中国动物药材DNA条形码数据库.docx
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中国动物药材DNA条形码数据库
中国动物药材DNA条形码数据库
[摘要]课题组联合相关研究者开展动物药材DNA条
形码分子鉴定研究,并结合分析GenBank序列,采用BLAST
分析防错、系统树分析防错和BarcodingGap检验防错等方法核验序列的可靠性,构建了中国动物药材DNA条形码数据库。
该库由样品数据库、序列数据库和文献数据库组成,
包含800余种动物药材和大量动物药材混伪品及密切相关物
条形码鉴定系统()进行网络访问并实现未知动物样本的DNA条形码鉴定。
该研究首次构建统一的中国动物药材DNA条形码数据库,对动物药材鉴定、资源可持续利用和濒危物种保护均有重要意义。
[关键词]动物药材;数据库;COI;鉴定
DNA条形码技术是动物药材鉴定的新工具[1],国家药
典委员会已讨论通过在《中国药典》增补本中列入中药材
DNA条形码分子鉴定指导原则[2]。
本课题组联合相关研究者开展了大量的动物药材DNA条形码分子鉴定研究工作。
鄢丹等对包含羚羊角、鹿角的传统角类药材进行DNA条形码研究[3],并以此为基础提出了濒危动物药材的贸易监控和替代品寻找策略[4]。
张辉等对《中国药典》45种动物药材及
其混伪品进行DNA条形码研究,结果表明45种动物药材的正品来源与其混伪品均可相互区分[5]。
崔丽娜等利用COI
序列对金钱白花蛇及其常见混伪品进行DNA条形码鉴别研究,结果表明,金钱白花蛇COI序列可以明确地与混伪品区分开[6]。
胡嵘等对海马、海龙及其混伪品共14个种20份样品的COI条形码序列进行研究,结果表明运用COI序列能够准确鉴定海马、海龙的基原动物及其混伪品[7]。
此外,还开展了龟甲、鳖甲、鹿茸以及蛤壳等的DNA条形码研究工作
[8-11]。
动物DNA条形码分子鉴定研究工作的大量开展,为构建中国动物药材DNA条形码数据库奠定了基础。
DNA条形码数据库不仅是存储样品信息和DNA条形码
序列的工具,而且是DNA条形码研究和物种鉴定分析的生
由国际生
物信息学平台,对推动DNA条形码研究发展具有重要意义
[12]。
第一个国际DNA条形码数据系统(BOLD)
命条形码联盟(CBOL)于2007年建立[13]。
此外
BarcodeofLifeCampaign(FISH-BOL,http:
//www.fishbol.org/),LepidopteraBarcodeofLife(http:
//lepbarcoding.org/),MammaliaBarcodeofLifeCampaign
http:
//www.mammaliabol.org/)。
此外,邵鹏柱等初步构建了传统药物DNA条形码数据库(http:
//137.189.42.34/mherbsdb/),包含1661个物种,36679条序
列[14]。
当前,我国尚未构建统一的动物药材DNA条形码数据库,制约了DNA条形码技术在动物药材鉴定、资源可持续利用和濒危物种保护中的进一步应用。
1材料中国动物药材DNA条形码数据库中的序列来自于课题
组联合相关研究者所开展的动物药材DNA条形码分子鉴定研究及GenBank,包含800余种动物药材和大量动物药材混伪品及密切相关物种(表1)。
2方法对包含测序峰图的样品,根据Q值进行单碱基和序列质
量检测。
对不包含测序峰图的样品,使用EMBOSSTranseq
将核酸序列翻译为蛋白序列,利用隐马尔可夫模型(hidden
Markovmodel,HMM)进行COI条形码区域核验[13]。
采用
BLAST分析防错、系统树分析防错和BarcodingGap检验防错等核验COI序列的可靠性[2],使用Muscle3.8进行多序列比对[15],使用Paup4.0进行遗传距离计算[16],使用
MEGA6.0构建NJ(邻接法)系统聚类树[17]。
使用BLAST方法进行物种鉴定分析,使用MySQL进行数据库管理,通过MySQLdb连接MySQL数据库。
3
结果与讨论
品数据库、序列数据库和文献数据库构成。
样品数据库包含
完整的样品采集和鉴定信息,即:
样品编号、分类信息、凭
证信息、采集者、采集地、鉴定者、1张到数张样品及生境
“spp.”等字符的Record。
提取Record注释中基因名称为
“COI”或“CO1”区域的序列,女nRecord来自于已发表的
文献,收集该文献的PubMedID、题目、作者、期刊、摘要等信息构成文献数据库。
此外,文献数据库还包含本课题组联合相关研究者所开展的动物药材DNA条形码分子鉴定研究文献。
中国动物药材DNA条形码数据库包含2010年版《中
国药典》[18]和
中国药用动物志》(第2版)[19]所载800
余种动物药材和大量动物药材的混伪品和密切相关物种的
样品采集、样品处理、DNA提取、PCR扩增、测序、序列
每6个月更新1次。
新增加样品如包含测序峰图,则依照中药材DNA条形码分子鉴定指导原则去除测序峰图两端的低
质量区域[2],即:
以20bp的窗口分别从序列5'端和3’端
种鉴定系统未知样品可以通过中药材DNA条形码鉴定系统进行鉴定,其访问地址为。
任何对中国
动物药材DNA条形码鉴定感兴趣的单位和个人,均可将获得的未知样品COI条形码序列粘贴到物种鉴定模块的查询框,然后点击提交进行鉴定。
查询COI序列的长度须大于
300bp,且序列所含不确定碱基(Ns)的数目应小于1%。
当
前,该系统支持Fasta(含“>”号)格式和纯序列格式(不
与未知样品序列最相似的序列,并给出数据库中该序列的物种信息。
为便于使用者对鉴定结果进行核对,物种鉴定系统同时列出了数据库中与查询序列相似性最高的前20条序列,并列出序列相似性、分值、E值及比对信息(图2)。
4结论动物药材是我国传统医药的重要组成部分,在我国已有
两三千年的应用历史,从秦汉时期的《神农本草经》,到历版《中国药典》都收载有动物药材,据第三次中药资源普查结果,我国药用动物有11门,415科,861属,1581种我国动物药材多数来自野生,资源有限,部分药材的基原动物如穿山甲、赛加羚羊、梅花鹿等已被列入《国家重点保护野生动物名录》(httP:
//)和《濒危野生动植
物种国际贸易公约》附录(http:
//)。
此外,除使用动物全体的药材外,动物药材多取自动物的不同组织或器官,例如:
角、甲、壳、骨、皮等,形态鉴定特征不完整,给动物药材的性状鉴定带来较大困难[20]。
DNA条形码
鉴定快速准确、有望实现自动鉴定,是传统生物鉴定方法的有效补充,应用前景广阔[1]。
本研究首次构建我国统一的中
国动物药材DNA条形码数据库,对动物药材鉴定、资源可
材DNA条形码数据库也为自动化动物药材鉴定仪器的开发奠定基础。
随着我国动物药材DNA条形码鉴定研究的深入开展,
动物药材DNA条形码鉴定研究的参与单位和参与者逐渐增多,越来越多的动物药材品种被研究和测序,许多制约大规模DNA条形码数据库构建的障碍也逐渐消除。
随着测序费用的逐步降低,特别是高通量测序技术的普及和应用,可以用极低的成本在短时间内获得大量样本的条形码序列。
此
外,计算机及网络技术的发展为动物药材DNA条形码库的条形码库收载动物药材的种类还比较有限,部分动物药材的
COI序列来自于GenBank。
将来,课题组需要联合相关研究
者,依照中药材DNA条形码分子鉴定指导原则的标准操作规范,一方面增加数据库中动物药材的种类,另一方面增加数据库中动物药材样品的数目,进一步完善中国动物药材
DNA条形码数据库。
加拿大动物学家PaulHebert等[21]对动物界,包括脊椎
动物和无脊椎动物共11门13320个物种COI基因序列比较
分析表明,除腔肠动物Cnidaria外,98%的物种种内遗传距
离差异为0〜2%。
然而,种内遗传差异>2%的物种也逐渐被发现[22]。
因此,当利用中国动物药材DNA条形码数据库进行鉴定时,只有当查询序列与参考序列比对部分的长度大于参考序列长度的50%,且具有W2%的遗传差异时,才给出物
种水平的鉴定结果,除此之外,仅列出数据库中与查询序列最接近序列的相关信息。
此外,物种鉴定利用BLAST进行鉴定,当比对部分的覆盖度小于参考序列长度的50%,且相
似度<80%时,BLAST比对结果的参考意义较小,物种鉴定系统会提示数据库中没有与查询序列最相似的序列。
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IntegratedDNAbarcodingdatabaseforidentifyingChinese
animalmedicine
SHILin-chun1,YAOHui1,XIELi-fang2,ZHUYing-jie1,
SONGJing-yuan1,ZHANGHui3,CHENShi-lin4*
1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment,Chinese
AcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,
Beijing100193,China;
2.InformationCentre,ChineseAcademyofMedical
Sciences,Beijing100730,China;
3.DevelopmentCenterofTraditionalChineseMedicine
andBioengineering,
ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun
130117,China;
4.InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyof
ChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)
[Abstract]InordertoconstructanintegratedDNA
barcodingdatabaseforidentifyingChineseanimalmedicine,theauthorsandtheircooperatorshavecompletedalotofresearchesforidentifyingChineseanimalmedicinesusingDNAbarcodingtechnology.SequencesfromGenBankhavebeenanalyzedsimultaneously.Threedifferentmethods,BLAST,barcoding
gapandTreebuilding,havebeenusedtoconfirmthereliabilitiesofbarcoderecordsinthedatabase.Theintegrated
DNAbarcodingdatabaseforidentifyingChineseanimalmedicinehasbeenconstructedusingthreedifferentparts:
specimen,sequenceandliteratureinformation.Thisdatabasecontainedabout800animalmedicinesandtheadulterantsandcloselyrelatedspecies.UnknownspecimenscanbeidentifiedbypastingtheirsequencerecordintothewindowontheIDpageofspeciesidentificationsystemfortraditionalChinesemedicine
).TheintegratedDNAbarcodingdatabaseforidentifyingChineseanimalmedicineissignificantlyimportantforanimalspeciesidentification,rareandendangeredspeciesconservationandsustainableutilizationofanimalresources.
[Keywords]animalmedicine;database;COI;identification
doi:
10.4268/cjcmm20141201
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