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苏木活性成分提取工艺优化
苏木中活性成分提取工艺的优化
摘要本文以苏木提取物中有效成分的含量和溶解性能为考察指标,采用加入抗氧化剂,有机溶剂萃取和真空干燥的方法对苏木中活性成分的提取工艺进行优化。
最终确定的提取苏木中活性成分的最佳工艺为:
煎煮法提取,浓缩,乙酸乙酯萃取,精制,真空干燥。
关键词苏木水提物巴西木素真空干燥
苏木(CaesalpiniaSappanL.)又名苏方、赤木、苏方木、棕木等,为豆科云实属植物,其干燥心材是我国的传统中药,分布在我国的云南、贵州、广西、广东、四川、台湾等地区[1]。
据文献记载,苏木具有消肿止痛,活血散结,抗菌消炎,利胆消石,祛痰,镇静等功效,主治血滞腹痛,产后瘀血,跌打损伤,半身不遂等病症[2]。
近年来,随着科学技术的发展,人类社会也相继出现各种各样的怪病奇症,并且在发现化学药物对这些疑难杂症的疗效并不明显后,人们把目光投向了中国传统的中药材,因此,作为中药材的苏木受到了研究者的关注,特别是在发现苏木的水提物具有抗癌作用[1-4],免疫抑制作用[5]后,对于苏木的研究开发更是被人们推上了一个前所未有的高度,掀起了一片研究热潮。
1.苏木的研究现状
1.1苏木的化学成分
作为中药材,成分复杂,种类繁多是其区别于西药的一大特点,因此,要想让中药材服务于人类医学方面,必须先了解其化学成分,寻找出活性成分,然后再根据其物理化学性质提取分离,制成制剂,应用于临床。
根据报道称,有人从苏木中发现并分离出了50多种化合物,并且通过药理实验确定其主要药效成分为酚类化合物,主要包括有巴西苏木素类、原苏木素类、查耳酮类、高异黄酮类衍生物等[6],此外,还有少量的芳香类化合物,有机酸,挥发油等成分[7]。
巴西木素是巴西苏木素类化合物的主要成分[8],含量约为苏木药材的2%[6]。
由于巴西木素是酚类成分,所以性质不稳定,在空气中容易被氧化,导致苏木中很多化合物都是巴西苏木素的衍生物,给分离提纯带来很大的困难。
前人对巴西苏木素的药理作用做了很多的研究,例如对小鼠的肝细胞保护作用的研究[9],抗补体作用的研究[10]以及免疫作用的研究[11]等,都得出结论,巴西苏木素具有很好的药理活性。
原苏木素类化合物包含有原苏木素A,B,C,D,E-1及E-2[6]等,也是苏木中的活性成分;高异黄酮类化合物包含有苏木酮类化合物及苏木醇类化合物,是苏木中的一类重要活性成分;查耳酮类化合物由于分离得到的少,所以对其的研究不多;另外,从苏木中还分离出了鼠李糖,商陆精,槲皮素等成分[12],还有少量的挥发油,甾醇类成分。
由此可知,苏木化学成分复杂,主要活性成分为酚类,因此对于苏木的研究主要集中于对其酚性成分的研究,但是酚类化合物易氧化,不易提纯,所以,建立一种针对其酚类成分的分离纯化方法至关重要。
1.2苏木的药理作用研究
20世纪70年代,国内外学者开始研究苏木的药理作用,据现有报道称,苏木具有多种药理作用,如抗肿瘤作用,镇静止痛作用,免疫抑制作用等[7]。
杨峰等人[5,13,14]通过实验得出,苏木在体外对SAC诱导过的人的B淋巴细胞的增殖具有很强的抑制作用,并且随着苏木用量的增加,其抑制效果更明显。
杨广等人[15]研究发现,苏木煎煮液具有抑瘤效果,并且苏木对肿瘤细胞的毒性作用有一定的选择性,而且给药途径也影响抑瘤效果,直接接触癌细胞或者腹腔给药效果好,其他途径如口服给药等却会影响抑瘤作用。
此外还有报道称,苏木水提物可以降血糖,镇静止痛,抗菌消炎等,这一切都说明了研究苏木的药理作用具有很好的前景。
1.3苏木的提取分离方法
中药成分复杂,常用的提取方法有回流法,煎煮法,浸渍法,渗漉法等。
回流法是指用乙醇等挥发性溶剂浸提药材成分,浸提液被加热,溶剂馏出后又被冷凝流回浸出器中浸提药材,这样周而复始,直至有效成分提取完全的方法。
该法由于浸提液受热时间较长,故不适用于受热易破坏的药材成分的浸出。
煎煮法是将药材加水煎煮取汁的方法。
该法是最早使用的一种简易浸出方法,至今仍是制备浸出制剂最常用的方法。
由于浸出溶媒经常用水,故有时也称为“水煮法”或“水提法”。
但是含挥发性成分或者有效成分遇热易分解的中草药不适宜用此法。
对于含有多糖的中草药,煎煮提取液比较粘稠,不容易过滤。
浸渍法是将中草药中的有效作用成分提取出来。
提取时将中草药溶解于溶剂中,以使其有效成分浸出。
选取溶剂时依照相似相溶原理。
但浸出率较低,如果用水溶解,提取液还会发霉变质,因此注意加入适当的防腐剂。
渗漉法是将适度粉碎的药材置渗漉筒中,由上部不断添加溶剂,使溶剂渗过药材层向下流动过程中不断浸出药材成分的方法。
另外,近年来又出现了超声波提取法,索氏提取法等。
目前对苏木的提取方法多采用水煎煮法和醇回流提取法等,四川大学的郭荣辉等人[6]对苏木的水提取工艺进行优化,考察了超声,索氏提取以及渗漉提取方法,结果表明苏木的水提取最佳工艺为,10倍量的水提取两次,每次都是4.5小时。
郭宝星[16]对苏木中苏木精的提取工艺进行了研究,得出了在常压下以去离子水作为萃取剂,从苏木心材提取苏木精的最佳工艺条件为:
1.常压下的微沸温度萃取;2.萃取3或4次;3.每次萃取30-35min;4.原料的最佳粒径为1-2mm。
吴慧慧[17]等优化苏木提取温度、时间、次数等,测试苏木染液的放置稳定性,酸碱稳定性。
结果表明:
苏木心材在提取前应进行粉碎,提取最优工艺:
提取温度100℃,每次提取60min,提取3次。
苏木提取液在酸性条件下较稳定,碱性条件下不稳定,变化很大。
对于提取后的纯化方法,目前常见到的用于中药的精制方法有柱层析法、分馏法、萃取法、盐析法、结晶及重结晶法等等。
可以根据所分离成分的不同化学性质选择相应的分离纯化方法精制。
苏木中化学成分繁多,但其主要以酚类成分为活性成分,用普通的方法不易分离,所以一般用的最多的是吸附柱层析法,然而,吸附剂的选择在很大程度上影响分离的效果,因此,要根据实验者的实验实际需求选择合适的、易得的、廉价的吸附剂。
郭荣辉[6]等人选用硅胶柱作为吸附剂,用不同极性的洗脱剂洗脱,从苏木的水提取物中洗出二十多种馏分,并且得出结论,洗脱剂极性越大,流出液的成分就越复杂,给后续分离带来很大困难。
1.4苏木的化学组成测定方法
苏木的主要药效成分是其酚类成分,因此,建立一种针对苏木中酚性成分的含量测定方法尤为重要。
目前,主要的定性定量分析方法有气相色谱法、高效液相色谱法、色谱联用技术、质谱法、分光光度法及毛细管电泳等方法。
赵焕新[18]等人建立了HPLC测定苏木的巴西苏木素和原苏木素B的含量的方法,用AgilentZorbaxXDBC18(150mm×4.6mm,5μm)作为色谱柱,甲醇-0.1%醋酸(20∶80)作流动相,1.0mL·min-1流速,280nm处检测波长,结果巴西苏木素和原苏木素B均有较好线性关系,线性范围为0.025-0.50mg·mL-1,r都是0.9994,回收率分别是为95.44%(RSD=2.57%),94.69%(RSD=1.38%),结果表明,新建方法快速、准确、简单、适用于这两种成分的测定。
1.5存在问题
目前已建立的多种提取苏木化学成分的方法,如渗漉、索氏提取,超声波提取,煎煮,回流等,纯化方法多为柱层析法,但此类方法只是考察技术指标的可行性,对方法的经济指标,回收率方面未有明确考察,而且在试验中发现苏木提取物的水溶液易产生沉淀,给苏木的实际应用带来许多不便,因此,建立一种快速可行又准确可靠,节约成本,可解决苏木提取物水溶液易产生沉淀这许多问题的提取工艺,不仅可以推动对苏木的进一步研究,还可以为中药的药效成分提取提供参考。
综上所述,苏木是一种很有研究价值的中药,其活性成分具有多种药理作用,在临床上更是应用于治疗多种疾病,尤其是在治疗肿瘤方面具有很强的潜在价值,因此,对苏木的研究已经成为当今医药行业的一个热门课题,但是,苏木所含化学成分繁多,分离方法不完善,为科研带来许多不便,于是,尽早完善苏木中活性成分的提取工艺就成为目前工作的重中之重。
本文以苏木提取物中有效成分的含量和溶解性能为考察指标,采用加入抗氧化剂Vc,有机溶剂萃取和真空干燥的方法对苏木中活性成分的提取工艺进行优化。
最终确定的提取苏木中活性成分的最佳工艺为:
煎煮法提取,浓缩,乙酸乙酯萃取,精制,真空干燥。
本工艺所使用原料成本低,可循环利用,且操作简便,易于实现工业化生产。
为进一步开发苏木药用制剂提供参考。
2.实验部分
2.1仪器与材料
Waters1525高效液相色谱仪(美国Waters公司),2996PDA检测器,Empower色谱工作站;分析天平(SartoriusBS,Satrorius公司),旋转蒸发仪(R2002,杭州瑞佳精密科学仪器有限公司),真空干燥箱(DZF-0,上海跃进医疗器械厂),电热套(KDM,山东光华仪器厂),苏木(购自山西省药材公司,经山西省药品检验所鉴定);巴西苏木素对照品(购自成都曼思特生物科技有限公司,纯度大于99%);甲醇为色谱纯;水为娃哈哈纯净水;其余试剂为分析纯。
2.2实验方法
2.2.1提取过程加入Vc
分别称取两份苏木药材,各20g,分别加入160mL蒸馏水,1号加入1gVc,2号不加,浸泡过夜。
分别煎煮提取三次,每次1h。
1号每次提取前均加入1gVc,2号不加。
合并三次提取液,减压旋蒸,浓缩至20mL,放入冰箱冷藏过夜。
将浓缩液过滤,滤液各加40mL乙酸乙酯萃取,振摇,静置1h。
有机层加无水硫酸钠干燥后,减压旋蒸得粗粉,称量粗粉质量。
取所得粗粉,分别加6倍量水溶解,过滤,然后每次加滤液5倍量的混合萃取剂(乙酸乙酯:
石油醚=2:
1),萃取两次,将有机层合并,加无水硫酸钠干燥后减压旋蒸,得精制干粉。
分别取所得精制干粉,配制成4.8%的水溶液,微孔滤膜过滤后置冰箱中冷冻过夜,解冻后观察现象。
同时HPLC外标法计算有效成分的含量。
结果见表1,图1,图2。
2.2.2萃取过程加入Vc
分别称取3份粗粉,各5g,分别加入10mL水溶解,冷冻过夜;解冻后过滤,滤液分别加Vc至饱和,然后每次加混合萃取剂(乙酸乙酯:
石油醚=2:
1)50mL,萃取两次,将有机层合并,加无水硫酸钠干燥后减压旋蒸得精制干粉;称取适量干粉均配成4.8%水溶液,微孔滤膜过滤后冷冻过夜,解冻观察现象。
结果见表2。
2.2.3提取和萃取过程均加入Vc
分别称取三份药材各50g,均加400mL水,1,2号不避光,3号避光,浸泡过夜;将浸泡液煎煮提取三次,每次30min,1号每次提取前都加入4gVc;合并三次提取液,浓缩至50mL,过滤,1号滤液加入0.5gVc,然后三份滤液分别加入100mL乙酸乙酯萃取;有机层经无水硫酸钠干燥后,减压旋蒸得粗粉,称重。
将粗粉加10倍量水溶解,过滤,1号按0.01g/mL加入Vc;然后三份分别加入滤液2倍量的混合萃取剂(乙酸乙酯:
石油醚=2:
1)萃取一次,有机层经无水硫酸钠干燥后,减压旋蒸得精制干粉。
分别取所得干粉,配制成4.8%的水溶液,微孔滤膜过滤后置冰箱中冷冻过夜,然后解冻观察现象;将上述溶液稀释100倍,HPLC归一法测定巴西苏木素纯度。
结果见表3,图3,图4,图5。
2.2.4考察不同萃取剂纯化效果
称取精制后的干粉10g(外标法纯度52.55%),加入10倍量水溶解,过滤,滤液等分成10份,每份分别加入15mL的1,2-二氯乙烷,二氯甲烷,氯仿,苯甲醚,甲苯,异辛烷,正己烷,丙烯酸乙酯,乙酸乙酯,乙醚萃取,摇匀静置,然后吸取各有机相溶液适量,进行薄层色谱分析,在紫外灯下观察。
结果见图6。
1,2-二氯乙烷萃取物HPLC图见图7。
2.2.5考察不同体积萃取剂的纯化效果
称取精制后的干粉3.0g,加入10倍量水溶解,过滤,滤液等分成3份,每次加入50mL1,2-二氯乙烷萃取,1号共萃取4次,2号萃取6次,3号萃取8次;水相再分别加入20mL乙酸乙酯萃取,有机层经无水硫酸钠干燥后减压旋蒸得干粉,称量干粉质量。
分别取所得干粉,配制成4.8%的水溶液,微孔滤膜过滤后置冰箱中冷冻过夜,然后解冻观察现象;将上述溶液稀释100倍,HPLC归一法测定巴西苏木素纯度。
结果见表4。
2.2.6考察真空干燥除沉效果
取适量精制干粉(外标法纯度55.36%)置于真空干燥箱中,60℃下干燥48h,然后将干燥后的干粉加适量水,配制成4.8%的水溶液,微孔滤膜过滤后置冰箱中冷冻过夜,解冻后观察现象;同时HPLC外标法测定有效成分的含量。
2.3分析条件及方法
2.3.1薄层色谱法分析
2.3.1.1色谱条件
薄层板:
硅胶G(5×10cm,青岛海洋化工厂);展开剂:
氯仿:
丙酮:
甲酸=8:
4:
1。
2.3.1.2分析方法
吸取待测溶液适量,分别点于同一硅胶G板上,以氯仿:
丙酮:
甲酸(8:
4:
1)为展开剂上行展开,待达到溶剂前沿后取出,在紫外光下观察分离情况。
2.3.2高效液相色谱法分析
2.3.2.1色谱条件
色谱柱为AgelaVenusilXBP-C18(4.6mm×150mm,5μm,Agela公司);流动相A相为甲醇,B相为体积分数0.2%甲酸水溶液,梯度洗脱(0~30min:
18%A;30~50min:
18%A→50%A;50~55min:
50%A),流速为1.0mL/min,柱温为35℃,进样量20μL,检测波长为285nm。
2.3.2.2分析方法
分别取待测溶液5µL,依次注入液相色谱仪,以甲醇-0.2%甲酸水(28:
72)为流动相等度洗脱,在290nm下检测。
3.结果与讨论
3.1提取过程加入Vc
按2.2.1节方法进行实验,结果见图1,图2和表1。
图1提取过程加入Vc
图2提取过程不加Vc
表1提取过程加入Vc实验结果
项目
1号(+Vc)
2号
药材质量/g
20g
20g
粗粉质量/g
0.8154g
0.79552g
精粉质量/g
0.3595g
0.30074g
提取率%
1.80%
1.50%
外标法纯度%
43.26
32.24
4.8%水溶液
少量沉淀
大量沉淀
由表1可得出提取过程中加Vc可以改善干粉溶解性能,且有效成分含量较高。
3.2萃取过程加入Vc
按2.2.2节方法进行实验,结果见表2。
表2萃取过程加入Vc实验结果
项目
1号
2号
3号
粗粉质量/g
5.0
5.0
5.0
精粉质量/g
1.7895
1.7620
1.8078
回收率%
35.79
35.24
36.16
4.8%水溶液
红色油状沉淀
红色油状沉淀
红色油状沉淀
由表2可知,只在萃取过程中加入Vc效果不明显。
3.3提取和萃取过程均加入Vc
按2.2.3节方法进行实验,结果见图3,图4,图5和表3。
表3提取和萃取过程均加入Vc实验结果
1号(光照+Vc)
2号(光照无Vc)
3号(避光无Vc)
药材质量/g
50
50
50
粗粉质量/g
2.1346
1.3697
1.0800
精粉质量/g
0.4747
0.2562
0.1886
提取率%
0.95
0.51
0.38
外标法纯度%
65.88
63.20
59.24
4.8%水溶液
微量沉淀
红色油状沉淀
红色油状沉淀
由表3可得避光对溶解性能没有明显改善;在提取和萃取过程中均加入Vc可明显改善溶解性能,且有效成分含量较高。
光照+Vc
图3光照+Vc
光照无Vc
图4光照无Vc
避光无Vc
图5避光无Vc
3.4选用不同萃取剂考察除沉淀效果
按2.2.4节方法进行实验,结果见图6,图7。
图6薄层色谱图
---注:
其中第1个点为水溶液,作对照,其余顺序依次为:
1,2-二氯乙烷;二氯甲烷;氯仿;苯甲醚;甲苯;异辛烷;正己烷;丙烯酸乙酯;乙酸乙酯;乙醚。
将有机相进行薄层色谱分析,展开剂:
氯仿:
丙酮:
甲酸=8:
4:
1
由上图6可得出1,2-二氯乙烷和氯仿萃取效果好,但氯仿毒性很大,所以选用1,2-二氯乙烷做萃取剂。
1,2-二氯乙烷萃取物HPLC图见图7.
图71,2-二氯乙烷萃取物HPLC图
由上图可知,1,2-二氯乙烷萃取除去的主要为极性相对较小的杂质,多次萃取应可以提高有效成分的含量,改善溶解性能,所以选用不同体积的萃取剂进行萃取。
3.5考察不同体积的萃取剂萃取后的除沉效果
按2.2.5节方法进行实验,结果见表4。
表4不同体积的萃取剂萃取结果
20倍
30倍
40倍
干粉质量/g
1.0000
1.0000
1.0000
萃取次数
4
6
8
精粉质量/g
0.2076
0.2069
0.1886
回收率%
20.76
20.69
18.86
纯度%
68.95
68.05
69.48
溶解性能
微量沉淀
少量沉淀
大量沉淀
由上表4可得出,萃取次数越多,沉淀越多,与预期结果相反。
因此推测原因是由于残留溶剂的影响。
3.6考察真空干燥除沉效果
将真空干燥后的干粉配制成4.8%的水溶液解冻后无沉淀,且HPLC检测有效成分的含量为59.43%。
结果表明:
真空干燥后,干粉的纯度和溶解性能均有极大改善,说明沉淀的形成主要是由于残留溶剂导致的,只要残留溶剂去除彻底,就可以有效去除沉淀。
4.结论
本实验采用在传统工艺的基础上加入抗氧化剂,使用有机溶剂萃取等手段来提纯目标产物,改善溶解性能,最终确定的提取苏木中活性成分的最佳工艺为:
煎煮法提取,浓缩,乙酸乙酯萃取,精制,真空干燥。
本工艺所使用原料成本低,可循环利用,且操作简便,易于实现工业化生产,为进一步开发苏木药用制剂提供理论依据。
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OptimizationofSappanactivecompositionofextractionprocess
Abstract:
WiththecontentanddissolvingperformanceofactiveingredientsintheextractiveofCaesalpiniasappanlignumasitsindication,thisthesisappliesthewayofaddingantioxidantVc,extractingorganicsolvent,dryinginvacuumenvironmentinabidtooptimizethetechnologicalprocessofextractingactivecompositionsinCaesalpiniasappanlignum.Finally,theoptimizedprocessofextractingactivecompositioninCaesalpiniasappanlignumissettledasthefollowingprocess:
extractingbydecoction,condensing,leachingethylacetate,refining,dryinginvacuum.Asboastingtheadvantagesofcheaprawmaterial,recycle,handyoperation,theabovementionedprocessisbeneficialtorealizetheindustrializationofproduction.
Keywords:
AqueousextractoflignumsappanBrazilinVacuumdrying
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