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现代生物技术实验讲义
现代生物技术实验讲义
DNA重组技术与基因检测芯片技术
动物细胞培养及细胞活性检测技术
发酵工程及分离提取技术
华东师范大学生命科学学院
SCHOOLOFLIFESCIENCES,EASTCHINANORMALUNIVERSITY
2007年9月
引言
随着生物技术的发展,生物工程的专业技术人员的需求更为迫切,特别是生物技术已经渗透到各个行业,并已蓬勃发展。
生物技术的发展不但要有深厚的理论基础,而且要求专业技术人员具有较强的动手能力,因为该学科是一门实践性较强的科学。
在培养生物技术专业学生时要特别注意学生实验能力的培养,尤其是专业基本操作。
本专业学生的实验课程已经包括生物化学实验、微生物实验、基因工程实验、细胞工程实验和发酵工程实验等课程实验。
这些实验为培养学生的基础操作能力、提高学生的实际动手能力等奠定了良好的基础,但是这些实验都是单个的小实验,各个实验各自为一体,没有系统地相互关联,学生完成实验后没有一个完整的概念。
本实验以基因工程、细胞工程和发酵工程实验为基础,组成了生物工程中上游、中游和下游技术。
其中每一个部分放弃了原来单独小实验的结构,而改为一个独立的大实验,增加了学生的设计性和主动性。
这些实验既注重和加强了原来各自的实验内容,又注意到相互联系。
本讲义分为三个部分,第一部分“DNA重组技术与基因检测芯片技术”;第二部分“动物细胞培养及细胞活性检测技术”;第三部分“发酵工程及分离提取技术”。
这些实验采取大实验方法,使学生有一个完整的操作过程,对理解生物工程的上游、中游和下游技术有了感性认识。
第一部分DNA重组技术与基因检测芯片技术
黄静陆泉枝编
目录
前言………………………………………………………………………………………………3
1.相关基础知识……………………………………………………………………………….…..4
1.1DNA重组技术的基本原理………………...…………………………………………………4
1.2基因芯片技术的基本原理…………………………………………………………………...6
2.实验目的和要求…………………………………………………………………………….…7
2.1DNA重组技术实验目的和要求………………………………………………………….......7
2.2基因芯片技术实验目的和要求……………………………………………………………...7
3.实验材料和仪器…………………………………………………………………………….…8
3.1实验材料………………………………………………………………………………….…8
3.2主要仪器设备…………………………………………………………………………….…8
3.3实验器皿……………………………………………………………………………………...8
3.4细菌培养基…………………………………………………………………………………...8
3.5分子生物学试剂……………………………………………………………………………...8
3.6SDS-PAGE电泳试剂…………………………………………………………………………9
3.7基因芯片试剂……………………………………………………………………………….10
4.实验内容………………………………………………………………………….……………10
4.1DNA重组技术实验内容………………………………………………………….………..10
4.2基因芯片技术实验内容………………………………………………………………….....11
5.习题………………………………………………………………………………………….…12
6.参考资源…………………………………………………………………………………….…12
6.1参考书目………………………………………………………………………………………12
6.2参考产品目录………………………………………………………………………………...13
6.3参考网站……………………………………………………………………………………...13
附录一质粒DNA的提取………………………………………………………………………14
附录二琼脂糖凝胶电泳…………………………………………………………….………….15
附录三DNA的纯度、浓度的测定…………………………………………………………….17
附录四DNA的酶切和连接(体外重组)…………………………………………………….18
附录五大肠杆菌感受态细胞的制备和重组DNA分子的转化………………………………19
附录六重组转化子DNA的鉴定(篮白斑筛选法)…………………………………………21
附录七重组转化子DNA的鉴定(限制性内切酶分析法)…………………………………22
附录八DNA的体外扩增(PCR技术)………………………………………………………23
附录九SDS-PAGE电泳………………………………………………………………………25
附录十毛囊中DNA的提取……………………………………………………………………28
附录十一基因型检测芯片检测ACE基因多态性………………………………………………28
前言
二十一世纪是生物学的世纪,分子生物学作为生物学最前沿的基础学科是生物学类专业通向生物高技术的必修课程。
随着人们在分子生物学水平上的研究和学习的深入和广泛展开,除了在分子水平上了解生物学的本质特征外,在分子水平如何进行生物学操作是生物学界共同关心并十分重视的问题。
“DNA重组技术”就是利用分子生物学的一般原理阐述在分子生物学实验中所涉及的技术方法、原理和策略,是一门指导分子生物学实验操作的理论与实践相结合的课程。
随着生物科学和生物技术的日益发展,人们越来越重视对生物学研究手段的了解和掌握。
作为新世纪的生命科学学院的大学本科生有必要学习DNA重组技术的原理和方法,学会和掌握DNA重组技术。
本实验讲义就是为基因工程操作的入门者而编写的。
基因工程技术的核心内容就是DNA重组技术,即在分子水平上,用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质,在体外切割、拼接和重新组合,然后通过载体把重组的DNA分子引入受体细胞,使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达,按人们的需要生产出不同的产物或定向地创造生物的新性状,并使之稳定地遗传给后代。
根据这一定义,基因工程技术涉及到极其广泛的生物学新技术新方法,但它又有一个基本的操作程序。
因而,我们按照DNA重组技术的操作程序来安排实验,即从载体的选择→目的基因的制备→体外DNA的重组(酶切与连接)→重组DNA分子引入受体细胞→转化子的筛选→重组DNA分子的鉴定等步骤编排成一个综合性大实验。
在这个综合性实验中,每一步实验既相对独立又与下一步实验紧密相连,只有获得第一个步骤的实验结果才能开始第二个实验。
因此,实验也涵盖了所要训练的单项技术。
在实验取材方面,我们以大肠杆菌为基本资料,建立适合于大肠杆菌的DNA重组技术实验。
我们旨在通过这些实验,让同学们获得分子生物学最基本的技术训练,掌握最基本、最常用的技术,并对DNA重组技术有一个比较全面而系统的概念。
此外,生物芯片技术已被国际公认为是正在和将要给二十一世纪的生物科学、医药、农业、环保等领域带来革命性变化的新技术,作为新世纪生物技术专业的大学生,有必要接触生物芯片的一些基本知识。
鉴于目前实验条件有限,本实验教程的内容仅涉及一种基因(ACE基因)的多态性检测,让同学们了解基因检测芯片技术的一般原理和操作技术,为今后的工作和学习打下基础。
作者
2006.9
1.相关基础知识
1.1DNA重组技术的基本原理
基因工程技术的核心内容就是DNA重组技术,即在分子水平上,用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质,在体外切割、拼接和重新组合,然后通过载体把重组的DNA分子引入受体细胞,使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达,按人们的需要生产出不同的产物或定向地创造生物的新性状,并使之稳定地遗传给后代。
强调外源核酸分子(一般情况下都是DNA)在不同宿主中的繁殖,打破自然种的界限,将来自不相关物种的基因放入一个宿主中是DNA重组技术的重要特征。
另一个特征是繁殖。
重组DNA技术主要包括以下几个要素:
载体;工具酶;外源DNA,即要克隆或表达的DNA片断;原核或真核宿主细胞。
基因克隆的基本步骤是先用限制性内切酶切割外源DNA和载体(质粒DNA载体或噬菌体载体),然后连接酶连接,组成DNA重组分子(重组质粒,见图1),转化入受体细胞,构建出基因文库,再筛选。
除了通常的克隆外,还有亚克隆。
初步克隆中的外源片段往往较长,含有许多目的基因片段以外的DNA片段,在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行,因此必须将目的基因所对应的一小段DNA找出来,这个过程叫“亚克隆”。
图1重组质粒构建示意图
载体的作用是把外源DNA带进宿主细胞,并使之在细胞内建立稳定的遗传状态,在细胞内繁殖、传代或进行表达。
质粒载体是最常见的载体,也是使用最方便的载体。
它应用了质粒的复制、拷贝数及不相容性等性质。
质粒载体有抗性基因、琥珀突变抑制基因等多种选择标记和α-互补、插入失活等筛选标记。
常见的质粒载体有:
pBR322、pUC18/19、pUC118/119、pGEM-3Z/4Z以及一些多功能的质粒载体,如:
pBluescriptⅡKS(±)。
大肠杆菌表达载体是最常见的原核表达载体,可分为表达融合蛋白的载体和非融合蛋白表达载体。
常用的标签蛋白有谷胱甘肽转移酶、六聚组氨酸肽、蛋白质A和纤维素结合位点等。
重组DNA所涉及的工具酶,最主要的是II型限制性内切酶和DNA连接酶。
Ⅱ型限制性内切酶用来切割DNA,相当于基因工程中的“剪刀”。
II型限制性内切酶识别回文对称序列,在回文序列内部或附近切割DNA,产生带3'-羟基和5'-磷酸基团的DNA产物,需Mg2+的存在才能发挥活性。
识别序列主要为4bp~6bp,或更长且呈二重对称的特殊序列,但有少数酶识别更长的序列或简并序列,切割位置因酶而异。
如EcoRI和HindⅢ的识别序列和切割位置如下。
EcoRⅠG↓AATTCHindⅢA↓AGCTT
CTTAA↑GTTCGA↑A
连接酶则是将两段核酸连接起来的酶,相当于基因工程中的“糨糊”。
常用的T4DNA连接酶是在T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现和分离的,需Mg2+和ATP的存在才能发挥活性。
它能催化两条匹配DNA链的3’-OH和5’-P之间形成磷酸二酯键而把两个DNA分子连接在一起。
外源DNA就是需要克隆的DNA片断,一般有四种来源。
(1)限制性内切酶切割DNA产生的片断,经电泳分离后回收获得;
(2)大DNA分子经人工剪切产生的片断,这种片断一般是平末端;(3)cDNA,即与mRNA互补的DNA,由真核基因的mRNA逆转录制备;(4)人工合成的基因,例如根据蛋白质的氨基酸顺序和遗传密码合成的一些基因。
外源DNA分子与载体(质粒)经过相同的酶切可以产生相互匹配的粘末端或平末端,经DNA连接酶连接就构成了重组DNA分子(重组质粒)。
质粒的转化就是指将质粒或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌(受体细胞)的过程。
这一步是实现重组克隆的增殖。
受体细胞要接纳外源DNA,必须处于感受态。
所谓感受态,就是细菌具有吸收周围环境中的DNA的生理状态。
为了提高受体菌摄取外源DNA的能力,提高转化效率以获得更多的转化子,人们摸索出了不同的方法处理细菌,使其处于感受态。
目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中,并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。
电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔,因而使外源DNA能进入细胞,一般转化率为109~1010转化子/μgDNA;对于热激法,是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞,可以诱导其产生短暂的“感受态”,易于摄取外源DNA。
转化率约106~107转化子/μgDNA。
获得转化子后可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。
首先可根据转化细胞的特征进行初步筛选。
由于载体都具有供筛选用的遗传标记,如抗生素,细胞转化后获得了这种遗传特性,使用含适当的相应抗生素的培养基即可初步筛选出转化的细菌。
经过培养初步筛选出来的细菌不一定都含有重组DNA,还需进一步对DNA进行分析。
常用方法之一是进行重组质粒的抽提,然后电泳分析,观察其分子量与原有载体相比是否增大;方法之二是将抽提的重组质粒进行限制性内切酶分析,观察酶切下来得到的DNA片段大小是否与预计的相符;方法之三是以重组质粒为模板进行PCR鉴定,观察PCR产物的大小是否与目的基因大小相符;方法之四则是将重组质粒进行DNA序列分析,直接分析重组质粒上的插入片段即目的基因的大小与序列是否正确。
在确证得到核酸序列一致的基因后,接下来就要想办法使该基因得到表达,获得基因表达产物——蛋白(肽)。
通常采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定。
SDS-PAGE电泳不但能观察到蛋白在电场中的泳动位置,而且还能知道蛋白的分子量大小以及由几个亚基组成。
此外,还可将电泳胶上的蛋白质条带转移到尼龙膜上,以亲和反应或免疫反应来检测特异蛋白的存在,即所谓的WesternBlotting。
在基因表达产物也得到确证之后,就可以对表达的蛋白(肽)进行发酵和分离纯化,并研究其生物学功能。
1.2基因芯片技术的基本原理
基因芯片(genechip)技术是自20世纪90年代初发展起来的新兴技术,又称DNA芯片(DNAchip),是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针,有规律地排列固定于支持物上,然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交,再通过激光共聚焦荧光检测系统或CCD成像扫描系统等对芯片进行扫描,并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测,从而迅速得出所要的信息。
基因芯片基本技术通常包括:
芯片制作、样品制备(标记)、生物分子反应(杂交)以及数据分析(杂交信号的检测及分析)等步骤。
在本实验教程中,我们给大家介绍单基因多人份的基因检测芯片的基本原理和技术。
本实验教程使用的基因芯片制作是在醛基修饰后的玻璃基片上制造的。
DNA探针(寡核苷酸片段,与被检测的靶DNA互补)溶液与点样缓冲液以1:
1比例混合,通过点样仪点到醛基基片上,然后用芯片活化液固定8小时。
固定后DNA探针将与醛基玻片共价结合,形成阵列;在基因阵列周围贴上反应舱,完成芯片制作过程。
样品制备:
通过向样本,如毛发、口腔粘膜脱落细胞、全血中加入抽提液,煮沸、离心等操作,使样品中的细胞裂解释放出DNA、同时使蛋白变性沉淀,完成样本DNA的抽提。
抽提获得的染色体DNA浓度太小,直接进行杂交检测无法获得信号。
将抽提获得的染色体DNA作为模板,进行PCR扩增。
针对待检基因序列的SNP位点,设计20bp左右的上、下游引物用于扩增靶DNA,同时,在引物的5’端加上标签序列,对扩增靶DNA进行标记。
杂交反应:
将扩增后的PCR产物变性成单链DNA分子,由于基因芯片上固定有与标签序列相结合的标签探针,可与PCR扩增产物通过碱基配对进行特异性杂交。
这样,芯片上的每个标签探针都结合有一个扩增靶DNA分子。
然后将芯片与经生物素(Biotin)标记的特异性检测探针进行杂交,就可以知道样本DNA序列中的SNP信息,即到底是属于野生型还是突变型,是杂合子还是纯合子。
在杂交反应中,序列组成、靶标DNA分子和探针的长度、杂交温度、盐浓度等均会影响杂交效率和强度。
显色原理:
采用生物素标记的碱性磷酸酶(AP)催化的NBT/BCIP显色反应的检测方法。
首先,特异性检测探针上的生物素先与链亲和素碱性磷酸酶复合物(Stripavitin-AP)反应,生成新的复合物:
Biotin-Stripavitin-AP,后者发生如下的显色反应:
Biotin-Stripavitin-AP+BCI-P→BCI-OH+Pi(pH7.5)
BCI-OH+NBT→蓝紫色沉淀
其中,BCIP为5溴-4氯-3吲哚磷酸;NBT为硝基四氮唑蓝。
检测原理:
采用CCD(ChargeCoupledDevice即电荷耦合器件)原理,将芯片上的色斑信号扫描成图像,用ArrayDoctor分析软件进行分析,给出靶基因SNP信息。
单基因多人份基因芯片检测原理示意图
2实验目的和要求
2.1DNA重组技术实验目的和要求
本实验利用质粒载体克隆外源DNA片段,通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。
2.1.1提取基因工程中的运载基因的载体DNA,掌握最常用的提取和纯化DNA的方法。
2.1.2掌握琼脂糖凝胶电泳的原理,学习琼脂糖凝胶电泳的操作。
并以此法进一步区分质粒DNA中染色体DNA和RNA的污染;估计出质粒DNA分子量的大小;观察质粒DNA三种基本构象的比例;也可用此法纯化DNA及计算出DNA的浓度,是基因工程实验中最常用的实验方法。
2.1.3学习和掌握用紫外分光光度法测定DNA的纯度和浓度。
2.1.4学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法。
了解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具,琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法。
2.1.5学习和掌握感受态细胞的制备过程。
2.1.6掌握质粒的转化方法,学习把体外重组的DNA(即连接反应物)导入受体细胞(感受态细胞),使受体菌具有新的遗传特性,并从中选择出阳性转化子。
2.1.7学习从转化子中筛选和鉴定目的克隆的方法,掌握菌落PCR和限制性内切酶酶切两种鉴定方法。
2.1.8掌握PCR反应的基本原理与实验技术,了解引物设计的一般要求。
2.2基因芯片技术实验目的和要求
2.2.1了解从毛囊中提取基因组DNA的原理和技术。
2.2.2了解在PCR扩增过程中如何对样品进行标记。
2.2.3掌握核酸杂交反应原理,将样品与生物素标记的探针杂交,通过检测杂交信号得出基因的基因型。
2.2.4熟悉利用基因芯片技术检测人染色体基因多态性的基本原理和方法。
3实验材料和仪器
3.1实验材料:
菌种:
大肠杆菌JM101,大肠杆菌DH5α
质粒:
pUC18/19(Ampr)
3.2主要仪器设备:
超净工作台;恒温培养箱;恒温振荡器;恒温水浴锅;微波炉;低温冰箱;
台式高速离心机;漩涡混合器;分析天平;脱色摇床
稳压电泳仪;垂直/水平式电泳槽;紫外-可见光分光光度计;紫外检测仪;SDS-PAGE电泳系统
PCR扩增仪;凝胶成像分析系统
ACE基因检测芯片(上海百傲科技有限公司提供)
BaiO生物芯片识读仪(上海百傲科技有限公司提供)
ArrayDoctor分析软件(上海百傲科技有限公司提供)
3.3实验器皿:
锥形瓶;试管;烧杯;量筒;三角推棒;培养皿;
tip头;Eppendorf管;微量移液枪(2μl-1000μl);微量进样器(50μl或100μl);一次性手套,牙签。
3.4细菌培养基:
LB液体培养基
蛋白胨1.0%
酵母膏0.5%
NaCl0.5%
pH7.5
固体培养基加入2%琼脂。
将上述培养基灭菌后(1.1公斤/cm2,保温20分钟),加入100mg/mL的Amp,使其终浓度为100ug/mL。
3.5分子生物学试剂:
RNaseA溶液:
10mg/mL,0.1MNaOAcpH4.8,0.3mMEDTA,80-100℃加热10分钟,自然冷却到室温,分装,-20℃保藏。
DNAMarker;限制性内切酶EcoRI或HindIII;λDNA(线状);质粒纯化Kit;TaqDNA聚合酶,4×dNTP;引物
溶液I:
50mM葡萄糖;25mMTris-HCl(pH8.0);10mMEDTA
溶液II:
0.2NNaOH;1%(w/v)SDS
溶液III:
5MKAc60mL;冰醋酸11.5mL;H2O28.5mL
核酸上样缓冲液:
50%蔗糖,0.2%溴酚兰溶液
(1)TBE缓冲液(Tris-硼酸):
89mMTris-硼酸;2mMEDTA(pH8.0)。
(2)TAE缓冲液(Tris-HAc):
0.04MTris-HAc,1mMEDTA(pH8.0)。
琼脂糖:
按所需浓度称取,并用核酸电泳缓冲液配制,微波炉或煤气加热熔化使用。
EB染液替代品:
Goldernview染料
氨苄青霉素(Amp)溶液:
100mg/mL,无菌水溶解
IPTG溶液(20%,m/V):
20mgX-gal溶于1mL二甲基甲酰胺中,-20℃避光保存
X-gal溶液(20%,m/V):
1gIPTG溶于4mL去离子双蒸水中,定容至5mL,过滤灭菌后,-20℃保存
苯酚:
氯仿:
异戊醇=25:
24:
1(V/V/V)
70%冷乙醇(-20℃保藏)
3.6SDS-PAGE电泳试剂:
储备液
1.2MTris-HCl(pH8.8),100ml
2.1MTris-HCl(pH6.8),100ml
3.10%SDS,100ml
4.50%甘油,100ml
5.50%溴酚兰,10ml
工作液
A液:
100ml
1.30%丙烯酰胺(29.2g)
2.0.8%甲叉双丙烯酰胺(0.8%)
加蒸馏水至100ml,过滤,棕色瓶避光保存。
B液:
100ml
1.75ml2MTris-HCl(pH8.8)
2.4ml10%SDS
1.21mlH2O
C液:
100ml
1.50ml1MTris-HCl(pH6.8)
2.4ml10%SDS
3.46mlH2O
过硫酸铵,5ml
0.5g过硫酸铵溶于5ml蒸馏水。
电泳缓冲液,1L
1.3g
2.14.4g甘氨酸
3.1gSDS
加蒸馏水定容到1L。
5×上样缓冲液,10ml
1.0.6ml1MTris-HCl(pH6.8)
2.5ml50%甘氨酸
3.2ml10%SDS
4.0.5ml2-巯基乙醇
5.1ml1%溴酚兰
染色液,1L
1.1g考马斯亮蓝R-250
2.450ml甲醇
3.450mlH2O
4.100ml乙酸
脱色液,1L
1.100ml乙醇
2.100ml冰醋酸
3.800mlH2O
其它试剂均为国产分析纯
3.7基因芯片试剂:
毛囊DNA提取试剂盒,Baio基因型检测芯片试剂盒(上海百傲科技有限公司提供)
4实验内容
4.1DNA重组技术实验内容
4.1.1载体的制备
从大肠杆菌中提取质粒作为运载外源基因的载体。
并将提取到的质粒进行琼脂糖凝胶电泳,观察质粒大小、构型和纯度。
为作下一步的酶切,连接及转化试验,还必须测定DNA的纯度和浓度。
将提取到的质粒用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值,可检测质粒纯度并根据吸光值计算出浓度。
4.1.2目的基因的制备
根据已知基因序列,设计两条引物,运用PCR方法扩增出目的基因片断。
将扩增片断用琼脂糖凝胶电泳检测,用PCR产物回收Kit纯化PCR产物,为下一步酶切准备。
注意,如果是真核基因,应该是用其cDNA序列进行克隆。
4.1.3体外DNA的重组(酶切与连接)
选择合适的两种限制性内切酶对供体(
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