实验二SDSPAGE凝胶电泳.ppt
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SDS-PAGE凝凝胶胶电泳泳实验二二SDS-PAGE凝胶电泳实验原理实验原理实验步骤实验步骤注意事项注意事项SDS-PAGE的优点的优点SDS-PAGE的缺点的缺点实验常见问题及处理实验常见问题及处理小技巧小技巧实验原理源起源起基本原理基本原理分类分类分离范围分离范围源起1967年由Shapiro建立。
1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂(SDS)以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视.丙丙烯酰胺胺N,N-亚甲基甲基双双丙丙烯酰胺胺聚丙聚丙烯酰胺胺四甲基乙二四甲基乙二胺胺(TEMED)过硫酸硫酸胺胺(AP)激活作用激活作用激活作用激活作用共聚合共聚合基本原理之一阴离子去污剂阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间及与其它物质分子之间的非共价键,使蛋白质变性而改变其原有破坏蛋白质分子之间及与其它物质分子之间的非共价键,使蛋白质变性而改变其原有的构象,并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质的构象,并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
复合物。
强还原剂巯基乙醇强还原剂巯基乙醇打开蛋白质分子内的二硫键使这种结合更加充分。
打开蛋白质分子内的二硫键使这种结合更加充分。
基本原理之二结合了结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭圆棒,不同的蛋白质的蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭圆棒,不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短轴长度恒定,而长轴的长度则与复合物其椭圆棒的短轴长度恒定,而长轴的长度则与蛋白质分子量蛋白质分子量的大小成正比。
的大小成正比。
这样的蛋白质这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下,其迁移率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的影响,而主复合物在电场作用下,其迁移率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的影响,而主要取决于其分子量大小这一因素。
根据这一特点,就可以将各蛋白组分按分子量大小分开。
要取决于其分子量大小这一因素。
根据这一特点,就可以将各蛋白组分按分子量大小分开。
分类PAGE根据其有无浓缩效应根据其有无浓缩效应,分为连续系统连续系统和不连续系统不连续系统两大类.连续系统电泳体系中连续系统电泳体系中,缓冲液缓冲液pH值及凝胶浓值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应荷和分子筛效应。
电电泳槽泳槽泳槽泳槽不连续系统不连续系统中由于缓冲液离子成分,不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
清晰度及分辨率均较前者佳。
浓缩胶浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
分离分离胶胶l孔孔径径较小小,通通过选择合适的凝合适的凝胶胶浓度度,可以使可以使样品很好的品很好的分离分离.凝凝胶胶由由两种两种不同的凝不同的凝胶胶层组成。
上成。
上层为浓缩胶胶,下,下层为分分离离胶胶。
在上下。
在上下电泳槽泳槽内内充以充以Tris-甘甘氨氨酸酸缓冲液冲液(pH8.3),这样便形成了凝便形成了凝胶胶孔孔径径和和缓冲液冲液pH值的不的不连续性。
在性。
在浓缩胶胶中中HCl几乎全部解离几乎全部解离为Cl-,但只有,但只有极极少部分甘少部分甘氨氨酸酸解离解离为H2NCH2COO-。
蛋白。
蛋白质的等的等电点一般在点一般在pH5左右,左右,在此在此条条件下其解离度在件下其解离度在HCl和甘和甘氨氨酸之酸之间。
当当电泳系泳系统通通电后,后,这3种种离子同向离子同向阳极阳极移移动。
其有效泳。
其有效泳动率依次率依次为Cl-蛋白蛋白质H2NCH2COO-,故,故C1-称称为快离子,而快离子,而H2NCH2COO-称称为慢离子。
慢离子。
浓缩效效应之一之一浓缩效应之二电泳开始后,快离子在前,在它后面形成离子浓度电泳开始后,快离子在前,在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。
电导与电压梯度成反比,所低的区域即低电导区。
电导与电压梯度成反比,所以低电导区有较高的电压梯度。
这种高电压梯度使以低电导区有较高的电压梯度。
这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。
在快离子蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。
在快离子和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界面。
由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之面。
由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间,因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩间,因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。
这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百成一条狭窄带。
这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。
倍。
样品品进入分离入分离胶胶后,慢离子甘后,慢离子甘氨氨酸全部解离酸全部解离为负离子,离子,泳泳动速率加快,很快超速率加快,很快超过蛋白蛋白质,高,高电压梯度梯度随随即消失。
此即消失。
此时蛋白蛋白质在均一的外加在均一的外加电场下泳下泳动,但由于蛋白,但由于蛋白质分子所分子所带的有的有效效电荷不同,使得各荷不同,使得各种种蛋白蛋白质的泳的泳动速率不同而形成一速率不同而形成一条条区条条区带。
电荷效荷效应之一之一电荷效应之二与与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化,在水溶液中结合的蛋白质的构型也发生变化,在水溶液中SDS-蛋白质复合物都具有相似的形状,使得蛋白质复合物都具有相似的形状,使得SDS-PAGE电泳的泳动率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响。
因此,各种电泳的泳动率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响。
因此,各种SDS-蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。
蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。
电荷效应之三在在SDS-PAGE电泳中,由于电泳中,由于SDS这种阴离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物,使蛋这种阴离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物,使蛋白质分子带负电荷,这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别,从而降低或消白质分子带负电荷,这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别,从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别;此外,由多亚基组成的蛋白质和除了蛋白质天然电荷的差别;此外,由多亚基组成的蛋白质和SDS结合后都解离成亚单位结合后都解离成亚单位,这是因为,这是因为SDS破坏了蛋白质氢键、疏水键等非共价键。
破坏了蛋白质氢键、疏水键等非共价键。
SDS聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶的的有有效效分分离离范范围围取取决决于于用用于于灌灌胶胶的的聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺的的浓浓度度和和交交联联度度。
在在没没有有交交联联剂剂的的情情况况下下聚聚合合的的丙丙烯烯酰酰胺胺形形成成毫毫无无价价值值的的粘粘稠稠溶溶液液,而而经经双双丙丙烯烯酰酰胺胺交交联联后后凝凝胶胶的的刚刚性性和和抗抗张张强强度度都都有有所所增增加加,并并形形成成SDS-蛋蛋白白质质复复合合物物必必须须通通过过的的小小孔孔。
这这些些小小孔孔的的孔孔径径随随“双双丙丙烯烯酰酰胺胺丙丙烯烯酰酰胺胺”比比率率的的增增加加而而变变小小,比比率率接接近近1:
20时时孔孔径径达达到到最最小小值值。
SDS聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶大大多多按按“双双丙丙烯烯酰酰胺胺丙丙烯烯酰酰胺胺”为为1:
29配制,试验表明它能分离大小相差只有配制,试验表明它能分离大小相差只有3%的蛋白质。
的蛋白质。
分离范分离范围凝凝胶胶的的筛筛分分特特性性取取决决于于它它的的孔孔径径,而而孔孔径径又又是是灌灌胶胶时时所所用用丙丙烯烯酰酰胺胺和和双双丙丙烯烯酰酰胺胺绝绝对对浓浓度度的的函函数数。
用用515%的的丙丙烯烯酰酰胺胺所所灌灌制制凝凝胶胶的的线线性性分分离离范范围如下表:
围如下表:
丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度(%)线性分离范围线性分离范围(kD)1512431016687.536945.057212双双丙丙烯酰胺胺丙丙烯酰胺胺摩尔比摩尔比为1:
29。
上上样缓冲液之一冲液之一上上样缓冲液冲液(SDS-PAGEloadingbuffer)是一是一种种以以溴酚溴酚蓝为染料,染料,5倍倍浓缩的的SDS-PAGE凝凝胶胶电泳上泳上样缓冲液,用于常冲液,用于常规的的SDS-PAGE蛋白蛋白电泳泳样品上品上样。
本本产品分品分为还原型和非原型和非还原型原型两种两种,还原型上原型上样缓冲液中的冲液中的巯基可使蛋白分子的基可使蛋白分子的链内内二硫二硫键和和链间二二硫硫键断断裂,使通裂,使通过二硫二硫键连接的各接的各亚单位彼此分离,位彼此分离,在在电泳凝泳凝胶胶上上显现多多个个蛋白蛋白条条带,选购和使用和使用时请务必注明,仔必注明,仔细区区分。
分。
上样缓冲液之二注意事项注意事项还原型上样缓冲液中含一定量的还原型上样缓冲液中含一定量的DTT(二硫苏糖醇)(二硫苏糖醇)或巯基乙醇,有轻微刺激性气味,或巯基乙醇,有轻微刺激性气味,较易区分;较易区分;含巯基的试剂有一定的毒性,为了安全和健康,应穿含巯基的试剂有一定的毒性,为了安全和健康,应穿实验服并戴一次性手套操作实验服并戴一次性手套操作。
上样缓冲液之三使用说明使用说明1.1.按每按每4l蛋白样品加入蛋白样品加入1l蛋白上样缓冲液的比例,混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液蛋白上样缓冲液的比例,混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5X)。
2.100或沸水浴加热或沸水浴加热35min,以充分变性蛋白。
,以充分变性蛋白。
3.冷却到室温后取上清直接上样到冷却到室温后取上清直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
胶加样孔内即可。
4.通常电泳时染料到达胶的底端附近(通常电泳时染料到达胶的底端附近(0.51cm)即可停止电泳。
即可停止电泳。
增加增加样品密度以保品密度以保证蛋白蛋白质沉入加沉入加样孔孔内内,一般上,一般上样缓冲液中加入一定冲液中加入一定浓度的度的甘油或蔗糖甘油或蔗糖,这样可以增加可以增加样品的比品的比重。
重。
上上样缓冲液中的甘油非常重要,起增加粘度的作用,冲液中的甘油非常重要,起增加粘度的作用,这可以阻止可以阻止样品品从从梳梳样孔中孔中扩散出散出来来到到电泳泳缓冲液中。
冲液中。
指示指示剂检测电泳的行泳的行进过程程,一般加入泳,一般加入泳动速率速率较快的快的溴酚溴酚蓝指示指示电泳的前沿泳的前沿。
上上样缓冲液冲液之四之四单纯的固定液一般的固定液一般难以以达达到到这些要求,因此在些要求,因此在实验中使用中使用两种两种混和的固定液。
混和的固定液。
Carnoy固定液(甲醇固定液(甲醇:
冰乙酸冰乙酸=3:
l)每次使用前需每次使用前需临时配制配制,长时间放置影放置影响响固定效果,固定固定效果,固定时间15min至至24h,冰箱、室,冰箱、室温温均均可。
可。
甲醇甲醇/冰醋酸固定液冰醋酸固定液甲醇/冰醋酸固定液甲醇甲醇:
有固定、硬化和脱水的作用。
可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白,但对核蛋白固定效果较差(亲和力小且易自溶)。
甲醇固定的特点是杀死快,渗透力强,对组织收缩较大(可收缩20左右),可使材料变硬。
冰醋酸冰醋酸:
纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶,所以又称为冰醋酸。
常用0.30.5的浓度作为固定液。
冰醋酸对材料有膨胀作用,对核蛋白固定好,可与水、酒精、氯仿混合。
染色剂考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色常用染色方法常用染色方法银染法银染法金属离子染色法金属离子染色法以考马斯亮蓝染色为例以考马斯亮蓝染色为例考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考考马斯亮斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为01000gmL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
实验步骤试剂配制试剂配制
(1)30%丙烯酰胺(丙烯酰胺(Acr):
):
称Acr30g,甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g,加蒸馏水至100ml,过滤后置棕色瓶中。
4,12月
(2)10%SDS(十二烷基磺酸钠)(3)1.5mol/LTris-HCl缓冲液缓冲液(pH8.9):
称取Tris18.2g,加入50ml水,用1mol/L盐酸调pH8.8,最后用蒸馏水定容至100ml。
(4)1.0mol/LTris-HCl缓冲液缓冲液(pH6.8):
称取Tris12.1g,加入50ml水,用1mol/L盐酸调pH6.8,最后用蒸馏水定容至100ml(5)0.05mol/LTris-HCl缓冲液缓冲液(pH8.0):
称取Tris0.6g,加入50ml水,用1mol/L盐酸调pH8.0,最后用蒸馏水定容至100ml()TEMED(四甲基乙二胺)()样品溶解液()样品溶解液:
SDS(100mg)+巯基乙醇(0.1ml)+溴酚蓝(2mg)+甘油(2g)+0.05mol/LpH8.0Tris-HCl(2ml),最后定容至10ml()固定液:
()固定液:
50%甲醇454ml,冰乙酸46ml混匀()染色液:
染色液:
称取考马斯亮蓝R2500.125g,加上述固定液250ml,过滤后备用
(1)脱色液:
)脱色液:
冰乙酸75ml,甲醇50ml,加蒸馏水定容至1000ml
(1)电极缓冲液)电极缓冲液(内含0.1%SDS,0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3):
称Tris6.0g,甘氨酸28.8g,加入SDS1g,加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml(1212)高分子量标准蛋白试剂盒:
兔磷酸化酶BMW=97,400BMW=97,400牛血清白蛋白MW=66,200MW=66,200兔肌动蛋白MW=43,000MW=43,000牛碳酸酐酶MW=31,000MW=31,000胰蛋白酶抑制剂MW=20,100MW=20,100鸡蛋清溶菌酶MW=14,400MW=14,400置-20-20保存,使用前室温融化,沸水浴中加热3-3-55分钟后上样。
(1313)样品:
兔血清.聚胶前准备
(1)配制配制10过硫酸铵溶液过硫酸铵溶液(需每天新鲜配制需每天新鲜配制)。
(2)将单体储存液、缓冲液、水按照一定比例配将单体储存液、缓冲液、水按照一定比例配制成凝胶溶液。
制成凝胶溶液。
(3)将灌胶装置准备好。
将灌胶装置准备好。
(4)待凝胶溶液平衡至室温待凝胶溶液平衡至室温(2325)后,真空后,真空脱气脱气15min。
1).安装膜具将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,将凡士林均匀的涂在两侧的封条上,用封条将玻璃板封好。
称取2g2g琼脂糖加100ml100ml蒸馏水,慢慢的煮开(煮的过程中要不断搅拌),将煮好的(无气泡)琼脂糖倒入支胶架三分之二高度,快速将两侧封好的玻璃板插入琼脂糖中,注意凹槽朝外,用夹子固定好,待凝固后灌胶。
2)制备SDS聚丙烯酰胺凝胶制备分离胶制备分离胶30%30%丙烯酰胺5ml+5ml+分离胶缓冲液5ml5ml+10%SDS0.2ml+10%+10%SDS0.2ml+10%过硫酸铵0.2ml+0.2ml+蒸馏水9.6ml9.6ml;混匀后加入8ul8ulTEMED,TEMED,立即混匀(不能有气泡),灌入安装好的垂直板中,灌胶时要匀速贴壁流入,防止气泡产生。
灌至离槽沿3cm3cm处,立即在胶面上用移液管加入1-1-2cm2cm的蒸馏水,静置,待凝胶聚合后(约30min30min),去除水相,然后用吸水纸吸干残余的水。
制备浓缩胶制备浓缩胶30%30%丙烯酰胺1.32ml+1.32ml+浓缩胶缓冲液1ml1ml+10%SDS0.08ml+10%AP0.08ml+10%SDS0.08ml+10%AP0.08ml+蒸馏水5.65.6mlml;混匀后加入8ul8ulTEMED,TEMED,立即混匀(不能有气泡),灌入垂直板至离槽沿0.5cm0.5cm处,插入梳子(不能混入气泡),静置,待凝胶聚合后,加入电泳缓冲液,拔去梳子。
先用刀片将琼脂糖剥离开,再将玻璃板从架子上取出,再用夹子固定在电泳槽内(注意凹槽朝内),将电泳缓冲液倒入电泳槽内。
3)3).样品预处理样品预处理取0.5ml0.5ml样品加入0.5ml0.5ml上样缓冲液,置沸水中煮55分钟。
4)4).上样上样第一个孔内加20ul20ul标准蛋白质溶液其他每孔加入20ul20ul样品。
上样时要将移液枪头垂直插入孔内且要缓慢匀速推入样品。
垂直板垂直板电泳装置泳装置加加样样品品迁迁移方向移方向5)5).电泳电泳接通电源,将电压调至80V80V、50mA50mA。
当溴酚兰进入分离胶后,把电压提高到150V150V、80mA80mA,电泳至溴酚兰距离胶底部1-2cm1-2cm处,停止电泳。
6)6).固定固定取下凝胶,置于培养皿中的固定液中,轻轻振摇1010分钟,倒去固定液。
7)7).染色脱色染色脱色培养皿中倒入50-50-6060度预热的染色液浸没凝胶,约4040分钟后回收染色液,用清水冲洗掉胶上多余的染色液。
倒入脱色液,脱色22小时,期间换脱色液2-32-3次。
电泳泳过程中分子程中分子迁迁移的移的规律,小分子走在前律,小分子走在前头,大分子大分子滞滞后。
后。
电泳凝泳凝胶胶相相当当于凝于凝胶胶过滤中的一中的一个个带孔孔胶胶粒。
粒。
混合混合样品品带孔孔胶胶按分子按分子大小分离大小分离电泳方向泳方向电泳泳小分子小分子大分子大分子夹在在两两块玻璃玻璃板之板之间的凝的凝胶胶电泳泳缓冲液冲液电泳泳缓冲液冲液加在槽中的加在槽中的经SDS处理的理的样品品分子量小分子量小分子量大分子量大电源源电泳后的凝泳后的凝胶胶经考考马斯亮斯亮蓝染色、染色、脱脱色后的凝色后的凝胶胶照片照片图1标准蛋白质与待测样品电泳图谱940006200043000310002010014400注:
胶槽1标准蛋白;胶槽2、3样品蛋白.结果处理标准蛋白分子量准蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝在一定的凝胶胶浓度下,度下,多多肽链分子量的分子量的对数与数与多多肽链的相的相对迁迁移率成移率成线性性关关系,所以可以通系,所以可以通过标准曲准曲线求未知多求未知多肽链分子量分子量。
相对迁移率相对迁移率实验注意事项1.1.形成凝胶的试剂要有足够的形成凝胶的试剂要有足够的纯度纯度:
丙烯酰胺是形成凝胶溶液中的最主要成份,其纯度的好坏将直接影响凝胶的质量,丙烯:
丙烯酰胺是形成凝胶溶液中的最主要成份,其纯度的好坏将直接影响凝胶的质量,丙烯酰胺可能混有的影响凝胶形成的杂质有:
线性多聚丙烯酰胺、金属离子等。
酰胺可能混有的影响凝胶形成的杂质有:
线性多聚丙烯酰胺、金属离子等。
2.2.注意不能随便倾倒注意不能随便倾倒单体溶液单体溶液,应加入过量的催化剂使其完全聚合成无毒性的聚丙烯酰胺后,应加入过量的催化剂使其完全聚合成无毒性的聚丙烯酰胺后再弃置。
再弃置。
3.TEMED中混有氧化试剂后其自身极易被氧化而失中混有氧化试剂后其自身极易被氧化而失去催化能力,另外去催化能力,另外TEMED的氧化产物的氧化产物呈黄呈黄色色,以此可以鉴定,以此可以鉴定TEMED的质量。
如果无的质量。
如果无法获得无色透明的法获得无色透明的TEMED,只能适当增加,只能适当增加用量以保证聚胶速度。
用量以保证聚胶速度。
4.过硫酸铵过硫酸铵容易吸潮,由于它溶解于水后很快降解失去催化能力,因此潮解后的过硫酸铵会渐渐失容易吸潮,由于它溶解于水后很快降解失去催化能力,因此潮解后的过硫酸铵会渐渐失去活性。
保存固体过硫酸铵应密闭干燥。
过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。
另外在配制凝去活性。
保存固体过硫酸铵应密闭干燥。
过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。
另外在配制凝胶溶液时过硫酸铵不易过量,否则会使蛋白质在电泳过程中被氧化胶溶液时过硫酸铵不易过量,否则会使蛋白质在电泳过程中被氧化(主要指天然无变性剂主要指天然无变性剂凝胶凝胶)。
5.激活剂的用量激活剂的用量:
激活剂的浓度适当与否不仅可以决定凝胶聚合的速度,也将影响凝胶的质量。
增加过激活剂的浓度适当与否不仅可以决定凝胶聚合的速度,也将影响凝胶的质量。
增加过硫酸铵或硫酸铵或TEMED的用量,将使丙烯酰胺聚合链长度缩短,凝胶会变得脆弱而失去应有的的用量,将使丙烯酰胺聚合链长度缩短,凝胶会变得脆弱而失去应有的柔性。
二者多至一定程度时,聚合链长度过短,将不会形成肉眼可见的凝胶,这些短柔性。
二者多至一定程度时,聚合链长度过短,将不会形成肉眼可见的凝胶,这些短链多聚物呈溶液状,只是其粘度较聚合前高一些。
链多聚物呈溶液状,只是其粘度较聚合前高一些。
6.温度的影响温度的影响聚胶的最佳温度为聚胶的最佳温度为2325,需要注意灌胶前单体溶液,需要注意灌胶前单体溶液(通常置于通常置于4冰箱冰箱)及玻璃板或管及玻璃板或管(有时从烘箱取出有时从烘箱取出)也要平衡也要平衡至此温度。
由于溶液在抽真空时仍维持较低温度,需待其升至室温后再脱气,另外升至此温度。
由于溶液在抽真空时仍维持较低温度,需待其升至室温后再脱气,另外升温后脱去氧气的速度较低温时快。
温后脱去氧气的速度较低温时快。
7.氧气的影响氧气的影响氧气会与被激活的单体自由基作用抑制聚合过程,因此需在加激活剂前对单体溶液脱气。
氧气会与被激活的单体自由基作用抑制聚合过程,因此需在加激活剂前对单体溶液脱气。
如果省去这一步骤,凝胶仍能聚合但需更多的激活剂,并且不能保证很好的重复性,充分如果省去这一步骤,凝胶仍能聚合但需更多的激活剂,并且不能保证很好的重复性,充分去除氧气可以用尽量少的激活剂得到最佳聚合效果。
通常在较好的真空度脱气至少去除氧气可以用尽量少的激活剂得到最佳聚合效果。
通常在较好的真空度脱气至少15min。
8.凝胶添加剂:
凝胶添加剂:
凝胶中常常加入凝胶中常常加入SDS、尿素、尿素、TritonX-100等添加剂。
等添加剂。
SDS加入后不会对凝胶加入后不会对凝胶的聚合产生影响,但尿素会使凝胶孔径的聚合产生影响,但尿素会使凝胶孔径变小,这一特性可用来分离小分子蛋白变小,这一特性可用来分离小分子蛋白质或多肽。
质或多肽。
9.聚胶时间:
聚胶时间:
虽然应用过硫酸铵虽然应用过硫酸铵TEMED催化后灌胶催化后灌胶1520min即可观察到凝胶的形成,但至少需即可观察到凝胶的形成,但至少需90min才能保证才能保证95以上的单链聚合成长短以上的单链聚合成长短以及具有合适的孔径大小。
采用核黄素时以及具有合适的孔径大小。
采用核黄素时聚胶时间需更长,但它一般用于等电聚焦聚胶时间需更长,但它一般用于等电聚焦即根据蛋白质的电荷性质进行分离,对孔即根据蛋白质的电荷性质进行分离,对孔径大小要求不高,因此不必等很长时间径大小要求不高,因此不必等很长时间(完全聚合需完全聚合需8h)。
10.单体的浓度单体的浓度:
是指单体总重量是指单体总重量(丙烯酰胺丙烯酰胺+bis)在溶液中的百分比在溶液中的百分比(wv),可选择的范围为,可选择的范围为330,单体浓度增加后聚合速度将加快,因此可适当减少催化剂的用量。
单体浓度增加后聚合速度将加快,因此可适当减少催化剂的用量。
11.SDS与蛋白质的结合按质量成比例与蛋白质的结合按质量成比例(即:
(即:
1.4gSDS/g蛋白质),蛋白质含量不可以超标,否则蛋白质),蛋白质含量不可以超标,否则SDS结合量不足。
结合量不足。
12.用用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时,必须同时作标准曲线。
不能利用这次的聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时,必须同时作标准曲线。
不能利用这次的标准曲线作为下次用。
并且标准曲线作为下次用。
并且SDS-PAGE测定分子量有测定分子量有10误差,不可完全信任。
误差,
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- 实验 SDSPAGE 凝胶电泳
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