分子实验室细胞实验室常用配方.docx
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分子实验室细胞实验室常用配方
分子实验室、细胞实验室常用配方
(一)WB相关试剂及常用缓冲液
●RIPA(100mI)(最后要调pH为7.4)
终浓度
分子量
称取
Tris-HCI(pH7.4)
50mM
121.14
605.7mg
NaCI
150mM
58.44
876.6mg
TritonX-100
1%
1mI
脱氧胆酸钠
1%
1g
EDTA
1mM
292.248
29.2248mg
SDS
0.1%
0.1g
PMSF(100mM)
使用时每1ml加10ul
●10%过硫酸铵溶液AP(分装保存于-20度)
AP粉末1g
ddH2010ml
●10%SDS(十二烷基硫酸钠):
SDS粉末10g
ddH20定容到100ml
注意:
用磁力搅拌器搅拌不会容易起泡泡
●6X蛋白质samplebuffer
Tris-HCl(1M,pH6.8)30mL
SDS10g
甘油30mL
DTT(154.25)9.3g
溴酚蓝0.06g
ddH20定容至100mL
●10XPBS缓冲液的配制:
NaCl80g
KCl2g
Na2HPO414.4g(十二水合36g)
KH2PO402.4g
加800mLddH2O,根据开始的pH用NaOH或HCL调pH到7.4,调好pH再定容到1升。
配好后用高压蒸气灭菌后常温保存最好是在4度
●PBST(1X)
PBS(1X)500ml
Tween20500μl
●50×Tris-乙酸(TAE)缓冲液配制1L溶液各成分的用量
Tris粉末242g
冰醋酸57.1ml
Na2EDTA·2H2O37.2g
ddH20定容到1L
●封闭液
脱脂奶粉5g
叠氮钠0.02g(现配现用时可不加)
PBS定容到100mL
●染色液(室温)
1L
500ml
200ml
100ml
甲醇
500mL
250
100
50
乙酸
100mL
50
20
10
R250考马斯亮蓝
0.5g
0.25g
0.1g
0.05g
H20
400mL
200
80
40
●脱色液:
(室温)
甲醇165mL
乙酸50mL
H20785mL
●8.8Buffer:
(调pH至8.8,4度保存)
100ml
200ml
Tris
18.17g
36.34g
10%SDS
4mL
8ml
ddH20
定容至100mL
200ml
●6.8Buffer:
(调pH至6.8,4度保存)
100ml
200ml
Tris
6.06g
12.12g
10%SDS
4mL
8ml
ddH20
定容至100mL
200ml
●转移缓冲液(10×transbuffer):
(常温保存)
1L
2L
甘氨酸
144g
288g
Tris粉末
30.3g
60.6
ddH20
定容至1L
定容至2L
使用时甲醇200mL
转移缓冲液(10×)100mL
ddH20700mL
●电泳缓冲液(10×)(runningbuffer):
(常温保存)
1L
2L
甘氨酸
144g
288g
Tris粉末
30.3g
60.6
SDS
10g
20g
ddH20
定容至1L
定容至2L
●10Х)TBS:
(常温保存)
NaCl80.0g
Tris粉末24.2g
ddH20定容至1L
●TBST(1X)
TBS(1X)500ml
Tween20500μl
●Strippingbuffer(可反复利用)温老师组配方
10%SDS10ml
Β-巯基乙醇350μl
Tris-HCI(pH6.8)6.25ml(6.06加到50mL水)
加入ddH2O至50mL
●Strippingbuffer(可反复利用)郭老师给配方
甘氨酸15g
SDS1g
Tween201ml
ddddH2O1L
作这个buffer洗20min,然后用PBST洗3次,再重新封闭孵抗体。
(二)细胞和细菌培养基、抗生素
●LB培养基(当天灭菌后放4度存放)
1000ml
500ml
300ml
250ml
200ml
氯化钠
10g
5g
3g
2.5g
2g
蛋白胨
10g
5g
3g
2.5g
2g
酵母提取物
5g
2.5g
1.5g
1.25g
1g
ddH20
定容至1000ml
定容至500ml
定容至300ml
定容至250ml
定容至200ml
●LB平板:
(当天灭菌后倒平板,放4度存放)
1000ml
500ml
300ml
250ml
200ml
氯化钠
10g
5g
3g
2.5g
2g
蛋白胨
10g
5g
3g
2.5g
2g
酵母提取物
5g
2.5g
1.5g
1.25g
1g
琼脂
15g
7.5g
4.5g
3.725g
3g
ddH20
定容至1000ml
定容至500ml
定容至300ml
定容至250ml
定容至200ml
●SOB培养基
将下列组分溶解在0.9L水中:
蛋白胨20g
酵母提取物5g
氯化钠0.5g
1mol/L氯化钾2.5ml
用水补足体积到1L。
分成100ml的小份,高压灭菌。
培养基冷却到室温后,再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁
●1MIPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(分子量为238.3))溶液
IPTG粉末2.383g
ddH20定容到10ml
用0.22μm滤器过滤除菌,分装成1ml小份贮存于-20℃。
●Amp+(50mg/ml)
Amp+粉末50mg
ddH201ml
注意:
分装保存于-20度,使用时按1000:
1的比例用
●Kana+(50mg/ml)
Kana+粉末50mg
ddH201ml
注意:
分装保存于-20度,使用时按1000:
1的比例用
●胰酶:
抽滤,长期保存可放负20度
粉末0.25g
EDTA0.02-0.03g
1XPBS100ml
●高糖DMEM培养基:
抽滤保存在4度
粉末全部
碳酸氢钠3.7g
ddH20定容到1L(用盐酸调pH值到:
7.2-7.4)
●G418母液(100mg/ml)用0.22μM滤菌,分装存于-20度
粉末1g
PBS10ml
●zeocin母液(100mg/ml)用0.22μM滤菌,分装存于-20度
粉末1g
ddH2O10ml
●Blasticidin(100mg/ml)用0.22μM滤菌,分装存于-20度
粉末0.3g
PBS10ml
(三)利用His-tag从细菌中纯化蛋白配方
透析液配方
终浓度
母液浓度
量取体积
Tris-HCl(pH:
8.0)
20mM
1M
20ml
NaCl
20mM
4M
5ml
MgCl2
2mM
1M
2ml
DTT
1mM
1M
1ml
甘油
50%
500ml
ddH2O
472ml
●超声裂解液(lysisbuffer):
2011年做蛋白纯化时用
Na3PO4(164)8.2g(50mM)
NaCl(58.5)17.55g(300mM)
加800mLddH2O溶解,用2MNaOH或者2MHCL调pH到8.0,再定容到1升。
配好后用高压蒸气灭菌后常温保存。
●洗涤液(washbuffer):
2011年做蛋白纯化时用
Na3PO48.2g(50mM)
NaCl17.55g(300mM)
咪唑0.681g(10mM)
加800mLddH2O溶解,根据开始的pH用2MNaOH或者2MHCL调pH到8.0,调好pH再定容到1升
●洗脱液(elutionbuffer):
2011年做蛋白纯化时用
Na3PO48.2g(50mM)
NaCl17.55g(300mM)
咪唑17.025g(250mM)
加800mLddH2O溶解,根据开始的pH用2MNaOH或者2MHCL调pH到8.0,调好pH再定容到1升)
PrepEase®Histidine-TaggedProteinPurificationKits-HighSpecificity
●8XLEWBuffer(Lysis-Equilibrium-WashBuffer):
(室温保存)pH:
8.0
NaH2PO4.2H2O6.2404g(400mM)
NaCl14.0256g(2.4M)
dH20定容到100mL(调节pH:
8.0)
●4XElutionBuffer:
(室温保存)pH:
8.0
NaH2PO4.2H2O3.1202g(200mM)
NaCl7.0128g(1.2M)
咪唑6.81g(1M)
dH20定容到100mL(调节pH:
8.0)
●EDTA:
(100mM)
EDTA2.923g
dH20定容到100mL
●NiSO4:
NiSO4.6H2O2.6285g(100mM)
dH20定容到100mL
●溶菌酶:
(使用时1ml溶液加入20ul)
粉末50mg
ddH201mL
(四)利用His-tag从细胞中富集蛋白配方
●磷酸钠缓冲液
按图示比例混合0.2MNa2HPO4溶液和0.2MNaH2PO4溶液,得到两种缓冲液,pH分别调节成为8.0和6.3.
pH
0.2MNa2HPO4体积/mL
0.2MNaH2PO4体积/mL
6.3
11.25
38.75
8.0
47.35
2.65
●细胞裂解液(最好新鲜配制,当天使用)
Celllysisbuffer
终浓度
配10ml
配15ml
配20ml
配40ml
配30ml
盐酸胍(g)
6M
5.7318
8.5977
11.4636
22.9272
17.1954
Tris(g)
10mM
0.012114
0.018171
0.024228
0.048456
0.036342
pH8.0buffer(ml)
100mM
5
7.5
10
20
15
(注意胍盐是有害试剂注意这里用的磷酸钠缓冲液pH必须8.0!
)
(注意二价阳离子螯合剂,还原剂,会导致镍从树脂上的洗脱)
本实验的所有试剂中EDTA浓度不得超过1mM,DTT浓度不超过5mM,巯基乙醇浓度不超过20mM。
●pH8.0的洗脱溶液(最好新鲜配制,当天使用)
pH8.0的washbuffer
终浓度
配100ml
配50ml
配20ml
配40ml
配30ml
Urea尿素(g)
8M
48.048
24.024
9.6096
19.2192
14.4144
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- 分子 实验室 细胞 常用 配方