大鼠放创复合伤伤口愈合过程病理形态学观察.docx
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大鼠放创复合伤伤口愈合过程病理形态学观察
第一部分放创复合伤大鼠神经免疫调节的变化
已知单纯创伤及辐射均能导致机体的免疫功能出现不同程度的改变,且创伤和辐射应激也均能引起机体HPA兴奋,故放创复合伤机体的神经免疫调节必受创伤和辐射这两因素的双重影响。
然而,神经免疫调节在放创复合伤中存在着怎样的变化,这些变化与伤口愈合有着怎样的关系,目前却鲜见报道。
本部分实验采用创伤合并全身5Gy单次均匀照射和创伤合并局部25Gy单次照射这两种放创复合伤大鼠模型同时进行研究。
系统地观察了放创复合伤大鼠外周血血象,外周血CD4+淋巴细胞比例、CD8+淋巴细胞比例以及CD4+/CD8+比值,脾脏Treg细胞和Th17细胞比例及Treg/Th17平衡等指标的变化,并检测了神经激素ACTH和GC及细胞因子IL-4和IFN-γ等在外周血中的表达。
通过对这些变化的分析,探索放创复合伤大鼠神经免疫调节的变化规律及其与伤口愈合的关系。
第一章大鼠放创复合伤伤口愈合过程病理形态学观察
放创复合伤具有伤口愈合延迟特点。
病理形态学观察发现放创复合伤伤口愈合早期,炎症反应明显受到抑制,创面渗出物减少,广泛出血,坏死组织增多;愈合中期肉芽组织生长成熟减慢,伤口收缩受到抑制;愈合后期上皮覆盖滞后,胶原含量较低。
本实验通过观测伤口残留面积、各时相伤口区皮肤的病理形态学和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的变化以及伤口区皮肤羟脯氨酸含量,来评价大鼠放创复合伤模型的建立。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1主要仪器
设备名称
型号及公司
国别
图像分析仪
Quantimet970,Cambridge公司
英国
全自动脱水机
ASP200,Lecia公司
德国
石蜡包埋机
EG1150,Lecia公司
德国
全自动石蜡切片机
RM2255,Lecia公司
德国
分析天平
AL104,METTLERTOLEDO公司
瑞士
水浴锅
XMTD,余姚市东方电工仪器厂
中国
离心机
LD4-ZA,北京医用离心机厂
中国
紫外分光光度计
Cary50,Varian公司
美国
生物显微镜
BX41,OLYMPUS公司
日本
1.1.2主要试剂
试剂名称
公司
国别
伊红染料
国药集团化学试剂有限公司
中国
苏木素染料
Sigma公司
美国
天狼猩红染料
北京诺博莱德科技有限公司
中国
苦味酸
天津希恩思科技有限公司
中国
羟脯氨酸试剂盒
南京建成生物工程研究所
中国
1.1.3常用试剂配制
1.10%缓冲福尔马林
将1×PBS与福尔马林按9比1的比例混匀。
2.10×PBS(PH7.2-7.6)
称取NaCl80g、KCl2g、Na2HPO415.4g、KH2PO41.9g于2L烧杯中,加入950ml去离子水在磁力搅拌器上充分搅拌溶解,调整pH至7.2-7.6,去离子水定容至1L。
工作液:
1×PBS
1.1.4实验动物及分组
Wistar雌性大鼠86只,体重200±20g,购自于军事医学科学院实验动物中心,并饲养于该中心二级动物房。
按辐照将实验动物分为正常组对照组(正常组,Normal)、单纯创伤组(单伤组,SW)、创伤+5Gy全身照射组(全身照射组,WTR)和创伤+25Gy局部照射组(局部照射组,WLR)。
按取材时间点将各组又分为3d、7d、14d和28d组,每组5只。
正常组6只,其他三组每组各20只。
1.2方法
1.2.1动物伤口模型制作
大鼠经1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,背部剃毛消毒备皮,沿脊柱胸段两侧各制作一个直径为1.5cm的圆形全层皮肤缺损伤口,深达皮下组织全层,两个伤口间隔1.5cm。
(图1)
图1.1大鼠皮肤伤口制作流程
1.2.2照射条件与方法
全身照射组大鼠置于特制有机玻璃盒内,局部照射组绑于特制的木板上,采用本所60Co射线源对全身照射组大鼠全身一次性均匀照射,照射剂量为5Gy;对局部照射组大鼠创伤局部一次性照射,照射剂量为25Gy;动物距源3.0m。
正常组和单伤组行假照射。
伤照后各组均采用单笼饲养。
(图1.2)
图1.2A.5Gy射线全身照射
图1.2B.25Gy射线伤口局部照射
1.2.3伤口残留面积百分率
伤照后即刻用塑料薄膜附于28d组大鼠背部描下伤口面积,记为原面积。
于伤照后1、3、7、14、、21和28d描记28d组大鼠背部伤口残留面积,记为伤口残留面积。
将描记的图像扫描输入Quantimet970型自动图像分析仪进行面积分析,计算伤口残留面积百分比。
伤口残留面积百分比=伤口残留面积/原面积×100%
1.2.4取材
辐照后持续观察大鼠大体状况,各实验组分别于伤照后3、7、14和28d活取材。
活杀前照相,称重;取脾脏和胸腺并称重,用于脏器指数分析;取尾静脉血20l用作外周血血细胞计数;取腹主动脉血200l用作外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞检测;用采血管取腹主动脉血用于血清各种细胞因子检测;取伤口区背部皮肤,一个置于10%缓冲福尔马林溶液中固定后制作石蜡切片,用于常规HE染色和病理学观察,另一个放于液氮中保存用于羟脯氨酸含量测定;取大脑,一半用10%缓冲福尔马林溶液固定后制作石蜡切片,用于免疫组织化学染色,一半冻存于液氮中。
1.2.5组织切片
1.组织修整:
组织置于石蜡板上,用锋利刀片修整。
沿观察面下刀,双裁面平行。
可沿脑底下丘脑前后沿纵切,厚约5mm。
2.水洗:
各组织按照分组装在包埋框中并用铅笔标识编号,以流水冲洗24h。
3.脱水:
70%乙醇20min→80%乙醇20min→90%乙醇Ⅰ20min→90%乙醇Ⅱ20min→95%乙醇Ⅰ20min→95%乙醇Ⅱ20min→100%乙醇Ⅰ60min→100%乙醇Ⅱ60min
4.透明、浸蜡:
二甲苯Ⅰ60min→二甲苯Ⅱ60min→石蜡Ⅰ(62℃)60min→石蜡Ⅱ(62℃)60min→石蜡Ⅲ(62℃)60min
5.包埋:
包埋框在62℃石蜡溶液中浸泡15min,夹出组织立于金属盒中部(切面贴底),点蜡后于冰台冷却凝固,取出石蜡块并修整四周。
6.载玻片清洗:
将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合洗液中浸泡过夜后流水充分清洗干净,晾干后将载玻片浸泡于95%酒精中,用时取出晾干,多聚赖氨酸涂布于玻片表面。
7.石蜡切片:
固定蜡块底座,刀刃与蜡块表面呈5度角。
调整切片厚度为4µm。
8.展片和捞片:
恒温水浴箱水温保持在42~45℃,用眼科镊子夹起切片的一角,轻铺于水面,展平后捞片。
室温下稍微干燥后,放在65℃恒温烤箱中,
12~24h,烤干备用。
1.2.6HE染色
1.脱蜡:
载玻片依次放入二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,每个试剂中放10min。
用自来水洗2遍,蒸馏水洗2遍。
2.苏木素染液中染色5~10min,自来水洗去多余染液。
3.将切片在盐酸乙醇缸内快速浸泡一下,立即入自来水中返蓝,换新鲜自来水继续返蓝10min。
4.伊红染液染色3~5min,自来水洗去多余染液。
5.脱水透明:
依次在80%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、无水乙醇、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中放置5s。
6.中性树胶封片,镜下观察。
1.2.7天狼猩红染色
1.脱蜡至水
2.二甲苯Ⅰ(10min)—二甲苯Ⅱ(10min)—100%酒精(5min)—95%酒精(5min)—90%酒精(5min)—80%酒精(5min)—70%酒精(5min)—自来水冲洗(2min)。
3.蒸馏水洗3次。
4.滴加0.1%苦味酸天狼猩红染液,避光染色3h。
5.蒸馏水冲洗至染液洗净。
6.无水乙醇脱水(10min)。
7.二甲苯脱水透明,中性树胶封片。
8.偏振光显微镜下观察Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维。
1.2.8伤口区皮肤羟脯氨酸含量测定
1.样本水解:
精确称取组织40mg,放入10ml玻璃试管中,准确加入水解液1ml,混匀。
加盖后沸水浴水解20min(水解10min时混匀一次,使水解更充分)。
2.调PH值至6.0-6.8左右:
(1)将各试管流水冷却后,加指示剂1滴,摇匀;
(2)各试管准确加入调PH甲液1ml,混匀(此时溶液应为红色);
(3)用200μl的加样器吸取调PH值乙液,向各管内逐滴小心加入调PH乙液,每滴加入后均要混匀,直至液体中指示剂的颜色变成黄绿色。
此时PH值在6.0-6.8左右(约加入乙液100-500μl;
(4)加蒸馏水至10ml,混匀;
(5)取3-4ml稀释的水解液加适量活性炭(约20-30mg,以上清夜离心后澄清无色为准),混匀,3500rpm离心10min,小心取上清1ml做检测。
3.样本测试
空白管
标准管
测定管
蒸馏水(ml)
1
5μg/ml标准应用液(ml)
1
检测液(ml)
1
试剂一(ml)
0.5
0.5
0.5
混匀,静置10min
试剂二(ml)
0.5
0.5
0.5
混匀,静置5min
试剂三(ml)
0.5
0.5
0.5
混匀,60℃水浴15min,冷却后,3500rpm离心10min,取上清在550nm处,1cm光径,蒸馏水调零,测各管吸光度。
4.计算公式:
羟脯氨酸含量(µg/mg湿重)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准管含量×(水解液总体积(10ml)/组织湿重(mg))
1.2.9统计学处理
本实验采用SPSS17.0软件进行分析,计量资料以
±s表示。
首先用LeveneTest进行方差齐性检验(Homogeneityofvariance)。
当方差具有齐性时(Equalvarianceassumed),选择LSD(Leastsignificantdifference)法进行各组均数的多重比较;当方差不齐时(Equalvariancenotassumed),选择Dunnett’T3法进行各组均数的多重比较。
P<0.05为差异具有统计学意义,P<0.01为差异显著。
2结果
2.1伤口残留面积的变化
从表1中可以看出,伤照后1d和3d全身照射组和局部照射组伤口残留面积较单伤组无明显变化,伤照后3d局部照射组伤口残留面积略大于全身照射组(P<0.05);伤照后7d和14d时全身照射组和局部照射组伤口残留面积则显著大于单伤组(P<0.01),且局部照射组也显著大于全身照射组;伤照后21d单伤组伤口已基本完全愈合,局部照射组伤口残留面积仍显著大于全身照射组;伤照后28d全身照射组伤口基本愈合,而局部照射组未完全愈合。
表1.伤照后不同时间大鼠伤口残留面积百分率(
±s,n=5)
Time(d)
SW(%)
WTR(%)
WLR(%)
1
86.48±5.75
86.24±5.80
86.27±7.93
3
74.87±6.27
74.77±4.14
84.67±8.22b1
7
26.54±4.42
39.76±2.95a2
71.54±5.71a2b2
14
1.99±0.37
3.46±0.77a2
46.15±7.30a2b2
21
0
2.45±0.43
4.21±0.82a2b2
28
0
0
2.94±0.53
与单伤组比较,a1P<0.05,a2P<0.01;与全身照射组相比,b1P<0.05,b2P<0.01。
2.2伤口区皮肤病理学观察
伤照后3d,单伤组创面渗出明显,单伤组成纤维细胞出现增生,可见新生血管,其余两组未见明显成纤维细胞增生。
伤照后7d,单伤组创面下肉芽组织丰富,新生血管较其他两组明显增多;而全身照射组和局部照射组仍有明显渗出物,且出血明显。
伤照后14d,单伤组表皮细胞已基本覆盖创面并有角质层形成,创面下肉芽组织和新生血管较全身照射组和局部照射组显著减少;全身照射组和局部照射组表皮肥厚,且仍有明显出血。
伤照后21d,单伤组创面已基本愈合,肉芽组织已为增生的胶原纤维所代替,皮肤附件开始出现;而全身照射组和局部照射组表皮仍未完全覆盖创面,两组均未见皮肤附件出现。
伤照后28d,单伤组表皮开始变薄,皮肤附件增多;而全身照射组和局部照射组表皮仍明显增厚,皮肤附件较少或未见出现。
a.单伤组b.全身照射组c.局部照射组
图1.2伤照后3d伤口区病理学改变(H.E.200)
a.单伤组b.全身照射组c.局部照射组
图1.3伤照后7d伤口区病理学改变(H.E.200)
a.单伤组b.全身照射组c.局部照射组
图1.4伤照后14d伤口区病理学改变(H.E.200)
a.单伤组b.全身照射组c.局部照射组
图1.5伤照后21d伤口区病理学改变(H.E.200)
a.单伤组b.全身照射组c.局部照射组
图11伤照后28d伤口区病理学改变(H.E.200)
2.3Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维形态学观察
天狼猩红染色,Ⅰ型胶原纤维呈强双折射为红色或黄色粗纤维,Ⅲ型胶原纤维呈若折射的绿色纤维。
伤照后3d,单伤组、全身照射组和局部照射组的纤维排列均非常紊乱,且颜色均比正常组浅,其颜色强弱顺序为单伤组>全身照射组>局部照射组。
伤照后7d,单伤组胶原纤维排列整齐,其颜色明显比正常组浅;全身照射组纤维排列略微整齐,但密集程度和颜色鲜艳程度明显低于正常组和单伤组;局部照射纤维排列仍旧紊乱,其颜色明显没有其他三组鲜艳。
伤照后14d,单伤组、全身照射组和局部照射组纤维排列均整齐,其中单伤组的纤维变粗,三组颜色明亮程度均显著低于正常组,颜色强弱顺序和纤维密集程度均为单伤组>全身照射组>局部照射组。
伤照后28d,单伤组和全身照射组纤维颜色和粗细均较正常组差别不明显,且两组间也无显著性差别,而局部照射组纤维的粗细程度则明显低于其他三组。
A正常组;B单伤组;C全身照射组;D局部照射组
图1.6伤照后3天伤口胶原纤维的表达(天狼猩红染色,×200)
A正常组;B单伤组;C全身照射组;D局部照射组
图1.7伤照后7天伤口胶原蛋白的表达(天狼猩红染色,×200)
A正常组;B单伤组;C全身照射组;D局部照射组
图1.8伤照后14天伤口胶原蛋白的表达(天狼猩红染色,×200)
A正常组;B单伤组;C全身照射组;D局部照射组
图1.9伤照后28天伤口胶原蛋白的表达(天狼猩红染色,×200)
2.4羟脯氨酸检测结果
伤照后3d、7d和14d,各组伤口区皮肤羟脯氨酸含量显著低于正常组;伤照后3d和7d全身照射组和局部照射组均明显低于单伤组,且局部照射组也明显低于全身照射组;伤照后14d和28d,全身照射组较单伤组已无显著差别,而局部照射组羟脯氨酸含量仍明显低于其单伤组和全身照射组。
图1.10伤照后不同时间大鼠伤口区组织羟脯氨酸含量变化
与正常组比较,a1P<0.05,a2P<0.01;与单伤组比较a1P<0.05,a2P<0.01。
3讨论
3.1伤口愈合速度
伤口残留面积百分比与伤口愈合速度成反比,伤口残留面积百分比越大,表明伤口愈合速度越慢。
伤照后1d和3d全身照射组和局部照射组伤口残留面积较单伤组无明显变化,而伤照后7d和14d时全身照射组和局部照射组伤口残留面积则显著大于单伤组(P<0.01),说明电离辐射在创伤愈合早期(伤后前三天),对伤口的愈合速度影响不大,而在创伤愈合的中后期则显著减缓了伤口愈合速度。
伤照后7、14和21d,局部照射组的伤口残留面积明显大于全身照射组,说明创面局部辐射比全身辐射对伤口愈合速度的影响要大,使伤口愈合更为显著地延迟。
单伤组和全身照射组伤口基本愈合的时间分别为21d和28d,而照后28d,局部照射组的伤口仍为完全愈合,提示全身照射组和局部照射组较单伤组伤口愈合显著延迟,全身照射组延迟月一周左右,而局部照射组则延迟的更久一点。
3.2伤口愈合过程的病理学变化
3.3伤口愈合质量
胶原的沉积是衡量创面愈合质量优劣的重要指标。
天狼猩红染色结果表明,伤照后3~28d,在同一时相全身照射组和局部照射组Ⅰ、Ⅲ型胶原的形成始终低于单伤组,且局部照射组也始终低于全身照射组。
另外,胶原纤维的主要成分羟脯氨酸含量的检测结果显示,伤照后3~14d各组羟脯氨酸含量由高到低的顺序为:
单伤组>全身照射组>局部照射组。
这一结果与天狼猩红染色结果相一致,说明辐射损伤能导致创面的愈合质量下降,且创面局部大剂量照射的这种影响要比全身中剂量照射明显。
4结论
4.1放创复合伤伤口愈合显著延迟。
4.2放创复合伤伤口愈合创面具有炎症反应削弱,炎性细胞渗出减少及成纤维细胞和上皮细胞增殖减少,肉芽组织生机不良以及重上皮化减慢等特点。
4.3放创复合伤伤口的愈合质量明显降低。
4.4成功地建立了放创复合伤动物模型。
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