系,充分溶解后分层,取上下相分别点板(硅胶板,展开剂为∶正丁醇∶甲酸∶水=7∶1∶2),看两相中斑点的大小,最后发现当氯仿、甲醇、水的体积比为2∶1∶1时,斑点大小大约相等,所以选氯仿∶甲醇∶0.2mol/L稀盐酸=2∶1∶1为基本的溶剂体系,在分离时,针对不同的中药,添加适量的四氯化碳或改变溶剂的比例,组成各种溶剂体系对各种中药进行分离.
1.4 结构鉴定
文中经分离所得各组分用HPLC进行纯度测定,并用对照品进行比较,对照品购于中国生物制品药品鉴定所.
2 分离结果
2.1 黄连中生物碱的分离黄连为毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.,三角叶黄连C.deltoideaC.Y.ChengetHsiao或云连C.teetaWall.的干燥根茎,主要成分为多种生物碱,包括小檗碱(berberine),黄连碱(coptisine),甲基黄连碱(worenine),巴马亭(pal2matine),药根碱(jatrorrhizine)和表小檗碱(epiberberine)[2].溶剂体系为氯仿∶甲醇∶0.1mol/L稀盐酸=2∶1∶1,分离条件为进样量200mg溶于20mL的溶剂系统上相,流动相流速2mL/min,仪器转速800r/min,检测器波长254nm,进样时间4h,保留率为73.3%.分离结果如图1.我们用自动部分收集器进行收集,间隔时间为6min.由HPLC检测结果对照标准品后知组分I为巴马亭(50.9mg),组分II为小檗碱(71.1mg),组分III为表小檗碱(14.8mg),组分IV为黄连碱(25.6mg),组分V为未知物(7.2mg).图1 黄连中生物碱分离的高速逆流色谱图
图1 黄连中生物碱分离的高速逆流色谱图
2.2 黄柏中生物碱的分离
溶剂体系为:
氯仿∶甲醇∶0.2mol/L稀盐酸=2∶1∶1,将其室温下在分液漏斗中充分混合后静置分层(总体积1000mL),分离步骤和条件同黄连,进样4h后,停止主机转动,用氮气把固定相推出,测得保留比为71.4%.分离结果如图2,图中组分I为巴马亭(20.4mg),组分II为小檗碱(64.8mg),组分III为42羟基232甲氧基肉桂酸.
图2 黄柏中生物碱分离的高速逆流色谱图
2.3 十大功劳茎中生物碱的分离
溶剂体系为:
四氯化碳∶氯仿∶甲醇∶0.2mol/L稀盐酸=1∶3∶2∶2,将其室温下在分液漏斗中充分混合后静置分层(总体积2000mL),分离步骤和条件同黄连,进样4h后,停止主机转动,用氮气把固定相推出,测得保留比为71.2%.分离结果如图3,图中组分I为巴马亭(10.8mg),组分II为小檗碱(85.9mg).
图3 十大功劳中生物碱分离的高速逆流色谱图
2.4 金果榄中生物碱的分离
金果榄为防己科植物青牛胆Tinosporasagittata(Oliv.)Gagnep或金果榄TinosporacapillipesGag2nep的干燥块茎,其化学成分主要是巴马亭、药根碱等.其味苦、寒,具有清热解毒,利咽止痛等功效,用于咽喉肿痛、痱疽疗毒、泄泻、脘腹热痛等[5].溶剂体系为氯仿∶甲醇∶0.2mol/L稀盐酸=2∶1∶1,将其室温下在分液漏斗中充分混合后静置分层(总体积1000mL),分离步骤和条件同黄连,进样2h后,停止主机转动,用氮气把固定相推出,测得保留比为72.3%.经高速逆流色谱分离后显示有两个主要的峰(见图4),我们用自动收集器进行部分收集,间隔时间为6min,并用TLC进行检测,去掉组分重叠的试管.结果得到的组分II(图中第二个峰),经HPLC检测组分II的纯度大于99%.组分I为一混合物,组分II为巴马亭(16.8mg).
图4 金果榄中生物分离的高速逆流色谱图
3 结 论
制备型高速逆流色谱分离中药中的小檗碱类生物碱,采用氯仿∶甲醇∶水的相近体系,以有机相为移动相,水相为固定相,在转速为800r/min,流速为2mL/min的分离条件下,均能够在短时间内一次性分离出纯的单体生物碱,并且进样量可以达到200mg,故氯仿∶甲醇∶水体系,是分离中药中小檗碱类化合物的良好体系.
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