G418筛选稳定表达细胞系经验总结.docx

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G418筛选稳定表达细胞系经验总结

G418筛选稳定表达细胞系经验总结

G418筛选稳定表达细胞系经验总结

我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。

有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。

筛选之前确定G418浓度：

1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。

但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。

neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%

4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。

具体如下：

将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

一个具体试验：

3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。

筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

加药时间和维持浓度

1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。

随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。

这时药物浓度可以降至200ug/ml。

2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。

一般是转染48小时后加入抗生素。

挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2。

2，问题2。

筛选成功的概率：

只要有抗性加压筛选，挑选到的机率还是比较大的。

一般能挑到稳定表达的概率我认为大概有70－80％，但是想挑到表达量高且能稳定表达的，不大容易。

这个可能是在染色体上，合适的整合位点太少的缘故。

3，问题3。

细胞形态的改变：

稳定转染后阳性克隆均出现不同程度的细胞形态的改变。

想请教各位有经验的高手，你们做稳定转染时有此发现吗？

我的也是，而且好象还有好几种不同类型的细胞。

不过，我转的是一种抑癌基因。

4，问题4。

单克隆化的时机和个数：

加药筛选时,一般等到确认的转染细胞长到70%以上时,再做有限稀释法,以克隆出阳性细胞,同时要保持适当的药物浓度,以防突变和污染。

若细胞长好了,如有40%以上,就可以有限稀释了一般，筛选5，6个克隆就有需要的克隆，但保险起见，筛10个吧。

5，从单克隆化时开始，就要加大营养，清和生长因子。

单克隆化的操作方法；

1.方法1。

单克隆细胞的培养就是这样的,我现在作了15个96孔板的单克隆,总共才得到大约50株单克隆在做时候应保证每个孔中的细胞是一个,因此,我一般在200毫升的培养液中加入小于96个的细胞,这样平均到每个孔中因该可以由满意的结果你所说的现象我也遇到过,我也百思不得其解,只好做多一点的96孔板来补充。

培养SPC-A1（人肺癌细胞），转染了EGFP，然后进行了G418抗性筛选和96孔板单克隆筛选，最终获得了成功将我的实验步骤写出来，希望对你有所帮助。

2.方法2。

实验步骤大致为：

预先对96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的细胞培养液，0.1ml/孔，并放于细胞培养箱中温育，然后胰酶消化稳定表达GFP的细胞，细胞液稀释至密度为1000cell/ml的单细胞悬浮液，上述细胞液接种于96孔板的第一排，0.2ml/孔，从中吸取0.1ml细胞溶液接种于第二排，混合后，从第二排中吸取0.1ml接种于第三排……，一直到第八排，最后一排都丢弃0.1ml细胞液，操作示意图见下图。

一般来说，每一列都会有某个孔中只有1~2个细胞。

3.方法3。

我的改进之处：

我在显微镜下观察，标记孔中小于10个细胞的孔，然后在显微镜下用记号笔在皿底把单个荧光细胞圈住，然后在操净台里用灭过菌底牙签将圈外的细胞戳死，这样留在孔中的就是单克隆了，通过这样的，我一共获得了6株单克隆。

但需注意的是：

时间不能超过30min，否则细胞极容易死亡。

解决操作时间长的方法：

拿一个96板，在里面随便种一些细胞，然后用牙签练习，我练了5～6次后非常熟练了

培养液：

最好是含15％的胎牛血清，加大营养，有利于细胞生长；另外一种方法是对还没有变黄的细胞液进行过滤，过滤后的培养含有很多生长因子，可以作为单克隆的培养液。

4.方法4。

我曾经帮同事做过挑单克隆，直接将倒置显微镜搬到操净台内紫外照射30分钟，然后先在显微镜下把要挑的单克隆初看一遍，算一下大概要挑几个，然后在96孔板内先加好培养基，再将6孔板内的培养基吸出，加入少量的胰酶，大概能盖住板底即可，然后在显微镜下观察细胞状态，在有些变圆时，即用10ul枪在显微镜下直接吸克隆，放入事先准备好的加了培养基的96孔板内，先吸大的克隆，在胰酶完全起到作用使细胞松散扩散开了时，已经吸了将近十个克隆了，动作快一些时能吸十几个克隆，我做过几次了效果很好，没有出现污染。

（在要进行操作时，用酒精将手好好擦擦，将显微镜用新洁尔灭也擦一下，一般不会有什么问题），你可以试试，只要小心一些就行了。

5.方法5。

关于稳转的方法，好像园子里很多xdjm都用的是有限稀释法来作，但是我们实验室基本上都不用九十六孔做有限稀释来作单克隆的，一般的做法都是这样：

1。

3.5cm皿铺细胞，长到大概80％以上的时候作转染。

2。

转染后一天消化，传到一个大皿（1：

6）或者两个大皿（1：

12）。

3。

再过一天后加入带G418的培养基。

4。

依据细胞不同，大概从加入G418的第三天到第八天之间细胞开始出现大量死亡，活下来的细胞就形成单克隆。

5，单克隆长到相对较大的集落后，于显微镜下用200ul枪挑取细胞集落，一般挑上48个，种在两块24孔板上。

6。

于24孔板上继续培养，约4、5天后即可消化传代，取部分作收蛋白western之用，根据western结果确定真阳性。

我们基本上都是这样pickstable的，除非一些对细胞生长抑止作用强大或者apoptosis的inducer之类的基因比较难挑到stable外，一般还都能挑到stable。

当然，转染效率不能太低，超过50％就相对比较容易了，10％以上的可能最后形成的细胞集落就少，而且真阳性也较少。

对于那些转染效率很低的细胞，我会连续转染三次（中间如果细胞长满了就传代），好像比较有效。

除非是类似带GFP这样能直接观察到是否真阳性的基因，我们才用有限稀释法来作，要不好像也太麻烦了吧？

耗时也多

单克隆化后细胞特点和处理：

1.单克隆后细胞生活习性改变：

考虑质粒的表达对细胞的生长有一定的影响，查文献确认一下。

2.单克隆后的培养需要多加些血清，再传代时保证板子不影响细胞贴壁，避免出现传代后细胞浮起来后死亡的现象。

3.筛选成单克隆后，不加药培养2代，再加药继续筛选两代，此时如果不出现死亡细胞则可以认为是稳定细胞系。

复苏后加G418传代2次，然后按部就班。

4.过一段时间再筛选时，G418的浓度有人认为需要比稳转时小写，此外，加药后对蛋白质的表达，细胞形态有影响，因此做功能时要停药培养合适时间后再做。

5.稳转PA317细胞后再次筛选（需要隔一段时间再加压筛一次），细胞也是死的厉害，不过还是可以筛到，不过需要用合适的浓度。

可以在细胞传几代后，分出一小部分，不加G418培养一段时间，然后再加你维持细胞的抗性的G418浓度培养一天看细胞会不会死亡，如果死亡，说明外源基因还没有丢失。

6.有人这样做的：

转染加药一段时间后，板子上出现了几个克隆，如果有几十个克隆，然后挑其中七八个克隆到24孔板里继续加药筛选，等24孔长满后再转到6孔板继续加药筛选，6孔板里长差不多满后，每孔消化下来大概一半做WB鉴定目的基因表达，剩一半留着继续加药培养，等WB结果出来有阳性的孔就保留下来，阴性的丢掉。

单克隆化后鉴定：

1.稳定转染细胞，通过PCR鉴定，发现目的基因并不上调，瞬时转染表达是增高的。

原因：

瞬转是在强启动子下,稳转时你得到的细胞株可能失去了此启动子,或者是改变了细胞的生理特性!

用WB和瞬转对照鉴定一下!

2.转染后质粒整合到基因组是随机的，一般两月后（传代10代以上）还表达你想要蛋白的单克隆可以认为是整合了质粒的。

G418筛选稳定表达细胞系

1.G418的配制：

方案一：

300mgG418加入3mlPBS溶液，浓度为100mg/ml，完全溶解后，0.22um

过滤，-20℃保存。

方案二：

（1）配制1MHEPES：

23.8gHEPES（缓冲能力更强）粉末溶于100mlddH2O，10NNaOH（加量较多）调节pH至7.3，过滤除菌（较难过滤），4℃保存，终浓度为1mol/L。

（2）5gG418溶于10ml1MHEPES（pH7.3），终浓度为500mg/ml，-20℃保存。

注：

实验中采用方案二时效果较好。

2.制备筛选培养基：

用培养基将G418稀释为0ug/ml、200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml、500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml

24孔板，每孔1ml培养基（含有G418的完全培养基），每个浓度4个重复，则每次换液需各个浓度培养基4ml，现用现配。

200ug/ml    300ug/ml    400ug/ml    500ug/ml    600ug/ml    700ug/ml    800ug/ml    900ug/ml    1000ug/ml    1100ug/ml    1200ug/ml

3ml

完全培养基   

 998.4    997.6    996.8    996    995.2    994.4    993.6    992.8    992    991.2    990.4

G418（500mg/ml）    

1.6ul    2.4ul    3.2ul    4.0ul    4.8ul    5.6ul    6.4ul    7.2ul    8.0ul    8.8ul    9.6ul

3.细胞培养：

将冻存的细胞复苏培养，，传代3至4次使细胞达到良好的生长状态,铺24孔板（20000/孔），12h换液，加筛选培养基培养。

4.确定G418最佳筛选浓度：

将培养孔中培养基吸除，PBS洗涤一次，每孔加入不同浓度筛选培养基，隔天更换一次筛选培养基，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准。

注：

实验中所确定的最佳筛选浓度为1200ug/ml。

5.铺6孔板（20万/孔），第二天转染，6小时后换新鲜正常培养基。

转染24小时后加最佳筛选浓度培养基，隔天换液。

注意：

细胞数量不能太多，否则将会影响筛选效果（G418很难发挥作用）。

6.在换液一两次后（换液后培养过夜），细胞达50%-80%时，吸出所有培养液，离心3000-4000rpm，吸上清0.22um过滤，加入2倍体积新鲜最佳筛选浓度培养液，混匀4℃备用。

7.培养6天左右细胞大量死亡时，可以换用适应性培养基，即6中所配制。

或者可以增加血清浓度培养，例如原来用10%血清，此时则可以采用20%血清。

8.培养10天后将G418浓度减半，维持筛选压力。

9.筛选约14天后可见有抗性克隆出现。

10.挑单克隆：

高倍镜下标记阳性克隆，套环法或刮除法结合有限稀释法筛选阳性克隆，将其转入多孔板培养。

●套环法：

用套环套住阳性克隆，在套环内加胰酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的培养孔中培养。

●刮除法：

刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养。

11.单克隆鉴定：

细胞大量扩增后，①提取总RNA，RT-PCR检测目的基因的表达②western检测目的基因。

注意：

转染时压系时细胞不能铺的太满，不然当细胞连接紧密后，压系时不具G418抗性的细胞死亡时极易将具有抗性的细胞一起从壁上脱落下来。

G418筛选稳定表达细胞系总结一

题也不是很大，那就是：

在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。

我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。

因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。

所以没有必要再用，而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。

有人认为用磷酸钙共沉淀转染法筛选稳定整合子较好，但这种观点是很多年以前的观点了，而且只是少数人的观点。

我两种方法都用过，但没有特异的比较过，感觉都可以。

磷酸钙便宜，但对溶液配置和实验操作要求很高，尤其是溶液的PH值，要求精确到小数点后2位。

脂质体是现在主流的转染试剂，从没有人说这种方法做整合稳定表达不行。

非脂质体是这几年发展很快的技术，转染效率低，细胞毒性小，价格也不贵，Qiagen就有一个系列。

我个人觉得不必要花太多时间在这方面，自己实验室用得好的技术可以坚持，没有经验的可以选择一个较著名的公司的产品开始，购买之前先下载个说明书看看。

有精力就比较一下几种方法，一般的用达到目的就行了。

关键是实验设计。

G418和筛选

筛选之前

由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。

具体如下：

将细胞稀释到1000个细胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

由于每种细胞对G418的敏感性不同，一般变动在100ug/ml～1000ug/ml范围。

而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定你的细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。

尽管如此，特性明确的细胞系G418的最佳用量还是稳定的。

《分子克隆》给出了几个常用细胞系所需G418的最佳用量。

细胞系或机体

 G418浓度（ug/ml）

中国仓鼠卵巢细胞

700～800

Madin-Darby犬肾细胞

500

人上皮A431细胞

400

猿CV-1细胞

500

盘基网柄菌属

10～35

植物

10

酵母

125～500

看下面的一个试验：

3×106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。

筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

所以汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%！

加药时间

由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。

随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3-5天都要更换一次含有G418的筛选液。

这时药物浓度可以降至200ug/ml。

培养液

加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。

这时会出现两个问题：

1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。

2.孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。

这个时候需要一种特殊的培养液：

假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：

1混合备用。

再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。

挑选单克隆的优化

为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增加阳性克隆的得率，可以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆。

加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下用记号笔做个标记。

然后刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养；或则用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养。

最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。

鉴定之后

一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定。

但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，目的基因还是很容易丢失的。

但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。

随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。

这样再次筛选是必不可少的。

只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗传稳定的细胞克隆。

最全的G418筛选稳定表达细胞系总结！

（2）

Protocal

1.G418的配制：

取1gG418溶于1ml1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。

2.细胞培养：

取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。

3.制备筛选培养基：

在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。

4.加G418筛选:

吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。

5.换液：

根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。

方法同4。

6.确定最佳筛选浓度：

在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。

在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：

用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。

假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！

心得：

由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。

比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200ug/ml。

这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。

通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。

a转染：

转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：

4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；

b加G418:

去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。

c换液：

根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。

当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。

筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后；

d挑单克隆：

制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。

在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。

待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。

e单克隆鉴定：

细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。

常见问题：

1.转进去的重组质粒以什么形式存在于细胞内的？

无怪乎两种形式：

整合在染色体中和存在于细胞质中。

没有经过筛选前大部分转染进细胞的质粒是存在于胞质中的，但是这种质粒是不稳定的，基本上筛选不出这种单克隆，只有稳定整合入染色体的才是我们想要的稳定细胞系。

2.neo基因和目的基因是不是一定会整合在一起？

整合是随机发生的非同源性重组，neo基因表达而目的基因不一定都表达，所以在筛选之后还要用RT-PCR的方法进一步鉴定。

培养基处理的个人技巧

体内的任何细胞被置于体外培养后，对环境都有一个适应过程，期间细胞对培养液具有同化作用，即细胞从培养液中摄取营养的同时，也向培养液排出自己的代谢产物和其它一些物质，其中有排泄物也有促细胞生长因子。

这个过程也是细胞同化培养基的过程。

细胞越多则其同化作用越强，所以细胞数目多比数目少较易生长。

在筛选后期，大批细胞死亡，不换液没有死亡的细胞就会受到死亡细胞的影响，换液后残留的少量细胞对培养基的同化作用不强，也不利于生长。

我是用适应性培养基来解决这一问题的：

适应性培养基的配制

a培养同源细胞至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24～48小时后，吸出所有培养液

b离心：

3000～4000rpm10min后，吸取上清液

c虑过：

再经直径0.22um滤器过滤，再加入2倍体积的新鲜培养基，低温冻存备用。

eeflying

1.G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/mL，每孔100uL加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100ng/mL等12个级别。

培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-800左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。

２.我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优势的。

３.即是有G418抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重要的。

转染后，每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的，目的蛋白表达有的多，有的少，外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小，所以生长较快，在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势，长期之后，表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要，转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。

所以，要进行单克隆化操作，使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量一致，也是对高表达细胞的保护。

操作用96孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留200cell左右就可以进行该操作了，该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述。

1.可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，这点我们做过FISH验证过，表达量与整合数目，上游序列特性，特定部位DNA立体结构都是相关的，装入了SV40只是增加了表达了数目，但并不能掩盖其它因素对表达的影响。

按你的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。

neo基因也是这