基因工程总结.docx
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基因工程总结
基因工程
第一章 绪论
基因工程的诞生
Boyer-Cohen实验,1973年斯坦福大学的S.Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒,具有双重抗药性。
第一次成功的实现了基因克隆实验。
基因工程:
是在体外将核酸分子插入病毒、质粒、或其它载体分子,构成遗传物质的新组合,并使之参入到原先
没有这类分子的寄主细胞内,而能持续的繁殖。
遗传工程:
指以改变生物有机体性状特征为目标的遗传信息量的操作。
它包括常规的选择育种、基因工程等不同的技术层次,它的范围广泛。
基因工程诞生的基础:
理论基础:
1、遗传物质基础问题:
基因的分子载体是DNA而不是蛋白质
1944年Avery等人在肺炎链球菌转化实验:
发现遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质;
1952年AlfredHershy和MarshaChase进一步证明遗传物质是DNA。
2、基因的自我复制和传递问题:
DNA分子的双螺旋结构模型;半保留复制机制
1953年Watson和Crick在FranKlin和Wilkins的X射线工作的基础上提出了DNA分子结
构的双螺旋模型;1958年Meselson和Stahl提出了DNA半保留复制模型
3、遗传信息的流向和表达问题:
中心法则、操纵子学说、遗传密码的破译
1960年Ochoa发现中心法则
1961年Nirenberg破译了遗传密码;
1961年Jacob和Monod提出了调节基因的操作子模型
技术基础:
限制性内切酶和连接酶的发现、载体的发现、转化体系的成熟、核酸分离技术
基因工程诞生的标志:
1973年斯坦福大学的Cohen和Boyer将R6-5质粒DNA(抗kan)与E.coli的pSC101质粒(抗tet)混合,EcoRI酶切,用T4连接酶连接形成重组DNA子之后,转化得到了拥有抗tet和kan双重抗性的重组子。
第一次成功地实现了细菌基因的克隆
基因工程的特征:
跨越天然物种屏障外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖
无性扩增外源DNA在寄主细胞内可大量扩增和高水平表达。
基因工程研究的主要内容:
基因克隆是核心
目的基因的制备
载体的选择和构建
目的基因与载体连接
重组子导入受体细胞
重组子的筛选与鉴定
基因克隆:
目的基因的制备
克隆载体的制备
目的基因与克隆载体连接形成重组DNA
重组DNA转入寄主细胞繁殖扩增
筛选鉴定含有重组DNA的受体细胞
基因表达:
表达载体的制备
外源基因在寄主细胞中表达
基因工程geneticengineering对不同生物的遗传物质——基因,在体外进行剪切、组合和拼接,使遗传物质重新组合,然后通过载体(质粒、噬菌体或病毒等)转入微生物、植物或动物细胞内,进行无性繁殖,并使所需要的基因在细胞中表达,产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。
细胞工程cellengineering:
包括细胞融合、细胞大规模培养以及植物组织培养快速繁殖技术。
酶工程enzymeengineering:
包括酶的生产应用、酶和细胞的固定化以及酶的分子修饰技术。
微生物发酵工程zymolysisengineering:
包括菌种选育、菌体生产利用、代谢产物的生产利用以及微生物机能的利用技术。
生化工程biochemistryengineering:
包括生物反应器设计制造、传感器的研制以及产物的分离提取和精制技术。
第二章基因操作的原理
Section1GelElectrophoresisofNulceicAcid
掌握:
凝胶电泳的基本原理、类型及其分离范围;
理解:
不同的凝胶电泳在分析核酸中的作用了解:
脉冲电场凝胶电泳的基本原理和应用
核酸凝胶电泳的主要原理:
⊙由于糖–磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,它们以同样的速
度向正电极的方向迁移。
⊙在一定的电场强度下,DNA分子的电泳迁移率,取决于核酸分子本身的大小和构型。
分子量较小的DNA分子,比分子量较大的DNA分子,具有较紧密的构型,所以其电泳迁移率也就比
⊙同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
⊙分子量小比分子量大的快。
如DNA:
500bp快于1000bp
类型:
按照电泳的凝胶介质划分:
琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯凝胶电泳
分离超大分子量DNA的凝胶电泳:
脉冲电场凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖:
一种线性多糖聚合物(红色海藻),当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为:
0.2kb-50kb之间.
电泳缓冲液
弱酸弱碱:
维持pH条件及离子组成
核酸电泳缓冲液有三种,即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).
Tris(T)、Acetic(A)、boric(B)、EDTA(E)
TBE与TPE缓冲容量高,DNA分离效果好,但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高,容易使DNA沉淀.
TAE缓冲容量低,但价格较便宜,因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子,从而抑制DNA酶
的活性,防止PCR扩增产物降解.
电泳显色
染色剂:
最常用的是溴化乙锭染色法
溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)在紫外线激发下,发出桔红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓
度为0.5ug/ml的EB,有时亦可在电泳后,将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10—15min.
琼脂糖凝胶EB染色,肉眼可见核酸电泳带,其DNA量一般>5ng,当溴化乙锭太多,凝胶染色过深,核酸电泳带看不清时,可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察.(danger!
)
影响DNA迁移率的因素
①电压:
电压与线状DNA迁移率几乎成正比
小于2Kb的DNA电压一般设定为5V/cm;大于2kbDNA,一般电场电压小于5V/cm。
此外高电压将带来高热,导致溶胶。
②温度:
4℃—30℃DNA迁移率几乎相同,但对低溶点胶或浓度小于0.5%胶,因为脆弱,最好在4℃以下电泳。
③胶浓度:
浓度越高,迁移越慢,
④DNA上样量:
浓度越高,泳动越快。
⑤电泳缓冲液及胶的离子强度组成:
离子强度愈高,导电愈高,达到一定程度将产热并溶解凝胶。
聚丙烯凝胶电泳
优点:
分辨率高:
长度仅差1个bp碱基也可以分辨出;
可以回收高纯度的DNA;
进行PCR-SSCP(Single-StrandConformationPolymorphism,SSCP)分析。
电泳缓冲液:
Tris-硼酸(TBE)
电泳显色:
①溴化乙锭染色:
聚丙烯酰胺会熄灭溴化乙锭荧光,因此不能检出10ng以下DNA带。
同琼脂糖。
②银染:
银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物,然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒,可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后,DNA回收复杂.
脉冲电场凝胶电泳(PFGE)
应用:
脉冲电泳技术用于分离20kb至10Mb的超大分子量核酸DNA。
电场方向周期性改变
原理:
标准的PFGE中,头一个脉冲的电场方向与核酸移动方向成45夹角,而下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧亦成45夹角。
由于加压在琼脂糖凝胶上的电场方向、电流大小、及作用时间都在交替地变换着,这就使得DNA分子能够随时地调整其游动方向,以适应凝胶孔隙的无规则变化。
在脉冲电场中,DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而改变。
与分子量较小的DNA分子相比,分子量较大的DNA分子需要更多的次数来更换其构型和方位,以使其可以按新的方向游动。
因此,在琼脂糖介质中的迁移速率也就显得更慢一些,从而达到了分离超大分子量DNA分子的目的。
已报道,应用脉冲电场凝胶电泳技术,可成功地分离到分子量高达100Mb的DNA大分子
Section2.NucleicAcidBlotting
掌握:
核酸分子杂交的基本原理、SouthernBlotting,NorthernBlotting、westernBlotting的基本原理和作用
理解:
核酸杂交的基本过程。
了解:
Dot、Slot、InsituBlotting的基本原理和用途
核酸分子杂交原理:
依据的原理是带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA,当它们混合在一起时,其相
应的同源区段将会退火形成双链的结构。
核酸分子杂交的基础:
核酸分子单链之间有互补的碱基顺序,通过碱基对之间非共价键(主要是氢键)的形成
即出现稳定的双链区;分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行。
杂种核酸分子:
果彼此退火的核酸来自不同的生物有机体,那么如此形成的双链分子就叫做杂种核酸分子。
转膜:
将核酸样品转移到固体支持物滤膜上,这个过程特称为核酸印迹(nucleicacidblotting)转移;
杂交:
将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。
所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。
根据毛细管作用的原理,使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上,然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段,这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。
Southern杂交流程:
①电泳:
DNA的分离;②胶处理(变性);③转膜(固定)
④探针标记;⑤杂交;⑥显影
胶处理:
目的:
DNA的变性,以及使大的DNA分子在原位碎裂为相对小的分子,以便于转膜。
脱嘌呤处理:
需要用0.25N的HCl溶液中作短暂的,然后再进行碱变性。
碱水解:
在脱嘌呤位点水解形成DNA短片段。
DNA片段经过碱变性之后,DNA能保持单连状态。
固定:
80-120℃烘烤固定30分钟紫外灯交联数分钟
原理:
DNA分子中的小部分胸腺嘧啶残基与尼龙膜表面上带正电荷的氨基基团之间形成交联键(crosslinks),
从而使得DNA分子牢固的结合在尼龙膜上。
SouthernBlotting作用:
鉴定分析DNA的技术、绘制DNA分子的遗传图谱、分析基因的结构、位置、大小
Northernblotting
一种鉴定mRNA序列的技术。
1979年,J.C.Alwine等人发展而来,是将RNA分子从电泳凝胶转移到
叠氮化的滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上,进行核酸杂交的一种实验方法。
由于这种方法与Southernblotting
杂交技术十分类似,所以叫做Northernblotting。
Westernblotting
一种识别和定位蛋白质的技术,以蛋白质与特异抗体的结合能力为基础。
斑点和狭线印迹法(dotandslotblotting):
是将被检标本点到膜上,烘烤固定。
这种方法耗时短,可做半定量分
析,一张膜上可同时检测多个样品。
膜上呈斑点状或狭缝状,烤干或紫外线照射以固定标本,进行杂交。
原位杂交(InsituBlotting):
1975年CrunsteinandHogness根据检测重组体DNA分子核酸杂交技术的原理,对
Southern吸印技术做了一些修改,发展出了一种菌落杂交技术
1977年Eenton和Davis又发展了类似的筛选含有克隆DNA的噬菌斑的杂交技术
Section3.PCR扩增技术(PolymeraseChainReaction)
掌握:
PCR技术的发明、PCR反应的基本要素、PCR的基本原理
理解:
PCR的各种类型及其用途了解:
PCR技术在分子生物学中的应用及其它方面的应用
Section4.DNASEQUENCING
PrincipleofSangermethodPrincipleofGilbert-Maxammethod
第三章基因工程的酶学基础
Section1ResitrictionEndonuclease
限制和修饰系统中的限制作用:
即指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用,破坏入侵的噬菌体DNA,导致噬
菌体的寄主幅度受到限制
保护自身的DNA不受限制;是破坏外源DNA使之迅速降解。
TypesofRestrictionendonucleases:
TypeI,IIandIII
切割位点(cleavagesite):
大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有回文结构特征
切断的双链DNA都产生5’磷酸基和3’羟基末端。
不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同
限制性核酸内切酶作用后产生两种末端:
平末端(bluntend/flushend);粘末端(stickyend/cohesiveend)
限制性核酸内切酶识别序列长度为4~8个bp。
不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端(compatibleend),可用连接酶连接。
同裂酶(isoschizomers):
有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶位点序列,
这类酶称为同裂酶(异源同工酶)。
同尾酶(isocaudamer):
一些来源不同的限制酶,识别的是不同的核苷酸靶位点序列,但是产生相同的粘性末端。
这类酶称为同尾酶。
酶单位的定义:
指在50μlbuffer中含1μg底物DNA(通常是λ),于最适反应条件和温度下(大多数是37℃,也有25℃,SmaⅠ,或55℃BclⅠ等等)保温1小时,能使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量
即为一个酶单位(Unit)。
影响限制性内切酶反应因素
v1、DNA纯度:
原因:
DNA制备中的杂质。
解决:
①增加酶的用量;②延长酶催化反应时间;③扩大酶反应的体积
2、甲基化程度:
大肠杆菌中的甲基化酶。
dam酶:
催化GATC中A甲基化。
dcm酶:
催化CCA/TGG内部的C甲基化
3、酶切反应温度:
标准反应温度:
37℃。
例外:
SmaI25℃;ApaI30℃;TaqI65℃
4、DNA分子的结构:
质粒:
用酶量SC比L高许多倍20倍
少数酶对不同限制位点的切割活性差异很大称为位点偏爱;多数酶不能切割只含有识别序列的末端
5、限制性内切酶的缓冲液:
标准的限制酶缓冲液组分:
MgCl2、NaCl或KCl、Tris-HClpH7.4、
β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DDT)、BSA
星号活性(Staractivity):
在反应条件改变时限制性内切酶的识别序列发生特异性降低的现象。
如EcoRⅠ识别GAATTC降为AATT(由六核减为4核),DNA的切口增多了,是非特异性。
反应条件改变:
甘油浓度达10%以上,离子强度Mn,乙醇高,pH为8.5以上,过高的酶和DNA浓度等。
限制酶对DNA的消化作用
II型酶是以同型二聚体形式与靶DNA序列发生作用的;分子细节如EcoRI6个aa与Pu形成12个氢键
完全酶切:
某限制酶将靶DNA双链的所有该酶切位点都切开;部分酶切:
只有部分酶切位点被切开
单酶切法:
一次只使用一种酶切割DNA;双酶切法:
一次同时使用两种酶切割DNA
限制性内切酶应用
1、酶切图谱:
限制性图谱(restrictionmap):
描述DNA上限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱
2、基因克隆
3、限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphismRFLP):
特殊限制酶切割不同个体出现得DNA片段大小不同的差异。
导致RFLP的多态性序列在物理图谱和遗传连锁图上被用做标记。
RFLP通常是因切割位点发生突变所致。
4、基因组作图:
基因图谱(genemapping):
确定染色体上基因的相对位置和基因之间距离。
图谱(mapping):
根据推断DNA图谱的过程,能够构建三种类型的DNA图谱:
物理图谱,遗传图谱和细胞发生图谱,三者之间的关键区别是它们基本的标志不同。
Section2.聚合酶polymerase
聚合反应的特点:
(1)以单链DNA为模板
(2)以dNTP为原料
(3)引物提供3´-OH(4)聚合方向为5´→3´
E.coliDNApolymeraseⅠ
Activity:
5′→3′polymeraseactivity
3′→5′exonucleaseactivity
5′→3′exonucleaseactivity1~10nt
Use:
nicktranslationradiolabelingDNA
Klenowfragment:
5′→3′外切活性位于分子的N端,可以通过蛋白酶或缺失基因而除去。
结果剩下的聚
合酶保留了合成和3′→5′外切酶活性,它就是Klenowfragment(或全称为E.coliDNApolⅠlargefragment)
Activity:
5′→3′聚合酶活性3′→5′外切酶活性
Use:
合成cDNA的第二链
Fillinginrecessed3‘endsofDNAfragments标记3‘末端
Digestingawayprotruding3'overhangs→yieldingbluntends
T4DNApolymeraseⅠ
From:
T4phage
Activity:
similartoKlenowfragment5'→3'DNApolymerase
3'→5'exonucleasebutdoesnothave5'→3'exonuclease
Using:
particularlyinbluntingtheendsofDNAwith5'or3'overhangs
RadiolabelingDNA:
thebluntendsorrecessed3‘ends
T7DNAPolymerase
From:
T7bacteriophage
Activity:
5'→3'DNApolymerase
3‘→5’exonucleaseactivity,1000times〉klenow,dsorssDNA,butlacksa5'→3'exonucleasedomain.
fameforT7DNApolymeraseisit'sprocessivity
Using:
DNAsequencingLongPCRLabeling:
recessed3‘ends
修饰的T7DNA聚合酶无3‘→5’exonucleaseactivity,专用的测序酶
RNApolymerase
如果是RNADependentDNApolymerase→Reversetranscriptase
鸟类骨髓母细胞瘤病毒(AMV,avianmyeloblastosisvirus)
酶活性:
5′→3′聚合酶活性;RNaseH活性:
从5′or3′降解DNA-RNA杂交分子中的RNA链
用途:
制备cDNA,以单链DNAorRNA作为模板合成探针
Section3.修饰酶
碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase):
将DNA分子5′-末端的磷酸基团移去。
•Bacterialalkalinephosphatase(BAP):
isthemostactiveoftheenzymes,butalsothemostdifficulttodestroyattheendofthedephosphorylastionreaction.
•Calfintestinalalkalinephosphatase(CIP):
ispurifiedfrombovineintestine.Thisisphosphatasemostwidelyused
Inmolecularbiologylabsbecause,althoughlessactivethanBAP,itcanbeeffectivelydestroyedbyproteasedigestionorheat(75℃for10minutesinthepresenceof5mMEDTA).
•Shrimpalkalinephosphatase:
isderivedfromacold-watershrimpandispromotedforbeingreadilydestroyedby
heat(65℃for15minutes).
多核苷酸激酶(PolynucleotideKinase):
与碱性磷酸酶功能相反,即将磷酸基团加到5′自由端。
•T4polynucleotidekinase:
Catalyzesthetransferandexchangeofaphosphategroup(gpositionofrATP)
→the5'-OH(dsandssDNAorRNA,
•Polynucleotidekinase(PNK)isanenzymethatcatalyzesthetransferofaphosphatefromATPtothe5'endofeitherDNAorRNA.
•ItisaproductoftheT4bacteriophage,andcommercialpreparationsareusuallyproductsoftheclonedphagegeneexpressedinE.coli.
末端脱氧核苷酸转移酶Terminaldeoxyyaucleotidyltransferase(calfthynustissue):
在DNA分子的3′端加上
一个或多个脱氧核苷酸,即可以作用于单链也可以是双链。
不需要模板。
(可用于标记及连接)
Section4.连接酶ligase
酶活性特点:
连接dsDNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端,形成磷酸二酯键,从而把两段相邻的DNA
链连接成完整的链。
种类:
1、EcoliDNALigaseNAD+:
连接粘端;连接平端必需有PEG
2、T4phageDNALigaseATP:
连接粘端、平端;
粘端的连接:
优点:
效率高,容易,常用
缺点:
易自我环化,形成稳定的共价闭合环状分子;载体自连
平末端的连接
1、同聚物加尾法:
利用末端转移酶将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端3’-OH基团上
优点:
比平端的直接连接效率高
2、衔接物法
衔接物(linker):
指化学合成一段10-12个核苷酸组成的具有一个或数个限制性酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段
缺点:
必需适外源DNA片度内部没有这种酶切位点
3、DNA接头连接法
Adapter:
是一类人工合成的一头具有某种限制性酶切的粘性末端另一头为平端的特殊的双链寡核苷酸短片段
问题:
形成二聚体;解决:
进行末端修饰
影响DNA连接的因
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