分子教案第三章DNA的生物合成.docx
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分子教案第三章DNA的生物合成
第三章DNA的生物合成
教学重点:
1.DNA的半保留复制及DNA的半不连续复制2.DNA复制的方式3.DNA复制的调控
教学难点:
线形DNA复制末端问题的解决
教学时数:
7学时
教学要求:
1.掌握并理解DNA复制的特点
2.掌握并理解DNA复制的过程
3.掌握并理解DNA复制的主要方式
4.掌握并理解线性DNA复制末端缩短问题的解决方式
5.了解DNA复制的调控方式
教学方式:
讲述、演示与计算机辅助教学
教学内容:
1.DNA复制的特点
证明DNA是遗传物质的两个关键性实验:
首先用实验证明基因就是DNA分子的是美国的微生物学家Avery.他的实验是用肺炎球菌感染小鼠。
美国遗传学家Hershey用T2噬菌体感染大肠杆菌实验,也证明DNA是遗传物质。
这两个实验中主要的论点证据是:
生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能。
目前认为生物界遗传信息传递的中心法则为
ReplicationofduplexDNAisacomplexendeavorinvolvingaconglomerateofenzymeactivities.Differentactivitiesareinvolvedinthestagesofinitiation,elongation,andtermination.
图1双螺旋DNA的复制
1.1DNA的半保留复制(semiconservativereplication)
Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时即推测,DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开,然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链,这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA,另一条链是新合成的,这种复制方式为半保留复制。
1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制,他们将大肠杆菌放在含有15N标记的NH4Cl培养基中繁殖了15代,使所有的大肠杆菌DNA被15N所标记,可以得到15N桪NA。
然后将细菌转移到含有14N标记的NH4Cl培养基中进行培养,在培养不同代数时,收集细菌,裂解细胞,用氯化铯(CsCl)密度梯度离心法观察DNA所处的位置。
由于15NDNA的密度比普通DNA(14N-DNA)的密度大,在氯化铯密度梯度离心(densitygradientcentrifugation)时,两种密度不同的DNA分布在不同的区带。
实验结果表明:
在全部由15N标记的培养基中得到的15N桪NA显示为一条重密度带位于离心管的管底。
当转入14N标记的培养基中繁殖后第一代,得到了一条中密度带,这是15N桪NA和14N-DNA的杂交分子。
第二代有中密度带及低密度带两个区带,这表明它们分别为15N14N-DNA和14N14N-DNA。
随着以后在14N培养基中培养代数的增加,低密度带增强,而中密度带逐渐减弱,离心结束后,从管底到管口,CsCl溶液密度分布从高到低形成密度梯度,不同重量的DNA分子就停留在与其相当的CsCl密度处,在紫外光下可以看到DNA分子形成的区带。
为了证实第一代杂交分子确实是一半15N-DNA-半14N-DNA,将这种杂交分子经加热变性,对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心,结果变性前的杂交分子为一条中密度带,变性后则分为两条区带,即重密度带(15N-DNA)及低密度带(14N-DNA)。
它们的实验只有用半保留复制的理论才能得到圆满的解释(图2和16-3)。
图2 DNA的半保留复制第一代分子含有一条亲代的链(用黑色素示),与另一条新合成的链(用白色表示)配对。
在以后的连续复制过程中,原来亲代的两条链仍然保持完整,因此总有两个分子各具有一条原来亲代的链
图3 DNA的半保留复制-MeslsonStahl实验密度梯度离心后的DNA
位置:
左三管为对照;右三管为实验结果
1.2半不连续性复制(DNAsynthesisissemidiscontinuous)
LaggingstrandofDNAmustgrowoverallinthe3´-5´directionandissynthesizeddiscontinuouslyintheformofshortfragments(5´-3´)thatarelaterconnectedcovalently.
LeadingstrandofDNAissynthesizedcontinuouslyinthe5´-3´direction.
Okazakifragmentsaretheshortstretchesof1000-2000basesproducedduringdiscontinuousreplication;theyarelaterjoinedintoacovalentlyintactstrand.
Semidiscontinuousreplicationismodeinwhichonenewstrandissynthesizedcontinuouslywhiletheotherissynthesizeddiscontinuously.
∙OntheleadingstrandDNAsynthesiscanproceedcontinuouslyinthe5′to3′directionastheparentalduplexisunwound.
∙Onthelaggingstrandastretchofsingle-strandedparentalDNAmustbeexposed,andthenasegmentissynthesizedinthereversedirection(relativetoforkmovement).Aseriesofthesefragmentsaresynthesized,each5′3′;thentheyarejoinedtogethertocreateanintactlaggingstrand.
2.参与DNA复制的有关物质
2.1DNApolymerasesinprokaryotic
DNApolymerasesareenzymesthatsynthesizeadaughterstrand(s)ofDNA(underdirectionfromaDNAtemplate).Maybeinvolvedinrepairorreplication.
DNA聚合酶Ⅰ,(DNApolymeraseⅠ,简写DNApolⅠ)、DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。
(DNApolymeraseⅡ,Ⅲ,简写DNApolⅡ,DNApolⅢ)见表1。
这种酶的共同性质是:
①需要DNA模板,因此这类酶又称为依赖DNA的DNA聚合酶(DNAdependentDNApolymerase,DDDP)。
②需要RNA或DNA做为引物(primer),即DNA聚合酶不能从头催化DNA的起始。
③催化dNTP加到引物的3′桹H末端,因而DNA合成的方向是5′→3′。
④三种DNA聚合酶都属于多功能酶,它们在DNA复制和修复过程的不同阶段发挥作用。
由于DNA聚合酶Ⅰ是研究得最清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点,所以我们着重介绍DNApolⅠ的作用并指出另外二种DNApol的特殊性:
DNApolymerasestypicallyhavenucleaseactivitiesaswellastheabilitytosynthesizeDNA.A3′5′exonucleaseactivityistypicallyusedtoexcisebasesthathavebeenaddedtoDNAincorrectly.Thisprovidesa"proofreading"error-controlsystem,asweseeinthenextsection.
2.1.1DNA聚合酶Ⅰ(DNApolymeraseI)
ThefirstenzymetobecharacterizedwasDNApolymeraseI,whichisasinglepolypeptideof103kD.Thechaincanbecleavedintotworegionsbyproteolytictreatment.
Thelargercleavageproduct(68kD)iscalledtheKlenowfragment.Itisusedinsyntheticreactionsinvitro.Itcontainsthepolymeraseandthe3′5′exonucleaseactivities.TheC-terminaltwo-thirdsoftheproteincontainsthepolymeraseactivesite,whiletheN-terminalthirdcontainstheproofreadingexonuclease.Theactivesitesare~30Åapartintheprotein,indicatingthatthereisspatialseparationbetweenaddingabaseandremovingone.
Thesmallfragment(35kD)possessesa5′3′exonucleolyticactivity,whichexcisessmallgroupsofnucleotides,upto~10basesatatime.Thisactivityiscoordinatedwiththesynthetic/proofreadingactivity.ItprovidesDNApolymeraseIwithauniqueabilitytostartreplicationinvitroatanickinDNA.(NootherDNApolymerasehasthisability.)Atapointwhereaphosphodiesterbondhasbeenbrokeninadouble-strandedDNA,theenzymeextendsthe3′OHend.AsthenewsegmentofDNAissynthesized,itdisplacestheexistinghomologousstrandintheduplex.
(1)DNA聚合酶的5′→3′聚合活性:
(2)DNA聚合酶的3′→5′外切核酸酶活性:
(3)DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性:
许多实验证实DNApolⅠ并不是DNA复制过程中的主要酶,它的作用主要与DNA损伤后的修复有关。
2.1.2DNA聚合酶Ⅱ(DNApolymeraseⅡ)
此酶分子量为120KD,每个细胞约有100个酶分子,但活性只有DNApolⅠ的5%,它具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性,而没有5′→3′外切活性,它的作用可能与DNA损伤修复有关。
2.1.3DNA聚合酶Ⅲ(DNApolymeraseⅢ)
这是在DNA复制过程中起主要作用的聚合酶,它是由一个多亚基组成的蛋白质分子,其分子量>600kDa整个酶分子形成一个不对称的二聚体,每个大肠杆菌细胞中只有10?
0个酶分子,但催化dNTP参入DNA链的速率却是最快的,约为9000核苷酸/每分钟/每个酶分子。
这也证明DNApolⅢ是DNA复制过程中主要发挥作用的酶。
在大肠杆菌染色体DNA进行复制时,DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是单独起作用的,而是与引发体,介链酶等构成一个复制体(replisome)。
由于复制体的存在,先导链和随从链可以同时复制。
DNApolⅢ是由多亚基组成的不对称二聚体,它可能同时负责先导链和随从链的复制,在φ×174的复制中观察到引发体总是伴随着DNAloop的存在。
DNApolymeraseIII(thereplicase)isalargeenzymecomplex.ThereplicaseactivitywasoriginallydiscoveredbyalethalmutationinthednaElocus,whichcodesforthe130kDαsubunitthatpossessestheDNAsyntheticactivity.The3′5′exonucleolyticproofreadingactivityisfoundinanothersubunit,ε,codedbydnaQ.ThebasicroleoftheεsubunitincontrollingthefidelityofreplicationinvivoisdemonstratedbytheeffectofmutationsindnaQ:
thefrequencywithwhichmutationsoccurinthebacterialstrainisincreasedby>103fold.
表1 大肠杆菌DNA聚合酶特征
DNA聚合酶Ⅰ
DNA聚合酶Ⅱ
DNA聚合酶Ⅲ
分子量
109KD
120KD
>600KD
每个细胞中的分子数
400
17-100
10-20
5′→3′聚合活性
+
+
+
37℃转化率核苷酸数/酶分子·分钟
600
30
30,000
5′→3′外切活性
+
-
-
3′→5′外切活性
+
+
+
切刻平移活性
+
-
-
对dNTP亲和力
低
低
高
功能
修复
不详
复制
去除引物
填补空缺
2.2真核生物DNA聚合酶(DNApolymerasesinprokaryotic)
真核生物DNA聚合酶有α、β、γ、δ及ε。
它们的基本特性相似于大肠杆菌DNA聚合酶,其主要活性是催化dNTP的5′→3′聚合活性,基本特征见表2。
表2 真核生物DNA聚合酶
α
β
γ
δ
ε
亚基数
4
4
4
2
5
分子量(KD)
>250
36-38
160-300
170
256
细胞内定位
核
核
线粒体
核
核
5′→3′聚合活性
+
+
+
+
+
3′→5′外切活性
-
-
-
-
-
功能
复制、引发
修复
复制
复制
复制
真核细胞在DNA复制中起主要作用的是DNApolα,主要负责染色体DNA的复制。
DNApolβ的模板特异性是具有缺口的DNA分子,被认为它与DNA修复有关。
DNApolγ在线粒体DNA的复制中起作用。
DNApolδ不但有5′→3′聚合活性,而且还具有3′→5′外切酶活性,据认为真核生物DNA复制是在DNApolα和DNApolδ协同作用下进行的,前导链的合成靠DNApolδ催化。
而随从链的合成靠DNApolα和引发酶配合作用完成。
2.3DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质:
2.3.1.解链酶(helicase)
DNA开始复制时首先在起始点处解开双链,反应是在一种解链酶(helicase)的催化下进行的。
解链酶需要ATP分解供给能量。
大肠杆菌中DnaB蛋白就有介链酶活性,与随从链的模板DNA结合,沿5′→3′方向移动,还有一种叫做Rep蛋白和前导链的模板DNA结合沿3′→5′方向移动。
解链酶的作用就是打开DNA双链之间的氢键。
2.3.2单链结合蛋白:
(singlestrandbindingproteins,SSBP)
它与解开的单链DNA结合,使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解,保证了单链DNA做为模板时的伸展状态,SSBP可以重复利用。
2.3.3引发体的形成:
Primerisashortsequence(oftenofRNA)thatispairedwithonestrandofDNAandprovidesafree3´-OHendatwhichaDNApolymerasestartssynthesisofadeoxyribonucleotidechain.
(1)引物酶(primase)
Aprimaseisrequiredtocatalyzetheactualprimingreaction.ThisisprovidedbyaspecialRNApolymeraseactivitythatistheproductofthednaGgene.Theenzymeisasinglepolypeptideof60kD(muchsmallerthanRNApolymerase).TheprimaseisanRNApolymerasethatisusedonlyunderspecificcircumstances,thatis,tosynthesizeshortstretchesofRNAthatareusedasprimersforDNAsynthesis.DnaGprimaseassociatestransientlywiththereplicationcomplex,andtypicallysynthesizesan1112baseprimer.PrimersstartwiththesequencepppAG,oppositethesequence3′GTC5′inthetemplate.
(2)引发体(primosome)
高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合上来,共同形成引发体,引发体主要在DNA随从链上开始,它连续地与引物酶结合并解离,从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物,在引物RNA的3′桹H末端接下去合成DNA片段,这就是随从链不连续合成的开始。
2.4与超螺旋松驰有关的酶:
拓扑异构酶(topoisomerase)是一类改变DNA拓扑性质的酶。
在体外可催化DNA的各种拓扑异构化反应,而在生物体内它们可能参与了DNA的复制与转录。
在DNA复制时,复制叉行进的前方DNA分子部分产生有正超螺旋,拓扑酶可松驰超螺旋,有利于复制叉的前进及DNA的合成。
DNA复制完成后,拓扑酶又可将DNA分子引入超螺旋,使DNA缠绕、折叠,压缩以形成染色质。
DNA拓扑异构酶有Ⅰ型和Ⅱ型,它们广泛存在于原核生物及真核生物中。
表3 大肠杆菌和真核生物中的拓扑异构酶
类型
作用
对超螺旋的作用
Ⅰ型拓扑异构酶
大肠杆菌
切开一股DNA链
松驰负超螺旋
真核生物
切开一股DNA链
松驰正,负超螺旋
Ⅱ型拓扑异构酶
大肠杆菌
切开二股DNA链
松弛正超螺旋;
依赖ATP
引入负超螺旋,
解环连等
真核生物
切开二股DNA链
松驰正超螺旋,
依赖ATP
但不能引入负超螺旋
拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)的主要作用是将环状双链DNA的一条链切开一个口,切口处链的末端绕螺旋轴按照松驰超螺旋的方向转动,然后再将切口封起来。
这就使DNA复制叉移动时所引起的前方DNA正超螺旋得到缓解,利于DNA复制叉继续向前打开。
拓扑异构酶Ⅰ除上述作用外,对环状单链DNA还有打结或解结作用,对环状双链DNA的环连或解环连以及使环状单链DNA形成环状双链DNA都有作用(图13)。
拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)是在大肠杆菌中发现的,曾被称为旋转酶(gyrase),它们作用特点是切开环状双链DNA的两条链,分子中的部分经切口穿过而旋转,然后封闭切口,TopoⅡ还可使DNA分子从超螺旋状态转变为松驰状态,此反应不需要ATP参与。
DNA复制完成后,TopoⅡ在ATP参与下,DNA分子从松驰状态转变为负超螺旋。
此外,TopoⅡ催化的拓扑异构化反应还有环连或解环连,以及打结或解结。
3DNA复制的过程:
∙Initiationinvolvesrecognitionofanoriginbyacomplexofproteins.BeforeDNAsynthesisbegins,theparentalstrandsmustbeseparatedand(transiently)stabilizedinthesingle-strandedstate.Thensynthesisofdaughterstrandscanbeinitiatedatthereplicationfork.
∙Elongationisundertakenbyanothercomplexofproteins.ThereplisomeexistsonlyasaproteincomplexassociatedwiththeparticularstructurethatDNAtakesatthereplicationfork.Itdoesnotexistasanindependentunit(forexample,analogoustotheribosome.AsthereplisomemovesalongDNA,theparentalstrandsunwindanddaughterstrandsaresynthesized.
∙Attheendofthereplicon,joiningand/orterminationreactionsarenecessary.Followingtermination,theduplicatechromosomesmustbeseparatedfromoneanother,whichrequiresmanipulationofhigher-orderDNAstructure.
DNA复制的全部过程可以人为地分成三个阶段,第一个阶段为DNA复制的起始阶段,这个阶段包括起始点,复制方向以及引发体的形成,第二阶段为DNA链的延长,包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段。
第三阶段为DNA复制的终止阶段。
3.1DNA复制的起始阶段:
3.1.1D
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