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宏基因组

1宏基因组学的产生、发展和概念

　　1.1宏基因组学的产生背景

　　人类基因组计划（humangenomeproject,HGP）的完成促使了基因组功能性研究计划的开展，并推动从结构基因组学研究时代进入功能性基因组研究为主的后基因组时代，人体基因的功能研究成为生命科学领域的研究热点。

但是越来越多的研究表明，人体的生理代谢和生长发育不仅受自身基因控制，还与其他生物基因组相关；对疾病的易感性、药物反应等许多现象，也无法全部用人体基因差异来解释。

已证明体内菌群的组成和活动与人的生长发育、生老病死息息相关，例如人类胃溃疡发病机制和病因与寄生在胃里的微生物的致病作用有关。

因此，必须考虑与人类长期共生的微生物群体对人类的影响。

　　此外，自然界现存的物种数量以万亿计，包括人类、大量的高等动物、植物和微生物。

世界上的万物是彼此依赖、相互作用、相互制约和相互促进，形成共生、共存和协调平衡发展的欣欣向荣局面。

要想了解生命的起源、本质、进化和相互作用及影响，就必须对彼此密切相关的生物进行各个基因组学及其相互关系的研究。

这种研究超越了传统意义上单一物种的基因组学分析，研究对象复杂、范围更广而方法要更新，它要求在基因学、基因组学的基础上有新的学科来承担这一新的任务。

因此，21世纪人类提出了生态基因组学（ecogenomics）的概念[3]。

它要求对特定环境下多种生物的基因组进行研究，这将有助于揭示生命现象的本质，发现新的基因和确定人类疾病的病因。

　　1.2宏基因组学的发展与概念

　　宏基因组学的发展经历了环境基因组学、微生物基因组学、宏基因组学到人类宏基因组学的阶段。

　　1.2.1环境基因组学的提出与发展

　　1991年Pace首次提出环境基因组学（environmentalgenomics）的概念，并在同年构建了第一个通过克隆环境样品中DNA的噬菌体文库，环境基因组学（亦称微生物环境基因组学）的研究受到广泛关注[23]。

1998年美国国立环境卫生科学研究所启动了环境基因组计划（environmentalgenomeproject,EGP），开展有关人体遗传变异与环境胁迫相互关系的研究，引起各国科学家的极大关注，标志着生命科学界将在更深层次上对环境与基因相互作用对人类健康的影响进行系统全面的研究[34]。

环境基因组学第一次提出特定生态条件下，全部生物基因组总体概念，这是基因组学的重要进展。

　　1.2.2微生物基因组学与宏基因组学概念的提出

　　环境是一个相互作用的复杂体系，又是一个不断变化的动态过程，该体系的生命与非生命的两个方面是不断互为因果，相辅相承的。

为了方便研究，人类把精力集中到特定环境的微生物群体上来。

Handelsman等[1]于1998年提出生命研究对象应是生物环境中全部微小生物的基因组（thegenomesofthetotalmicrobiotafoundinnature），首次提出针对特定环境样品中细菌和真菌的基因组总和进行研究的这一宏基因组（metagenome）概念，指出应用宏基因组学研究微生物复杂群落基因组的方法将成为快速发展的领域。

2007年3月，美国国家科学院以“环境基因组学新科学——揭示微生物世界的奥秘”为题发表咨询报告，指出宏基因组学为探索微生物世界的奥秘提供新的方法，这是继发明显微镜以来研究微生物方法的最重要进展，将是对微生物世界认识的革命性突破。

报告呼吁建立全球宏基因组学研究计划，建议大批量启动中小型宏基因组学研究项目，对自然环境微生物群落（如海水或土壤）、寄生微生物群落（如人体肠胃或口腔）、人为控制环境微生物群落（如污水处理厂或水产养殖厂）等展开研究；启动少量大型综合性项目，对宏基因组学研究方法、技术路线、理论框架和更为复杂的动态微生物系统进行研究[8]。

　　1.3宏基因组学的概念

　　宏基因组（metagenome）和宏基因组学（metagenomics）的概念尚待统一，其中的“宏”所对应的英文是前缀“meta”，它源于希腊语，作为构词成分意思是超越（overrach）、在上（above）、在外（beyond）、在后（behind）等，它具有更高层次组织结构和动态变化的含义，在metagenome中有更高级、更复杂的意思。

国内一般翻译为“宏”或“元”，形象表明其涵盖范围的广泛性。

本文采用较为普遍的宏基因组/宏基因组学译法（注：

国外有人还称为Ecogenome/Ecogenomics，译为生态基因组/生态基因组学）。

　　1.3.1广义宏基因组学的概念

　　广义宏基因组是指特定环境下所有生物遗传物质的总和，它决定了生物群体的生命现象。

它是以生态环境中全部DNA作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物，研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，并揭示其规律的一门科学。

宏基因组学使得人们摆脱了物种界限，揭示了更高层次上的生命运动规律。

　　1.3.2狭义宏基因组学概念

　　狭义宏基因组学则以生态环境中全部细菌和真菌基因组DNA作为研究对象，它不是采用传统的培养微生物的基因组，包含了可培养和还不能培养的微生物的基因，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物，研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，并揭示其规律。

如1998年Handelsman等提出土壤宏基因组学的定义是：

土壤微生物群体的全部基因组，并对其进行克隆和功能分析[1,8]。

由于狭义宏基因组学概念的对象具体、范围局限和研究目标明确，一般文献上所提的宏基因组学，除非特别指明，一般均指的是狭义宏基因组学。

　　1.3.3人类宏基因组学

　　人体内部或体表有数以万亿的微生物个体存活，包括细菌、古细菌、真菌、寄生虫和病毒等。

这些微生物占人体总重量的1%-2%，成人体内细胞约有90%为微生物细胞，其余约10%为人体细胞，因此从某种意义上说一个完整、健康的成年人是诸多物种组成的复合体。

人体内共生的菌群包括肠道、口腔、呼吸道、生殖道等处菌群。

其中许多微生物对人体健康维持有重要作用，帮助消化食物，制造维生素。

大多微生物具有许多独特的生物功能，如有些微生物具有独特功能的一些酶，对各种复杂有机化合物有降解作用，有些微生物可以在一些极端环境下生存等等。

同时，还有一些微生物则可能导致人体疾病。

然而，目前对健康和疾病状态下这些细菌、真菌和其他微生物的作用还知之甚少。

国际学术界把多种微生物聚居在一起形成的系统叫做“微生物群落”，也称菌群。

把人体内所有微生物菌群基因组的总和称为“人体宏基因组”（humanmetagenome）。

人类宏基因组学（humanmetagenomics）则是研究人体宏基因组结构和功能、相互之间关系、作用规律和与疾病关系的学科。

它不仅要把总体基因组序列信息都测定出来，而且还要研究与人体发育和健康有关的基因功能。

2004年，美国国立卫生研究院专门设立“利用宏基因组学研究口腔微生物”的研究项目，2006年春季召开会议，正式成立人类宏基因组计划国际联盟，启动人类宏基因组计划，作为协调这一宏大科学计划的国际组织[3,8]。

人类宏基因组计划又称“人类第二基因组计划”，它相当10个人类基因组计划工作量，其规模和广度将远远超过人类基因组计划。

人类宏基因组计划目标是：

把人体内共生菌群的基因组序列信息都测定出来，而且要研究与人体发育和健康有关的基因功能。

该计划可能发现超过100万个新基因。

该计划完成后，将对阐明人类许多疾病的发生机理、研究新药物、控制药物毒性等产生巨大作用。

科学家认为，人类基因组和人类宏基因组这两本“天书”绘制完成后，将有助于更好地破解人类疾病。

2007年12月19日美国国立卫生研究院正式宣布启动一项新的基因工程——人体微生物群系计划（humanmacrobioticproject,HMP）。

人类微生物组学（humanmicrobiomics）是对人体内或者表面存在的所有微生物的总体进行研究。

显然这和宏基因组学的概念、策略和研究方法一致，人类宏基因组学正式与人类医学研究联系在一起。

　　2宏基因组学研究的策略和基本过程

　　2.1宏基因组学的研究策略

　　宏基因组学的研究还处于初期发展阶段，但其研究的基本过程和基本策略已基本清楚。

在此要强调的是，宏基因组学研究有着明确的指导思想，它是在反向生物学原则指导下，基于特定生态环境基础上，依据整体、系统、动态变化和相互作用的观点，运用特殊的技术路线和方法，对研究范围中所有基因组展开研究的学科。

“宏基因组学”是一种整体性的研究策略，它建立在微生物基因组学的迅速发展和聚合酶链式反应广泛应用的基础之上，是一种不依赖于人工培养的微生物基因组分析技术，涵盖了生物信息统计分析和基因组两方面的意义和技术，其策略是从特定环境中直接分离所有微生物DNA，将大片段的DNA克隆到受体菌中表达，然后根据某些生物活性筛选有应用价值的克隆。

包括两个方面[920]：

①宏基因组文库的构建：

宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和对策。

一般包括样品总DNA的提取、与载体连接和在宿主细胞建立中克隆[17]。

②宏基因组文库的筛选：

根据其研究目的，宏基因组文库筛选通常有功能筛选（functionalscreening）和序列筛选（sequencebasedscreening）两种方法。

　　2.2宏基因组学的研究步骤

　　基因组学的研究过程，一般包括从环境样品中提取基因组DNA，克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的克隆等4个步骤。

特别要指出的是，在基因组学研究领域中，其研究目标通常是测定单一物种的基因组序列；而在宏基因组学中，则是要测定由多种微生物组成的复杂群体（community）的混合基因组序列。

这种差别的关键就是，绝大多数细菌是不可培养的，因此没有足够的研究材料。

　　2.2.1分离特定环境生物DNA

　　方法上不同于传统的先培养微生物再提取DNA的做法，而是首先直接收集能够代表特定生物环境生物多样性的样品；然后利用各种理化方法破碎微生物，使其释放DNA，再利用密度梯度离心等方法进行分离纯化。

　　2.2.2纯化的大分子量DNA进行克隆

　　在对DNA酶切或者超声打断处理，并与合适的载体DNA进行连接，构建重组体。

　　2.2.3将带有宏基因组DNA的载体通过转化方式转入模式微生物建立各自的无性繁殖系

　　例如转入大肠埃希菌中，使那些以前无法研究的不可培养微生物的DNA在模式微生物中得到复制、表达，进而得到研究。

所有带有宏基因组DNA载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。

　　2.2.4对宏基因组文库的DNA进行分析

　　基于不同的研究目的，有很多分析方法，主要分为两类：

一类为表型功能筛选，即利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因。

例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。

功能分析法根据重组克隆产生的新活性进行筛选，可用于检测编码新型酶的全部新基因或者获取新的生物活性物质。

另一类为序列基因型分析，即对文库中所有或部分的DNA进行测序分析，以应用于生态学研究。

例如分析文库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。

一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，及尽可能多地分析DNA序列所编码的信息。

　　3宏基因组学的技术方法

　　宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。

宏基因组学的研究策略和方法大致相同，现按照宏基因组学研究的基本过程和策略对常用方法和技术予以简要介绍。

　　3.1样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集

　　提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，尽可能代表自然状态下的微生物原貌，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。

要采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇[45]。

所以总的提取总是在最大提取量和最小剪切力之间折中。

应严格操作，谨防污染，并且保持DNA片段的完整和纯度。

已有许多商品化宏基因组DNA提取试剂盒可用，同时很多实验室仍致力于宏基因组DNA提取方法的改进[68]。

常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法（细胞提取法）。

直接裂解法是将环境样品直接悬浮在裂解缓冲液中处理，继而抽提纯化，包括物理法（如冻融法、超声法、玻璃珠击打法、液氮研磨法等）和化学法、酶法等。

不同直接裂解法的提取方法差别在于细胞破壁的方式不同。

此法操作容易、成本低、DNA提取率高、重复性好，但由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小（1-50kb），难以完全去除酚类物质。

细胞提取法先采用物理方法将微生物细胞从环境中分离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA，如先采用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA。

此法可获得大片段DNA（20-500kb）且纯度高，但操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物DNA也不容易抽提出来。

　　为了更好地反映环境中的微生物种群并且提高阳性克隆的占有率，需要在克隆之前通过不同的方法对感兴趣的目的基因或基因组进行富集[911]，一个比较好的富集方法是稳定同位素示踪技术[12]。

抑制性消减杂交技术[13]是抑制性与消减杂交技术相结合的更简单、更快速的分离差异基因的方法。

该方法不仅利用了消减杂交技术的消减富集，同时也利用了抑制性技术进行了高效率的动力学富集，所以该技术是一项富集特定基因、证实微生物之间基因不同的非常有用的技术方法。

　　3.2宏基因组文库的建立

　　宏基因组文库的构建策略取决于研究的整体目标。

偏重于低拷贝、低丰度基因还是高拷贝、高丰度基因要取决于研究的目的是单个基因或基因产物还是整个操纵子及编码不同代谢途径的基因簇。

基因文库的建立过程中需要选择合适的克隆载体和宿主菌株。

传统的方法是直接利用表达载体构建宏基因文库，但是表达载体可插人的宏基因片段一般小于10kb。

克隆中宿主菌株的选择主要考虑到转化效率、宏基因的表达、重组载体在宿主细胞中的稳定性以及目标性状的筛选等。

目前大肠杆菌是最为常用的宿主[14]，此外，链霉菌和假单胞菌也可以作为构建文库的宿主，不同微生物种类所产生的活性物质有明显差异，不同的研究目标应选择不同的宿主菌株。

　　3.3宏基因组文库的筛选

　　由于环境基因组的高度复杂性，需要通过高通量和高灵敏度的方法来筛选和鉴定文库中的有用基因。

筛选技术大致可分为四类:

①基于核酸序列差异分析；②基于目的克隆功能的特殊代谢活性；③基于底物诱导基因的表达；④基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内的其他技术。

　　3.3.1基于序列的筛选方法

　　通常根据已知相关功能基因的保守序列设计探针或PCR引物，通过杂交或PCR扩增筛选阳性克隆。

用这种方法有可能筛选到某一类与已知序列相近的新基因，这一策略可以分离已知基因家族的新成员和含有高度保守区的酶基因[1516]。

另一种方法是对含有16SrRNA等系统进化锚定基因的克隆进行测序或对文库随机测序[17]。

优点是不必依赖宿主菌株来表达克隆基因，缺点是必须对相关基因序列有一定的了解，文库中那些和现有基因序列完全不一样的基因无法被筛选，故难以发现全新的活性物质，对鉴定新的基因成员有一定的局限性，也很难获得全序列。

直接序列分析法（sequencedrivenscreeningmethod）是对所构建宏基因组文库的克隆进行随机测序分析，显然可以得到最多的信息[1820]。

也可用鸟枪法对宏基因组文库进行测序，但需要进行大量的测序和分析工作，需大量人力、物力及财力。

虽然DNA序列分析技术不断发展，但与个体微生物基因相比，宏基因组文库包含着巨大的序列片段，但对这些序列片段进行后续的分析则极为困难，结合其他的筛选方法可以得到更多的信息。

　　用微阵列技术（基因芯片）进行初步筛选，可以很大程度上减少测序量和后续的序列拼接等工作量。

但微阵列技术在用于宏基因组文库筛选时，除了其本身由于交互杂交等导致的特异性低、灵敏度较差等缺点外，同样不能用于对未知功能基因的筛选，且检测不到环境中存在的那些低丰度微生物的序列[2122]。

　　3.3.2基于功能的筛选方法

　　功能性筛选法是以活性测定为基础，通过建立和优化合适的方法从基因组文库中获得具有特殊功能的克隆，然后通过序列和生化分析研究这些克隆。

由于基于活性的筛选不需要已知序列的信息，故能较快地找到可用于工农业和医药的蛋白质和天然产物。

功能性筛选的方法有两种，一种是对具有特殊功能的克隆子进行直接检测，如利用其在选择性培养基上（如含有化学染料和不可溶的或发光的酶反应底物）的表型特征进行筛选[23]。

这种方法具有较高的灵敏度，可检测到较少的目的克隆。

另一种方法是基于异源基因的宿主菌株与其突变体在选择性条件下功能互补生长的特性进行[24]。

　　功能性筛选法的优点是筛选过程比较简单、快速，只要基因能表达，就可以根据基因表达特性进行筛选，不需要复杂的实验过程。

不足之处是这种筛选方法依赖于目的基因在新的宿主中表达，但使用模式微生物并不能把所有的宏基因组DNA表达出来，而且要求克隆到基因或基因簇的全长，一旦克隆过程中破坏基因某个组件将使得基因没法表达，也就不能根据功能进行筛选，故检出的概率很低，工作量大，往往从上万个克隆中只能筛选到几个有用的克隆。

　　3.3.3底物诱导基因表达筛选（substrateinducedgeneexpressionscreening,SIGEX）

　　SIGEX是用于能利用各种底物诱导的分解代谢型基因的检出，并结合生物发光技术用来筛选代谢相关基因及酶基因[25]。

由于编码相关代谢基因或酶基因通常呈簇存在，通常与该物质诱导的启动子和同源转录调控序列毗邻，往往在有底物诱导的条件下才表达，反之则不表达。

首先构建一个含有绿色荧光蛋白（GFP）的表达载体，这个载体可将宏基因组DNA克隆到GFP基因上游，使该基因的表达受到宏基因组DNA片段中的启动子调控。

当外加目标底物时，可以影响GFP的表达，进而通过活细胞荧光分离技术（fluorescenceactivatedcellsorting,FACS），在添加特定底物的条件下对表达库进行筛选，就能够得到对该底物具有代谢活性的克隆。

　　SIGEX在宏基因组研究中具有很多优势，它提供了一个有效的和经济的检测手段，大大增加了筛选的容量和效率，节省了时间，为高通量筛选提供了保障，而且不需要对在颜色筛选中使用的底物进行修改，勿需担心因修改底物而产生毒性；且可以从底物来推断得出未知的酶，继而推断基因的功能。

而SIGEX法的不足之处是目标基因的结构性和适应性很敏感，同时，无法用于分析不能进入细胞质的底物，而且FACS对进样设备的要求也比较高；代谢特定底物的调控子和操纵子在位置上不一定都相邻；同时有些基因的表达除了受底物诱导外，还可能受其他因子的诱导，而有些基因并不需要诱导，是本底水平表达的，有些可诱导基因在新的宿主中有可能不可被诱导表达。

但是考虑到宏基因组文库中含有大量的基因，其中必然有一部分是可诱导的，是可以被该技术检测到的。

所以只要对这些不足之处进行优化，选择合适的条件，SIGEX法仍然是一种宏基因组文库筛选的有效方法，尤其适合于在工业上使用[26]。

　　3.3.4基于稳定性同位素技术筛选方法

　　具有相同原子序数但不同中子数目且不具放射性的元素称为稳定同位素（stableisotopeprobing,SIP）。

环境中的许多物质都可以用SIP来标记，鉴定和分析复杂样本中进行有特殊代谢功能的微生物[27]。

　　3.3.5荧光原位杂交技术

　　荧光原位杂交（fluorescentinsituhybridization,FISH）是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞。

FISH技术已经用于不同生态系统的研究中，应用稳定同位素技术可以对环境中某些活性微生物的核酸进行富集，进而构建宏基因组文库，更有利于寻找未培养微生物的功能基因[28]。

　　3.3.6其他筛选策略

　　常规的PCR、分子杂交、抗原抗体反应等技术也可以用于筛选，也有公司开发出了专门筛选某些酶、蛋白等的试剂盒，在食品工业、医药等领域有较好的应用前景。

此外，在构建文库之前对样品有目的进行富集，然后提取样品DNA构建文库，这也可以提高目的克隆的数量。

　　当前宏基因组学技术中最大缺陷是文库的表达问题，模式微生物并不能把所有的宏基因组DNA表达出来，降低了表型筛选的效率。

宏基因组表型筛选的效率很低，从上万个克隆中一般只能筛选到几个有用的克隆。

这表明宏基因组学的提出虽然带来观念上极大的突破，但受限于技术瓶颈，还未在实际工作中产生理论上可能带来的巨大成果。

但有理由相信，随着分子生物学技术的发展，宏基因组学研究必然成为今后若干年自然科学研究的一个重要领域。

　　4宏基因组学的应用

　　宏基因组学代表了一个研究自然环境样本中生物多样性的强大工具。

从宏基因组文库中获得的信息可以大大地丰富有关工农业、医学以及环境生态等诸多领域的认识，并带来很多应用可能。

宏基因组学研究在短短几年内，已渗透到包括农业、土壤、林业、海洋、人体医学、药物等各个领域，并在替代能源、环境修复、生物技术、生物防御、哲学及伦理学等各方面，显示了重要的价值[2931]。

　　4.1宏基因组学在基础微生物学研究中的应用

　　4.1.1发现新基因

　　由于自然界中大多数微生物物种及其生物量是未知的，其中存在大量不可培养的微生物，无法通过培养法进行研究，而宏基因组学的策略则突破了这一束缚。

通过构建宏基因组文库，而且从中鉴定出的大多数基因将都是新的基因[3234]。

即使是对一个相对较小的宏基因组文库进行筛选，所获得的序列与已公布的数据库中的序列的相似性也很低。

如利用宏基因组文库，已发现的新基因主要有：

生物催化剂基因、抗生素抗性基因以及编码转运蛋白基因等。

　　4.1.2开发新的微生物活性物质

　　在地球各种环境中，多达99%的微生物因为不能培养而无法了解。

有数据表明，其中蕴含着巨大的应用潜能——其代谢产物中可能有众多具有应用开发价值的化合物。

如何研究并开发利用这些不可培养微生物，成为重要而又急迫的任务。

近年来，由于极高的重复发现率，利用纯培养技术从环境微生物中筛选到新活性物质的几率显著下降。

宏基因组学则为新微生物活性物质的开发提供了新思路。

目前通过采用土壤、海水、海洋浮游生物、海绵、甲虫、人唾液等环境样品，成功构建了宏基因组文库，筛选到多种新的活性物质如各种酶类及一些次生代谢产物等，将宏基因组文库筛选和基因改组等基因工程技术结合起来，在开发新的微生物活性物质方面具有巨大潜力[3537]。

　　4.1.3研究微生物群落结构及其功能

　　宏基因组学为认识由可培养和不可培养微生物所构成的复杂生境及其功能提供了可能，且必将在研究生物多样性中发挥重要作用。

运用宏基因组技术对海洋病毒已有较深入的研究，为探寻复杂微生物群落中的感应信号分子及其基因调节机制，探知微生物物种在群落中的功能打下基础[3840]。

　　4.2宏基因组学在农业微生物研究中的应用

　　近年来发展起来的宏基因组学利用分子生物学的研究方法绕过培养方法来研究微生物的多样性及功能，为土壤微生物研究开辟了新的道路。

土壤中多数微生物不可培养，这限制了微生物资源的开发利用。

宏基因组学方法在开发