精品食物中膳食纤维的测定.docx
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精品食物中膳食纤维的测定
膳食纤维的测定方法
酶-重量法
1.原理:
样品分别用α-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶进行酶解消化以去除蛋白质和可消化的淀粉。
总膳食纤维(TDF)是先酶解,然后用乙醇沉淀,再将沉淀物过滤,将TDF残渣用乙醇和丙酮冲洗,干燥称重。
不溶性和可溶性膳食纤维(IDF和SDF)是酶解后将IDF过滤,过滤后的残渣用热水冲洗,经干燥后称重。
SDF是将上述滤出液用4倍量的95%乙醇沉淀,然后再过滤,干燥,称重。
TDF、IDF和SDF量通过蛋白质、灰分含量进行校正。
2.适用范围
AOAC991.43本方法适用于各类植物性食物和保健食品。
3.仪器
3.1烧杯:
400或600ml高脚型。
3.2过滤用坩埚:
玻料滤板,美国试验和材料学会(ASTM)40-60μm,Pyrex60ml(CorningNo.36060buchner,或同等的)。
如下处理:
(1)在灰化炉525℃灰化过夜。
炉温降至130℃以下取出坩埚。
(2)用真空装置移出硅藻土和灰质。
(3)室温下用2%清洗溶液浸泡1小时。
(4)用水和去离子水冲洗坩埚;然后用15ml丙酮冲洗然后风干。
(5)在干燥的坩埚中加0.5g硅藻土,在130℃烘干恒重。
(6)在干燥器中冷却1小时,记录坩埚加硅藻土重量,精确至0.1mg。
3.3真空装置:
(1)真空泵或抽气机作为控制装置。
(2)1L的厚壁抽滤瓶。
(3)与抽滤瓶相配套的橡皮圈。
3.4振荡水浴箱:
(1)自动控温使温度能保持在98±2℃。
(2)恒温控制在60℃。
3.5天平:
分析级,精确至±0.1mg。
3.6马福炉:
温度控制在525±5℃。
3.7干燥箱:
温度控制在105和130±3℃。
3.8干燥器:
用二氧化硅或同等的干燥剂。
干燥剂两周一次在130℃烘干过夜。
3.9PH计:
注意温控,用pH4.0、7.0和10.0缓冲液标化。
3.10移液管及套头:
容量100μl和5ml。
3.11分配器或量筒:
(1)15±0.5ml,供分配78%的乙醇,95%的乙醇以及丙酮。
(2)40±0.5ml,供分配缓冲液。
3.12.磁力搅拌器和搅拌棒。
4.试剂
全过程使用去离子水,试剂不加说明均为分析纯试剂
4.1乙醇溶液:
(1)85%:
加895ml95%乙醇在1L量筒中,用水稀释至刻度。
(2)78%:
加821ml95%乙醇在1L量筒中,用水稀释至刻度。
4.2丙酮:
4.3供分析用酶:
在0-5℃下储存。
(1)热稳定α-淀粉酶溶液:
Cat.No.A3306,SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO63178,或Termamyl300L,Cat.No.361-6282,Novo-Nordisk,Bagsvaerd,Denmark,或等效的酶。
(2)蛋白酶:
Cat.No.P3910,SigmaChemicalCo.,或等效的。
当天用MES/TRIS缓冲液中现配50mg/ml酶溶液。
(3)淀粉葡糖苷酶溶液:
Cat.No.AMGA9913,SigmaChemicalCo.,或等效的。
4.4硅藻土:
酸洗(Celite545AW,No.C8656,SigmaChemicalCo.,或等效的)。
4.5洗涤液:
两者挑一。
(1)铬酸:
120g重铬酸钠Na2Cr2O7·2H2O,1000ml蒸馏水和1600ml浓硫酸。
(2)实验室用液体清洁剂,预备急需清洗的(Micro,InternationalProductsCorp.,Trenton,NJ08016,或等效的)。
用水配制2%溶液。
4.6MES-TRIS缓冲液:
0.05mol/L,温度在24℃时pH值为8.2。
(1)MES:
2-(N-吗啉代)磺酸基乙烷(No.M-8250,SigmaChemicalCo.或等效的)。
(2)TRIS:
三羟(羟甲基)氨基甲烷(No.T-1503,SigmaChemicalCo.或等效的)。
在1.7L的蒸馏水中溶解19.52gMES和12.2gTRIS,用6mol/LNaOH调pH到8.2,用水定容至2L。
(注意:
24℃时的pH为8.2,但是,如果缓冲液温度在20℃,pH就为8.3,如果温度在28℃,pH为8.1。
为了使温度在20-28℃之间,需根据温度调整pH值。
)
4.7盐酸溶液:
0.561mol//L,加93.5ml6mol/L盐酸到700ml水中,用水定容至1L。
5.操作方法
5.1.样品制备:
(1)固体样品:
如果样品粒度>0.5mm,研磨后过0.3-0.5mm(40-60目)筛。
(2)高脂肪样品:
如果脂肪含量>10%,用石油醚去脂。
每克样品用25ml,每次提取完静置一会儿再小心将烧杯倾斜,慢慢将石油醚倒出,共洗三次。
(3)高碳水化合物样品:
如果样品干重含糖>50%,用85%乙醇去除糖份,每克样品每次10ml,共洗三次轻轻倒出,然后在40℃烘箱中不时翻搅干燥过夜,并研磨过0.5mm筛。
5.2.样品消化
(1)准确称取双份1.000±0.005g样品(M1和M2),置于高脚烧杯中。
(2)在每个烧杯中加入40ml
MES-TRIS缓冲液,在磁力搅拌器上搅拌直到样品完全分散。
(防止团块形成,使受试物与酶能充分接触)。
(3)用热稳定的淀粉酶进行酶解处理:
加100μl热稳定的淀粉酶溶液,低速搅拌。
用铝箔片将烧杯盖住,在95-100℃水浴中反应30分钟。
(起始的水浴温度应达到95℃)。
(4)冷却:
所有烧杯从水浴中移出,凉至60℃。
打开铝箔盖,用刮勺将烧杯边缘的网状物以及烧杯底部的胶状物刮离,以使样品能够完全的酶解。
用10ml蒸馏水冲洗烧杯壁和刮勺。
(5)用蛋白酶进行酶解处理:
在每个烧杯中各加入100μl蛋白酶溶液。
用铝箔盖住,在60℃持续摇动反应30分钟(开始时的水浴温度应达60℃),使之充分反应。
(6)pH值测定:
30分钟后,打开铝箔盖,搅拌中加入5ml0.561mol/LHCL至烧杯中。
60℃时用1mol/LNaOH溶液或1mol/LHCL溶液调最终pH为4.0-4.7。
(注意:
当溶液为60℃时检测和调整pH,因为在较低温度时pH会偏高。
)
(7)用淀粉葡糖苷酶溶液酶解处理:
搅拌同时加100μl淀粉葡糖苷酶溶液。
用铝箔盖住,在60℃持续振摇反应30分钟,温度应恒定在60℃。
5.3测定
5.3.1.总的膳食纤维测定
(1)用乙醇沉淀膳食纤维:
在每份样品中,加入预热至60℃的95%乙醇225ml,乙醇与样品的体积比为4∶1。
室温下沉淀1小时。
(2)过滤装置:
用15ml78%乙醇将硅藻土湿润和重新分布在已称重的坩埚中。
用适度的抽力把坩埚中的硅藻土吸到玻板上。
(3)酶解过滤,用78%乙醇和刮勺转移所有内容物微粒到坩埚中。
(注意:
如果一些样品形成胶质,用刮勺破坏表面,以加速过滤。
)
(4)抽真空,分别用15ml的78%乙醇,95%乙醇和丙酮冲洗残渣各2次,将坩埚内的残渣抽干后在105℃烘干过夜。
将坩埚置干燥器中冷却至室温。
坩埚重量,包括膳食纤维残渣和硅藻土,精确称至0.1mg。
减去坩埚和硅藻土的干重,计算残渣重。
(5)蛋白质和灰分的测定:
取成对的样品中的一份测定蛋白质,用本书前述或GB-960.52方法测定。
用(N×6.25作为蛋白质的转换系数)。
分析灰分时用平行样的第二份在525℃灼烧5小时,在干燥器中冷却,精确称至0.1mg,减去坩埚和硅藻土的重量,即为灰分重量。
5.3.2.不溶性膳食纤维测定:
(1)称适量样品按5.2进行酶解,过滤前用3ml水湿润和重新分布硅藻土在预先处理好的坩埚上,保持抽气使坩埚中的硅藻土抽成均匀的一层。
(2)过滤并冲洗烧杯,用10ml70℃水洗残渣2次,然后再过滤并用水洗,转移到600ml高脚烧杯,保留用以测定可溶性膳食纤维,按5.3.3。
(3)用抽滤装置,分别用15ml78%乙醇,95%乙醇和丙酮各冲洗残渣2次。
(注意:
应及时用78%乙醇、95%乙醇和丙酮冲洗残渣否则可造成不溶性膳食纤维数值的增大。
)
(4)按5.3.1.5用双份样品测定蛋白质和灰分。
5.3.3.可溶性膳食纤维测定:
(1)将不溶性膳食纤维过滤后的滤液收集到600ml高脚烧杯中,对比烧杯和滤过液,估计容积。
(2)加约滤出液4倍量已预热至60℃的95%乙醇。
或者将滤液和洗过残渣的蒸馏水的混合液调至80g,再加入预热至60℃的95%乙醇320ml。
(3)室温下沉淀1小时。
下面按5.3.1测定总膳食纤维,从"湿润和重新分布硅藻土……"。
6.计算
TDF、IDF、SDF均用同一公式计算
膳食纤维(DF,g/100g)测定:
DF={[(R1+R2)/2]-P-A}/[(M1+M2)/2]×100
式中:
R1和R2=双份样品残留物重量(mg)
P和A=分别为蛋白质和灰分重量(mg)
M1和M2=样品重量(mg)
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