木糖醇对黏性放线菌生长及产酸影响的体外研究.docx

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木糖醇对黏性放线菌生长及产酸影响的体外研究

木糖醇对黏性放线菌生长及产酸影响的体外研究

[文章编号]1000-1182（2014）03-0217-04

　　[摘要]目的对比不同质量浓度下木糖醇对黏性放线菌生长及产酸的影响。

方法分别用含不同质量浓度（128、64、32、16、8、4g?

L-1）木糖醇的脑心浸液（BHI）液体培养基在厌氧条件下培养黏性放线菌，测定其最小抑菌质量浓度（MIC）；然后测量对照组以及1/2、1/4、1/8MIC和MIC质量浓度时培养1.5、3、6、12、24、48h液体培养基的pH值，计算ΔpH值，同时测量2、4、6、8、10、12h液体培养基的光密度（OD550）值；最后测定抑制50%及90%黏性放线菌生物膜形成的最低木糖醇质量浓度（即MBIC50和MBIC90）。

运用SPSS19.0进行数据分析。

结果木糖醇能抑制黏性放线菌的生长，MIC为64g?

L-1。

培养12h后，各组之间的ΔpH值差异均有统计学意义（P0.05），OD550值随MIC质量浓度的增加而减小。

提示黏性放线菌在含1/2MIC及MIC的木糖醇培养基里生长及产酸能力随木糖醇质量浓度的升高而下降。

木糖醇的MIBC50为64g?

L-1，MIBC90为128g?

L-1，说明木糖醇培养基能抑制黏性放线菌生物膜的形成。

结论木糖醇能有效地抑制黏性放线菌的生长、黏附以及产酸，有一定的抑制致龋菌和防治龋病的效果。

　　[关键词]木糖醇；黏性放线菌；生长；产酸

　　[中图分类号]R780.2[文献标志码]A[doi]10.7518/hxkq.2014.03.002

　　InvitrostudyofxylitolonthegrowthandacidproductionofActinomycesviscosusGuoHouzuo,XiaoYao,LianXiao-tian,ZouLing.（StateKeyLaboratoryofOralDiseases,WestChinaHospitalofStomatology,SichuanUniversity,Chengdu610041,China）

　　[Abstract]ObjectiveThisresearchaimedtostudytheinhibitoryeffectofxylitolonthegrowthandacidproductionofActinomycesviscosus（A. viscosus）.MethodsWecultivatedA. viscosusinanaerobicconditionswithdifferentconcentra-tions（128,64,32,16,8,and4g?

L−1）ofxylitolbrainheartinfusionliquidmediumanddeterminedtheminimuminhibitoryconcentration（MIC）.Subsequently,wemeasuredthepHvalueofthecontrolgroup,aswellasthoseof1/2,1/4,1/8MIC,andMICconcentrationgroupsat1.5,3,6,12,24,and48h.TheΔpHandOD550at2,4,6,8,10,and12hwerecalculated.Wediscoveredthattheminimumxylitolconcentrationssuppressed50%and90%A. viscosusbiofilmformation（i.e.,MBIC­50andMBIC90）.SPSS19.0wasusedtoanalyzethecollecteddata,andconclusionsweredrawnafterward.ResultsXylitolinhibitedthegrowthofA. viscosusatMICof64g?

L-1.After12h,thedifferencesofpHvalueamonggroupswereallstatisti-callysignificant（P0.05）,andOD550alsoincreasedwhentheMICconcentrationdecreased.TheseresultsimplythattheabilityofA. viscosustogrowandproduceacidin1/2MICandMICconditionswillbereducedwiththeincreaseinxylitolconcentration.ThevalueofMIBC50was64g?

L-1,whereasthevalueofMIBC90was128g?

L-1.ThisfindingindicatesthatthexylitolmediumcanrestrictA. viscosusbiofilmformation.ConclusionXylitolcaneffectivelyinhibitthegrowth,adhesion,andacidproductionofA. viscosus,protectingteethfromcariogenicbac-teriaandpreventingcariestoacertainextent.

　　[Keywords]xylitol;Actinomycesviscosus;growth;acidproduction

　　木糖醇是木糖代谢的正常中间产物，长期食用含木糖醇的食品可以明显降低各类龋坏的发病率，减少口腔中变异链球菌的数量[1-2]。

体外研究[3]表明，木糖醇对于口腔牙菌斑生物膜形成有抑制作用，但具体机制不明。

黏性放线菌是口腔固有菌群的主要成员，能发酵多种碳水化合物产酸，对牙面尤其是牙骨质具有极强的黏附能力，在根面牙菌斑形成过程中发挥重要作用。

目前研究[4-5]认为，黏性放线菌的黏附以及产酸能力可能与根面龋的发生有密切关系。

目前木糖醇对黏性放线菌的黏附及产酸能力影响的报道还较少，本实验采用生长曲线测量和pH值检测分析木糖醇对黏性放线菌的影响，探索采用木糖醇防治龋病的新途径。

　　1材料和方法

　　1.1实验菌株、仪器及培养基制备

　　1.1.1实验菌株黏性放线菌ATCC15987由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。

　　1.1.2实验仪器厌氧培养箱（浙江义乌冷冻机总厂），METTLERTOLEDOFE20型pH计（MettlerToledo公司，瑞士），电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），TDL-40B型低频离心机（上海安亭科学仪器厂），BHC-1300ⅡA/B3型生物洁净安全柜（苏州净化设备有限公司），AUTOCLAVEMLS-3780型高压灭菌机（Sanyo公司，日本），SP-ECTRONIC200分光光度仪（ThermoScientific公司，美国）。

　　1.1.3木糖醇-BHI液体培养基配制在脑心浸液（brainheartinfusion，BHI）液体培养基中分别加入木糖醇粉末，调整其质量浓度为128g?

L-1，用NaOH溶液和HCl溶液调节pH值至7.40。

配置200mL上述木糖醇-

　　BHI液体培养基，另配置200mL纯BHI液体培养基，调节pH值至7.40，立即置于121℃、133MPa条件下消毒2h，备用。

　　1.2实验方法

　　1.2.1实验菌株的复苏以及培养黏性放线菌ATCC15987冻干菌株复苏48h后，采用平板划线法将其接种于BHI琼脂培养基中，37℃厌氧条件（80%N2、10%H2、10%CO2）下培养48h，挑取单菌落经形态学及生化鉴定为纯培养物后，将菌落接种于BHI液体培养基中，厌氧培养48h，将菌液在4℃下以

　　4000r?

min-1离心5min，PBS（pH=7.40）缓冲液洗菌2次，用比浊仪在BHI液体培养基中调整菌悬液密度至0.5McFarland（1×108CFU?

mL-1），备用。

　　1.2.2最小抑菌质量浓度（minimalinhibitoryconcen-tration，MIC）的测量本实验共分为7组，6个实验组和1个对照组。

实验组：

含不同质量浓度木糖醇的BHI培养基+菌悬液，对照组：

BHI液体培养基+菌悬液。

　　用无菌BHI液体培养基按对倍稀释法将已配制好的木糖醇-BHI培养基稀释为128、64、32、16、8、4g?

L-1共6个质量浓度梯度，外加纯BHI液体培养基，过滤除菌后各取100µL加入96孔板中。

每个孔取100µL菌悬液加入96孔板置于微型振荡器上振荡混匀1min，37℃厌氧培养48h，使用HTS7000Plus多孔板高效分析仪测量550nm波长下的吸光度，测定黏性放线菌的生长情况。

上述实验重复3次，每次均设3组平行实验组。

与对照组相比，能抑制90%细菌生长的最低实验药物质量浓度即为MIC。

　　1.2.3木糖醇对黏性放线菌产酸能力的影响取菌悬液与通过二倍稀释法得到的不同梯度浓度的木糖醇-

　　BHI培养基各1mL，接种于无菌15mL离心管内，使管中木糖醇质量浓度分别达到1/2、1/4、1/8MIC和MIC，且细菌终密度均为5×107CFU?

mL-1。

调整各组初始pH值至7.40，37℃厌氧培养48h，分别于1.5、3、6、12、24、48h在无菌环境下测量培养物上清液pH值，并计算pH变化值∆pH，∆pH=初始pH-终末pH，其初始pH值为7.40。

上述实验重复3次，每次均设3组平行实验组。

　　1.2.4木糖醇对黏性放线菌生长的影响取通过二倍稀释法得到的不同浓度梯度的木糖醇-BHI培养基各3mL，加入玻璃试管内，使管中木糖醇质量浓度分别达到1/2、1/4、1/8MIC和MIC。

用无菌BHI液体培养基调整菌悬液密度至1×106CFU?

mL-1，并于每个玻璃管中添加300µL，于振荡器上混匀，并调整pH值至7.40，37℃厌氧培养12h。

于2、4、6、8、10、12h用SPECTRONIC200分光光度仪测量每个试管550nm下的光密度（opticaldensity，OD）值，记录数据。

上述实验重复3次，每次均设3组平行实验组。

　　1.2.5木糖醇对黏性放线菌黏附能力的影响取通过二倍稀释法得到的不同梯度质量浓度的木糖醇-BHI培养基各200µL加入96孔板中，使孔中木糖醇质量浓度分别达到128、64、32、16、8g?

L-1。

调整菌悬液密度至5×105CFU?

mL-1，每个孔加入20µL菌悬液并置于微型振荡器上振荡混匀1min，37℃厌氧培养48h，结晶紫生物膜染色后于HTS7000Plus多孔板高效分析仪测量595nm波长下的吸光度，测得最低抑制生物膜形成质量浓度（minimumbiofilminhibitionconcentration，MBIC）。

将MBIC定义为：

与对照组相比，能抑制50%（MBIC50）或90%（MBIC90）黏性放线菌生物膜形成的最低药物质量浓度。

　　1.2.6数据分析使用SPSS19.0统计软件，采用单因素方差分析进行分析，若差异有统计学意义，采用单因素方差分析Dunnett检验进一步比较各实验组间及实验组与对照组间的差异，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1MIC测量结果

　　木糖醇能抑制黏性放线菌生长，MIC为64g?

L-1。

　　2.2木糖醇对黏性放线菌产酸能力的影响

　　不同质量浓度木糖醇培养基在不同培养时间的∆pH值见表1。

前3h对照组及各实验组ΔpH值的差异无统计学意义（P>0.05）。

培养6h时，对照组与1/8MIC的ΔpH值的差异无统计学意义，但对照组与剩余各实验组的差异均有统计学意义（P<0.05）。

培养12h，各组间∆pH值的差异都有统计学意义（P<

　　0.01），且随木糖醇质量浓度升高ΔpH值降低，说明1/2、1/4、1/8MIC以及MIC质量浓度的木糖醇培养基均在短时间内可抑制黏性放线菌产酸，且质量浓度越高对黏性放线菌产酸的抑制作用越明显。

培养48h，对照组、1/8MIC、1/4MIC的ΔpH值的差异无统计学意义（P>0.05），但相较1/2MIC、MIC的ΔpH值的差异有统计学意义（P<0.01），提示1/2MIC及MIC质量浓度的木糖醇培养基可较长久地抑制黏性放线菌产酸。

　　2.3木糖醇对黏性放线菌生长的影响

　　不同质量浓度木糖醇培养基在不同培养时间的OD550测量值见表2。

前6h内各组OD550的差异无统计学意义（P>0.05），此为细菌生长的迟缓期，OD550测量值并无明显变化。

6~12h，对照组与各实验组OD550的差异均有统计学意义（P0.05），说明黏性放线菌的生长在1/2MIC及MIC木糖醇培养基中将受到较长久的抑制。

　　2.4木糖醇对黏性放线菌黏附能力的影响

　　木糖醇能够抑制黏性放线菌生物膜的形成，其MIBC50为64g?

L-1，MIBC90为128g?

L-1。

　　3讨论

　　现代口腔生态学观点认为：

黏性放线菌等致龋相关菌通常为口腔内常驻菌，龋病的发生是口腔微生态系统失衡的结果[6]。

正常条件下，通过唾液分泌等口腔内各类缓冲作用，口腔pH值可维持在5.6~7.6的中性范围内[7]。

当口腔内致龋菌于菌斑中代谢碳水化合物产酸，降低菌斑pH值至5.5以下时，釉质的脱矿和再矿化平衡就会被打破，牙体硬组织脱矿，龋损形成。

黏性放线菌的致病性主要表现在对牙面的黏附，以及产酸和耐酸，而且近年来有学者[8]指出其在厌氧环境下的产酸能力被低估了。

　　本研究选用木糖醇进行抑菌效果检测。

目前国内外的研究普遍认为，木糖醇能有效防龋，主要原因有如下两点。

第一，阻止菌斑细菌代谢产酸。

由于木糖醇不能被菌斑细菌所分解代谢，口腔内的微生物无法利用其产酸，因此菌斑的产酸量下降，有助于脱矿釉质再矿化，降低龋的发生。

第二，促进再矿化形成。

咀嚼无糖口香糖可刺激唾液分泌，增加唾液中各类缓冲体系的缓冲效果，使缓冲能力增强[9]，pH值升高，有利于牙齿硬组织的再矿化。

　　本研究结果显示，当木糖醇质量浓度高于64g?

L-1时，木糖醇对黏性放线菌的抑制效果明显，黏性放线菌基本不在这种环境中生长。

当木糖醇质量浓度低于64g?

L-1时，对黏性放线菌的生长及产酸仍有一定程度的抑制作用，但随质量浓度的下降，木糖醇对黏性放线菌的抑制效果逐渐减弱。

这些结果提示，木糖醇能有效地抑制黏性放线菌的生长、黏附以及产酸，有一定的抑制致龋菌的效果。

　　[参考文献]

　　[1]AlanenP,IsokangasP,GutmannK.Xylitolcandiesincariesprevention:

resultsofafieldstudyinEstonianchildren[J].CommunityDentOralEpidemiol,2000,28（3）:

218-224.

　　[2]HayesC.Theeffectofnon-cariogenicsweetenersonthepreventionofdentalcaries:

areviewoftheevidence[J].JDentEduc,2001,65（10）:

1106-1109.

　　[3]BadetC,FurigaA,ThébaudN.Effectofxylitolonaninvitromodeloforalbiofilm[J].OralHealthPrevDent,2008,6（4）:

337-341.

　　[4]SchüpbachP,OsterwalderV,GuggenheimB.Humanrootcaries:

microbiotaofalimitednumberofrootcarieslesions

　　[J].CariesRes,1996,30

（1）:

52-64.

　　[5]李鸣宇,刘正,马瑞,等.根面龋细菌学初步分析[J].临床口腔医学杂志,2004,20（4）:

226-227.

　　[6]tenCateJM.Biofilms,anewapproachtothemicrobiologyofdentalplaque[J].Odontology,2006,94

（1）:

1-9.

　　[7]RuhlS.Thescientificexplorationofsalivainthepost-pro-teomicera:

fromdatabasebacktobasicfunction[J].ExpertRevProteomics,2012,9

（1）:

85-96.

　　[8]赵丽娟.粘性放线菌与龋病关系的研究现状[J].国外医学口腔医学分册,1995,22（3）:

171-174.

　　[9]EdgarWM.Sugarsubstitutes,chewinggumanddentalcaries―areview[J].BrDentJ,1998,184

（1）:

29-32.

　　（本文编辑吴爱华）

　　[收稿日期]2013-11-15；[修回日期]2014-03-10

　　[基金项目] 四川大学口腔疾病研究国家重点实验室大学生训练计划基金资助项目（2012年）

　　[作者简介]郭厚佐，学士，E-mail：

sdolight@

　　[通讯作者]邹玲，副教授，博士，E-mail：

wszouling@

　　龋病防治新观念――龋病防治专家会议纪要2014年1月，由全球零蛀牙联盟（AllianceforCavity-FreeFuture，ACFF）中国行动组和高露洁中国专家顾问委员会共同举办2014年高露洁“龋病防治新技术”主题研讨会。

会议邀请全国口腔医学界来自牙体牙髓病科、正畸科、修复科、儿童牙科、预防科等24位不同领域的专家，对龋病防治技术进行了深入的沟通和探讨。

继2013年高露洁专家顾问委员会提出“龋病全科管理”的理念后，专家组在今年的会议上继续探讨可行的防龋技术手段与龋病临床/群体防治工作的有效结合方式。

会议期间，专家组总结了龋病在全球范围内的高发情况以及其对人类生活质量的影响，明确了防龋的重要性。

　与会专家对于龋病的预防基本技术达成共识，即含氟技术/产品是目前研究最广泛、应用最成熟、安全性最可靠、有效性最明显的龋病防治技术；在积极推进人们常规/规范使用含氟口腔护理产品（如含氟牙膏等）的同时，也提出定期接受含氟涂料防龋治疗是重要的龋病干预手段。

目前，局部用氟措施在全球都得到了广泛的应用，2009年中国卫生部办公厅关于印发《口腔预防适宜技术操作规范》的通知[卫办疾控发（2009）15号]中，也明确指出局部涂氟是提供高质量的口腔卫生服务、保护人民群众口腔健康的有效途径。

　另外，专家组也提出了要更大范围拓展龋病预防的理念，由于局部用氟技术具有操作简便及技术敏感性低等特点，因此具有在大的社区群体中拓展防龋治疗的操作技术基础。

龋病预防应不止于口腔诊室，更可以走进社区，从而减少龋病发生，进一步提高口腔健康水平，实现口腔初级卫生保健的目标。

　专家组针对中国的局部用氟策略建议，对于6岁以下学龄前儿童中的乳牙龋中度风险和龋高度风险人群，每年应分别使用2次（中度）或3~4次（高度）氟涂料；对于6~18岁学龄期儿童、青少年中的龋中度风险和龋高度风险人群，建议进行窝沟封闭治疗，并每年进行2次（中度）或3~4次（高度）局部用氟治疗。

　与会期间高露洁公司也分享了2013年高露洁公司与各大卫生、口腔等医疗机构的合作，以及在临床、社区使用局部用氟技术全面防龋的项目内容。

如在大连、北京、青岛、上海等城市由当地卫生局牵头并在教育局、财政局的支持下，开展了全市口腔疾病基本预防防龋项目，每年实施1次口腔健康检查，每半年实施1次局部用氟。

据不完全统计，2013年牙科医疗人员使用多乐氟防龋技术为超过60万的人群进行了龋病预防工作。

多乐氟是目前国际上使用广泛的含氟涂料产品，2岁以上儿童及成年人均可使用，已有几十年的临床应用历史，使用方法简单，可有效降低龋病的发生。

　高露洁棕榄（中国）有限公司