狗头枣ACOI基因的克隆.docx

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狗头枣ACOI基因的克隆

分类号：

Q7单位代码：

109

密级：

一般学号：

1090208014034

本科毕业论文（设计）

题目：

狗头枣ACO

基因的克隆

专业：

生物技术

姓名：

刘咪咪

指导教师：

陈国梁

职称：

讲师

答辩日期：

二零一二年六月二日

狗头枣ACO

基因的克隆

摘要：

以冬枣ACO

基因序列（登录号：

EU216549.1）为基础设计引物，狗头枣叶片总DNA为模板，采用PCR技术进行目的基因扩增并测序，并利用NCBI/Blast对其核苷酸序列和氨基酸序列进行分析，结果表明：

所得目的基因大小为1294bp，编码319个氨基酸，该序列与GenBank中的冬枣ACO

基因核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为100%和99%，表明成功的克隆了狗头枣ACO

基因；ORF在线搜索软件分析发现该基因具有4个外显子和3个内含子，分别在106~201、430~541与877~1002bp碱基处。

该基因序列已成功提交GenBank（登录号：

JF812966.1）。

关键词：

狗头枣；ACO

基因；基因克隆；序列分析

CloningofACO

GenefromGoutouJujube

Abstract:

ApairofprimersweredesignedaccordingtothesequenceofACO

genefromZiZiphusjujuba（accessionnumber:

EU216549.1）.TotalDNAoftheleavesofGoutoujujubewastakenastemplate.ThepurposegenewasgoneonPCRamplificationandsequencing.NucleotidesequenceandaminoacidsequenceofthegeneacquiredwereanalysedbyNCBI/Blast.Theresultshowedthatthegeneacquiredhadthelengthof1294bp,whichencodedatotalof319aminoacids.ComparedwithnucleotidesequenceandaminoacidsequenceofACO

genefromZiZiphusjujubawhichisinGenbank,thehomologywere100%and99%respectively,whichshowedthesuccessfulcloningofACO

genefromGoutoujujube;TheanalysisofORFonlinesearchsoftwareshowedthatthegenecontainedfourexonsandthreeintrons,whicharelocatedin106~201,430~541and877~1002bprespectively.ThisgenehavebeensuccessfullysubmittedtoGenBank（accessionnumber:

JF812966.1）.

Keywords:

Goutoujujube;1-aminocyclopropane-1-carboxylicacidoxidase

gene;Genecloning;Sequenceanalysis

果实成熟过程是基因有序表达并与环境相互作用的结果[1]。

乙烯作为植物五大内源激素之一，介导植物对诸多信号和环境刺激作出响应[2]，特别是对果实成熟有明显的促进作用[3-5]。

在果实的成熟过程中，乙烯的大量生成启动了果实内部一系列与衰老有关的酶的活性，从而导致采后旺盛的新陈代谢，使果品迅速衰老变质。

高等植物中乙烯的生物合成途径为：

Met（蛋氨酸）→SAM（S-腺苷蛋氨酸）→ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）→Ethylene（乙烯）[6]，而ACO（1-aminocyclopropane-1-carboxylicacidoxidase）是乙烯生物合成途径中的最后一个关键酶，可直接催化ACC转变为乙烯且催化的反应是不可逆的，其活性高低直接决定植物体内乙烯的生成量[7]。

枣原产我国，枣树是我国具有特色和优势的果树之一，近年来以冬枣为代表的鲜食品种的快速发展以及人们对鲜枣营养价值的重新认识，带动了国内外市场对鲜枣的需求，然而鲜枣采收后不易保鲜、不耐贮藏大大缩短了鲜枣市场的货架期。

本试验旨在利用基因重组技术克隆到狗头枣ACO

基因，并对其序列进行有关生物信息学的分析，为以后深入探究该基因在枣果实成熟过程中的分子调控机理，培育耐储藏的枣新品种奠定理论基础。

1材料

1.1狗头枣叶片：

于2010年9月采自延安市延川县。

1.2PCR引物：

根据冬枣ACO

基因的核苷酸序列[8]（登录号：

EU216549.1）组成以及克隆载体pGM-TVector质粒的核苷酸序列组成、限制性酶切位点等，利用oligo6.0软件设计引物，命名为ACO

-U、ACO

-L，并委托上海生工生物工程有限公司合成，序列如下：

上游引物ACO

-U，其碱基序列为5'-ATGGAGAATTTCCCAGTTATCA-3'

下游引物ACO

-L，其碱基序列为5'-TTAAGCTGTAGCAATTGGACC-3'

1.3克隆载体pGM-TVector：

购自北京百泰克生物技术有限公司

1.4菌株：

DH5α

1.5酶与试剂盒：

EcoRⅠ、T4DNALigase、TaqDNAPolymerase、EcoRⅠbuffer、PCRbuffer、RNaseA与PCR产物凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司。

2试剂

（1）2×CTAB细胞提取液：

2%CTAB，100mmol/LTRIS-HCl（pH8.0），10mmol/L

EDTA（pH8.0），0.7mmol/LNaCl，40mmol/Lβ-巯基乙醇。

（2）10×TBE存储液：

TRIS108g，硼酸55g，EDTA5.8450g、pH8.0，加水定容至1000ml。

（3）50×TAE存储液：

TRIS242g，57.1ml冰醋酸（17.4mol/L），EDTA37.2g、pH8.0，加水定容至1000ml。

（4）6×loadingbuffer：

0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液。

（5）LB培养基（pH7.0）：

配制1000ml需要加入胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，若是固体培养基，加入15g琼脂。

（6）X-gal（20mg/ml）：

将X-gal溶于二甲基亚砜，配成20mg/ml，分装避光-20℃保存。

（7）IPTG（200mg/ml）：

取2gIPTG溶于8ml双蒸水中，再补至10ml，用0.22µM滤膜过滤除菌，每份1ml分装，-20℃保存。

（8）Amp（100mg/ml）：

称取1g氨苄青霉素至于15ml离心管中，加入9ml无菌水，

充分混合溶解后定容至10ml，用0.22µm滤膜过滤除菌，小份分装（1ml/管）后，置于-20℃保存备用。

（9）TRIS-饱和酚:

氯仿:

异戊醇混合液：

按25:

24:

1的比例配制。

（10）溶液

：

50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。

（11）溶液

：

0.4mol/LNaOH，2%SDS，等体积混合（现配现用）。

（12）溶液

：

5mol/L乙酸钠60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml。

（13）CaCl2溶液（0.1mol/L）：

称取无水氯化钙1.111g，置于小烧杯中，加入80ml无菌水充分溶解后定容至100ml，灭菌后4℃保存备用。

3仪器

高速离心机（HC-2518科大创新股份有限公司中佳分公司），AUTOMATICICEMACHINE（XB70GRANT），超净工作台（SW-CJ-IC型双人单面苏州净化设备有限公司），超低温冰箱（702ThermoELECTRONCORPORATION），气浴式振荡器（ZJS-1320科大创新股份有限公司中佳分公司），电热恒温水浴锅（HH-S4型北京科伟永兴仪器有限公司），电子天平（AUY220SHIMADZUCORPORATIONJAPAN），微波炉（WD900ASXL2311顺德市格兰仕电器实业有限公司），微量移液器（DS75985、DA39029，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司），电泳仪（JY-ECP3000北京君意东方电泳设备有限公司），高速冷冻离心机（KDC-160HR科大创新股份有限公司中佳分公司），电热鼓风干燥箱（101型北京科伟永兴仪器有限公司），隔水式电热恒温培养箱（PYX-DHS-40×50-BS上海跃进医疗器械厂），普通冰箱（BCD-254（KK25V61TL）博西华家用电器有限公司），超纯水机（KL-RO-20（台湾艾柯）成都康宁实验专用纯水设备厂），凝胶成像系统（BIO-RADGel-Doc-EQBIO-RADLaboratories），小型高压灭菌锅（TH-1020），P×2ThermalCycler（PCYL220ISSUE1、P×221267\HBP×2220ThermoELECTRONCORPORATION）

4方法

4.1狗头枣叶片总DNA的提取

采用CTAB法提取狗头枣叶片总DNA，参照林加涵等[9]的方法，并略作修改，具体操作如下：

称取新鲜狗头枣叶片0.12~0.13g，置于预冷的灭菌后的研钵中，用液氮迅速研磨成粉末后，转入1.5ml无菌离心管中；加入600µl65℃预热的2×CTAB细胞提取液，轻轻混匀后，65℃保温1h，其间每5min摇一次；加入等体积的氯仿/异戊醇（24:

1），轻轻上下颠倒混匀，12000rpm离心10min；将上清转至另一洁净的离心管中，加入1/10上清液体积的10×CTAB，轻轻混匀，加入等体积氯仿/异戊醇（24:

1），轻轻颠倒混匀，室温下12000rpm离心10min；取上清，重复上述步骤；取上清，加入2倍体积预冷的无水乙醇，缓慢颠倒混匀，会看到絮状抱团的白色沉淀，室温静置30min，12000rpm离心5min，弃上清；75%乙醇洗涤沉淀2~3次，离心弃上清，自然风干；在沉淀中加入50µl无菌水，溶解DNA，低温保存备用；取上述所提DNA样品5.0µl与Loadingbuffer混合后点样，90V稳压电泳约30min，EB染色10min后，凝胶成像。

4.2ACO

基因的扩增

以DNA为模板，ACO

-U、ACO

-L为引物，按照下列体系及参数进行扩增反应：

PCR反应体系（25.0µl）：

1）ddH2O17.3µl

2）10×buffer（含Mg2+）2.5µl

3）dNTPs2.0µl

4）upprimer（10μmol/L）1.0µl

5）lowerprimer（10μmol/L）1.0µl

6）Template1.0µl

7）TaqDNAPolymerase（5U/µl）0.2µl

PCR扩增反应参数

1）95℃5min

2）95℃1min

3）59℃50s循环30次

4）72℃1min30s

5）72℃10min

6）4℃+∞

4.3PCR扩增产物回收

将上述PCR产物电泳，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对其进行回收。

4.4PCR产物与T载体连接

连接体系（10.0µl）：

10×T4DNARapidLigationBuffer1.0µl

pGM-T（约50ng/µl）1.0µl

T4DNALigase（3U/µl）1.0µl

新鲜PCR片段7.0µl

将以上体系轻轻混匀，瞬时离心，封口，于低温恒槽中，16℃连接过夜。

4.5重组质粒DNA的转化

4.5.1感受态细胞的制备

用无菌牙签在LB平板上挑取新培养的DH5α单菌落，接种到盛有5mlLB液体培养基的50ml锥形瓶中，37℃，280r/min震荡培养过夜；将上述培养物按照体积比1:

100放大于装有50mlLB液体培养基的150ml锥形瓶中继续培养2～3h至OD600=0.3～0.4左右；将上述培养物转入50ml无菌离心管中，冰浴30min；4℃，6000r/min条件下离心5min，尽可能将上清去干净；用5ml预冷的0.1mol/LCaCl2[V原菌液:

VCaCl2≈10:

1]溶液重悬沉淀物，冰浴30min；4℃，6000r/min条件下离心5min；弃上清液，用600µl冰预冷的0.1mol/LCaCl2[V原菌液:

VCaCl2≈50:

1]溶液重悬沉淀物，然后加入甘油至其终浓度为15～30％，按100µl/份分装，液氮速冻，放在-70℃冰箱备用，使用时取出冰浴消融。

4.5.2转化

将连接液，感受态细胞置于冰浴中，每100µl感受态细胞中加入5.0µl的连接液，快速轻柔混匀，冰浴30min；将感受态细胞取出，放入42℃水浴中，热激70-90s，迅速取出后置于冰上静置3-5min；向离心管中加入400µl不含抗生素的LB液体培养基，37℃180rpm30min后，调至260rpm再摇30min，使质粒上相关的抗性标记基因表达。

4.6重组子的筛选

在LB固体培养基中加入Amp（100mg/ml），使其终浓度为100µg/ml，振荡混匀后倒平板，20ml板；每板加入40µlX-gal（20mg/ml），20µlIPTG（200mg/ml），涂布均匀，晾干；每板加上述转化产物250µl，涂匀后封口，37℃恒温培养过夜。

4.7重组子的鉴定

4.7.1质粒DNA的提取及滞后检测

挑取筛选平板上的蓝、白斑于加有Amp（100µg/ml）的LB液体培养基中，蓝斑作对照，37℃280rpm振荡培养过夜；取1～1.5ml于离心管中，12000rpm离心2min，收集细胞；将细胞悬浮于200µl溶液

中，充分混匀后，室温放置10min；加入200µl溶液

，上下轻轻颠倒混匀，冰浴5min；加入200µl溶液

，轻轻混匀，冰浴15min；12000rpm离心15min，将上清移至另一无菌离心管中；向上清中加入等体积的酚-氯仿（25:

24:

1），混匀，12000rpm离心5min，取上清；加两倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-20℃静置30min，12000rpm离心5min，收集沉淀；用200µl75%乙醇洗涤两次（每次12000rmp,5min）；自然风干后，加入50-100µl无菌水溶解。

取上述所提质粒DNA样品5.0µl与Loadingbuffer混合后点样，80V稳压电泳约30min，EB染色10min后，凝胶成像系统成像。

4.7.2PCR检测

以4.7.1步所提取获得的质粒DNA为模板，进行PCR扩增反应，其参数及体系同方法4.2，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。

4.7.3酶切鉴定

以4.7.1步所提取获得的质粒DNA为模板，按下列体系（20.0µl）进行酶切反应：

DNA16.5µl

10×EcoRⅠbuffer2.0µl

EcoRⅠ1.5µl

37℃保温约13h。

4.7.4测序

将经上述多种方法鉴定获得的阳性重组子送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

测定的序列进行NCBI/BLAST同源性分析，并分别利用ORF在线搜索软件和DNAMAN软件对所得序列进行基因结构分析和氨基酸翻译。

5结果与分析

5.1狗头枣叶片总DNA电泳检测结果：

提取的狗头枣叶片总DNA结果见图1。

从图中可以看出，所提取的DNA完整,没有降解,质量较好,可以满足PCR扩增的要求。

图1狗头枣叶片总DNA电泳图

Fig.1ElectrophoresisfigureoftotalDNAofleaffromGoutoujujube

1、2、4、5.狗头枣叶片总DNA

1、2、4、5.TotalDNAofleaffromGoutoujujube

5.2目的基因的PCR扩增结果：

PCR反应结束后，取5.0µl进行电泳检测（图2）。

从图中可以看出，所获得片段约为1300bp，与预期值相符，初步表明扩增到目的片段。

5.3目的基因PCR扩增产物回收结果：

用回收试剂盒对PCR产物进行回收，取5.0µl进行电泳检测（图3）。

从图中可以看出：

回收得到的片段大小约为1300bp，且条带较清晰，可用于进行连接反应。

5.4重组子的筛选结果：

如图4所示，经培养后的Amp固体培养基上长出了许多蓝斑和白斑，从中随机挑选大小均匀、表面光滑且透明的若干白斑进行重组质粒滞后鉴定，并挑选一个蓝斑作为对照。

5.5重组质粒的鉴定

5.5.1质粒滞后鉴定：

从图5可以看出1、2、3、4和5号（白斑质粒）较M号（蓝斑质粒）均滞后，初步表明目的DNA片段可能插入到了T载体上，可进一步对滞后质粒做PCR鉴定。

图5质粒提取电泳图

Fig.5Electrophoresisfigureofplasmid

M.蓝斑质粒;1~5.白斑滞后质粒

1.Blue-plaqueplasmid;2-6.White-plaguelagplasmid

5.5.2PCR鉴定结果：

以上述1~4号（白斑质粒DNA）为模板，分别进行PCR扩增。

PCR反应结束后，各取5.0µl进行电泳检测（如图6）。

从图中可以看出：

所获得片段大小均约1300bp，与目的片段大小一致，进一步表明1~4号白斑很可能均为所需重组子，进而可对滞后质粒做酶切鉴定。

5.5.3酶切鉴定结果：

用EcoRI对从重组子（2号）中提取到的质粒DNA进行酶切，从图7可以看出：

得到的片段大小约为1300bp，与目

的片段大小一致，表明目的DNA片段已经插入到了T

载体上，2号白斑即为所需重组子。

5.6　ACO

基因的测序结果及分析

5.6.1ACO

基因的测序结果：

测序结果如图8所示，

本试验中所克隆到的序列全长1294bp。

用ORF在线

搜索软件进行基因结构分析表明，该基因含有4个外

显子、3个内含子，分别在106~201、430~541与877

~1002bp碱基处。

用DNAMAN软件对该序列进行翻

译发现编码区序列长960bp，编码319个氨基酸（最

后一个密码子为终止密码子），序列见图9。

克隆所得

序列已成功提交GenBank，登录号为JF812966.1（基

因），AEP19803.1（蛋白）。

1ATGGAGAATTTCCCAGTTATCAACTTGGAGAATCTCAATGGTGAAGGAAGGAAGGCTACA

61ATGGAACAGATTAGAGATGCTTGTGAGAACTGGGGTTTCTTTGAGGTAAAAATGCTAGCT

121ATTTTTTTAATGTTATAGCACATTATTTTCTTTTGGCACGGTGATTATGGTGCTTATCTT

181AACAAAAACAAAAATTGGCAGCTTGTGAATCATGGTATAGCCCCTGAGTTTATGGACAAA

241ATAGAGAGGATGACAAAAGAGCATTACAGGAAGTGCATGGAGCAGAGGTTCAAAGAGCTT

301GTTGCAAGCAAAGGTTTGGAAGCTGTTCAGACAGAGGTCAGTGACATGGATTGGGAAAGC

361ACTTTCTTCTTGCGCCACCTTCCTGTTTCTAACATATCAGAGATTCCAGATCTCCATGAT

421GATTACAGGTATTATTTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTCCCAGATATCTAAAATGTT

481GATAAATCATACACAATGCAGAGTTCTAAAAAAGAAATCCAAAAAATTAATTTTCTACAG

541GAAAGCGATGAAGGAATTTGCTTTGAAATTGGAGACACTAGCTGAGGAACTACTAGACCT

601GTTATGTGAGAATCTTGGACTTGAAAAAGGGTATCTGAAAAAGGCCTTCTATGGATCAAA

661AGGTCCAACTTTTGGAACCAAGGTGAGCAATTATCCACCATGCCCAAAACCGGAGTTGAT

721CAAAGGTCTCCGAGCCCACACAGATGCAGGTGGCATCATCTTGCTGTTCCAGGATGACAA

781AGTCAGCGGCCTCCAGCTACTTAAGGATGGTCAATGGATTGATGTCCCTCCTATGCGCCA

841CTCCATTGTAGTCAACCTTGGCGATCAACTTGAGGTAAGCCCTCCATGTTTTAATAAACA

901AATCCAACTCCAAATTAAAATTTGTCTTTTTATTTTTTTTAATACCCCAAAAAAACAAAG

961ATAGTGAAAATCTGAACTATGAAAAATATGTTTTTTACAGGTTATAACAAATGGGAAATA

1021CAAGAGTGTAGAACACAGAGTGATTGCACAAACAAATGGTACCAGAATGCCCATAGCTTC

1081ATTCTACAACCCCGGTAGTGATGCTGTTATTTACCCTGCACCAGTCCTTGTCGAGAAAGA

1141AGCAGAGGAGAAGAAGCAAGTTTACCCAAAATTTGTTTTTGAAGATTATATGAAGCTTTA

1201TACTGCGTTGAAATTCGAGCCCAAAGAGCCAAGGTTCAAAGCCATGAAAGCAGTGGAAAC

1261TAATGTTGGTTTGGGTCCAATTGCTACAGCTTAA

图8狗头枣ACO

基因的核苷酸序列

Fig.8NucleotidesequenceofACO

genefromGoutoujujube

下划线核苷酸为PCR引物；阴影处为内含子序列；其余为外显子序列

Theportion