土壤微生物.docx

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土壤微生物

微生物接种

（一）斜面接种：

由已长好微生物的斜面中挑取少量菌种接种至另一空白斜面培养基上。

（1）接种前用记号笔在距试管口2~3cm位置上，注明菌名、接种日期等。

（2）将试管放于手掌中，并用手指夹住，使两支试管呈“V”字形。

（3）用火焰将接种环烧红，然后将接种环来回通过火焰数次。

（4）用小指、无名指和手掌拔下试管塞，并持于手中。

（5）将试管口在火焰上微烧一周。

（6）将烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分，使其冷却,以免烫死菌体，然后用环在菌苔上轻轻地接触，刮下少许培养物，并将接种环慢慢的从试管中抽出，并迅速地伸入另一试管中，在斜面上划线（波浪或直线），使菌体沾附在培养基上。

（7）将接种环抽出，灼烧管口。

（8）塞上棉塞。

（9）将接种环经火焰灼烧灭菌。

（二）液体接种：

由斜面菌种接种在液体培养基中

（1）接种前用记号笔在距试管口2~3cm位置上，注明菌名、接种日期等。

（2）将试管放于手掌中，并用手指夹住，使两支试管呈“V”字形。

（3）用火焰将接种环烧红，然后将接种环来回通过火焰数次。

（4）用小指、无名指和手掌拔下试管塞，并持于手中。

（5）将试管口在火焰上微烧一周。

（6）参照图（7-1）

（7）将接种环抽出，灼烧管口。

（8）塞上棉塞。

（9）将接种环经火焰灼烧灭菌。

微生物接种是微生物学研究中最常用的基本操作，主要用于微生物的分离纯化。

具体来说，就是在无菌条件下，用接种环或接种针等专用工具，从一个培养皿（上面可能存在各种杂菌落）挑取所需的微生物，转接到另一个培养基中进行培养，从而实现所需微生物的纯化鉴定，获得没有杂菌污染的单纯菌落等。

接种的方法有很多，按培养基种类可分为利用固体培养基和利用液体培养基，以及居中的半固体培养基。

固体培养分离，有涂布平板法，倒平板法，平板划线法，稀释摇管法等。

大部分细菌和真菌用固体培养法即可以得到较满意的分离结果了。

液体培养基常用稀释法，比较繁琐，一般需要重复进行几次。

土壤微生物分离纯化及测数

作者：

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（高中生物 湖北咸宁赤壁生物一班）  评论数/浏览数：

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2009-07-2916:

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土壤微生物分离纯化及测数

一、实验目的要求

1了解土壤微生物的分离纯化及测数的基本原理。

2学习并掌握微生物分离纯化技术方法。

3学习并掌握微生物平板菌落计数的技术方法。

二、基本原理

土壤是微生物生活的大本营，其中含有大量不同类型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物通过分离进行纯培养，并能对特定类群进行数量测定。

基本原理是通过稀释使菌体细胞充分分散，单细胞得以生长发育形成菌落，可使用稀释法或平板划线法进一步纯化，还可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有微生物的数量。

三、实验步骤

（一）土壤样品采集

在待测田块上，若田块面积小于50平方米则按对角线三点采样，若田块面积大于50平方米按对角线五点采样。

采样一般定点于耕作层0--20cm，先除去表土1--2cm，以无菌铲采土足量充分混匀后用无菌塑料袋分装。

（二）好气性细菌的分离纯化及测数

1.制备土样稀释液

吹吸三次混匀

无菌操作

另留一管不稀释留作对照（CK）

2.培养基的准备

融化牛肉膏蛋白胨培养基，融化后保温在48℃。

并取6个无菌培养皿，分别在皿底贴好标签，注明10-5、10-6、CK（每个稀释度要两个平行皿，对照要两个平行皿）。

3.倾注法接种

先按10-6，10-5的顺序将不同稀释度菌悬液接入对应平皿中（每个平皿接入1ml），再向每个平皿倾注约15ml的牛肉膏蛋白胨培养基（48℃）待冷凝，混合均匀。

4.保温培养

将已经接种的平皿静置10min后，放入温箱倒置培养3--5日（30℃）

观察结果。

5.分区划线法纯化

平板划线分离，其划线方法有以下两种：

6.计数

要求30~300之间计数。

CK除外。

每克湿土样细菌数量

＝平均菌落数×稀释倍数

土壤样品水分系数

＝1∕（1—样品水分百分数）

土壤样品细菌数量（个∕克干土）

＝每克湿土样细菌数量×样品水分系数

四实验报告及思考题

1记录计数结果并计算土壤样品含菌数。

2平板菌落计数的结果是土壤样品实际含菌数？

3比较平板菌落计数与显微镜直接计数的异同，它们各有何优缺点

评价方式

既要重视终结性评价如实验操作考试、书面考试、面试等，更要重视形成性评价如实验作品,实验报告、课题研究报告、研究小论文、提问、交谈等，观察记录学生主动参与教学过程或课题研究活动的程度，对学生的综合能力进行阶段性评价，并注意指导学生进行自我评价。

本模块教学不应只追求实验结果和技能本身，而应重视尝试或制作实践,如“土壤微生物分离纯化及测数”，不仅仅看学生是否制作成功，更要关注制作中学生探究能力的发展,重视学生实践活动中全过程的评价，如，能否搜集资料确定实验方案，能否按照实验操作规范要求安全完成实验，能否实事求是记录和搜集实验数据，能否在实验中与他人合作与交流等方面。

对实验操作技能的评价可利用实验操作检核表等工具。

利用检核表评价操作行为时，要依次列出需要检核的项目及操作行为要点，然后，观察被检核者是否表现了这种行为，并予以记录。

检核表的制作应以实验步骤和操作要求为依据。

真菌用PDA培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，放线菌用查氏培养基，具体配方要查书。

细菌培养

细菌

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概述

　　细菌培养是一种用人工方法使细菌生长繁殖的技术。

细菌在自然界中分布极广，数量大，种类多，它可以造福人类，也可以成为致病的原因。

大多数细菌可用人工方法培养，即将其接种于培养基上，使其生长繁殖。

培养出来的细菌用于研究、鉴定和应用。

细菌培养是一个复杂的技术。

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方法

　　培养时应根据细菌种类和目的等选择培养方法、培养基，制定培养条件（温度、pH值、时间，对氧的需求与否等）。

一般操作步骤为先将标本接种于固体培养基上，做分离培养。

再进一步对所得单个菌落进行形态、生化及血清学反应鉴定。

培养基常用牛肉汤、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、血液等和某些细菌所需的特殊物质配制成液体、半固体、固体等。

一般细菌可在有氧条件下，37℃中放18～24小时生长。

厌氧菌则需在无氧环境中放2～3天后生长。

个别细菌如结核菌要培养1个月之久。

由于细菌无处不在，因此从制备培养基时开始，整个培养过程必须按无菌操作要求进行，否则外界细菌污染标本，会导致错误结果；而培养的致病菌一旦污染环境，就会引起交叉感染。

以疾病诊断为目的进行的培养，要选择合适的标本（血、尿、便、浓、分泌物等），并应结合临床情况解释所得结果。

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培养方法

　　以光合细菌培养方法为例。

光合细菌培养的方法，按次序分为容器、工具的消毒，培养基的制备，接种和培养管理四个步骤。

（一）容器、工具的消毒参考、此处从略。

（二）培养基的制备

　　1．培养用水

　　如果培养的光合细菌是淡水种，菌种培养可用蒸馏水，生产培养可用消毒的自来水（或井水）配制。

如果培养的光合细菌是海水种，则用天然海水配制培养基，注意在海水中加入磷元素时，不能用磷酸氢二钾，应用磷酸二氢钾，不然会产生大量沉淀。

　　2．灭菌和消毒菌种培养用的培养基应连同培养容器用高压蒸气灭菌锅灭菌。

小型生产性培养可把配好的培养液用普通铝锅或大型三角烧瓶煮沸消毒。

大型生产性培养则把经沉淀砂滤后的水用漂白粉（或漂白液）消毒后使用。

　　3．培养基配制根据所培养种类的营养需要选择合适的培养基配方。

按培养基配方把所需物质称量，逐一溶解，混合，配成培养基。

也可先配成母液，使用时按比例加入一定的量即可。

　　（三）接种培养基配好后，应立即进行接种。

光合细菌生产性培养的按种量比较高，一般为20％～50％，即菌种母液量和新配培养液虽之比为1∶4～1∶1，不应低于20％，尤其是微气培养，接种量更应高些，否则光合细菌在培养液中很难占绝对优势，影响培养的最终产量和质量。

　　（四）培养管理光合细菌的培养过程中，管理工作包括日常管理操作和测试，生长情况的观察、检查以及出现问题的分析处理等三个方面。

　　1．日常管理和测试

（1）搅拌和充气：

光合细菌培养过程中必须充气或搅拌，作用是帮助沉淀的光合细菌上浮获得光照，保持菌细胞的良好生长。

小型厌气培养常用人工摇动培养容器的方法使菌细胞上浮，每天至少摇动三次，定时进行。

大型厌气培养则用机械搅拌器或使用小水泵使水缓慢循环运转，保持菌体悬浮。

微气培养是通过充气帮助菌体上浮，因为培养液中溶解氧含量增加，光合细菌繁殖受到抑制，产量下降，所以必须严格控制充气量。

一般采用定时断续充气，充气量控制在1～1.5升／（升•h）之间，溶解氧量保持在1×10-6以下。

（2）调节光照度：

培养光合细菌需要连续进行照明。

在日常管理工作中，应根据需要经常调整光照度。

白天可利用太阳光培养，晚上则需要人工光源照明，或完全利用人工光源培养。

人工光源一般使用碘钨灯或白炽灯泡。

不同的培养方式所要求的光照强度有所不同。

一般培养光照强度应控制在2000～5000lx之间。

如果光合细菌生长繁殖快，细胞密度高，则光照强度应提高到5000～10000lx。

光照强度可通过调整培养容器与光源的距离或使用可控电源箱调节。

　　（3）调节温度：

光合细菌对温度的适应范围很广，一船在23～39℃的范围内均能正常生长繁殖，可不必调整温度。

在常温下培养也可通过调整，将温度控制在光合细菌生长繁殖最适宜的范围内，使光合细菌更好地生长。

　　（4）酸碱度的测定和调整：

在培养光合细菌的过程中，必须注意酸碱度的变化。

由于光合细菌的大量繁殖，菌液的pH值上升，这意味着光合细菌正处于指数生长期。

但当pH值超过最适范围甚至生长的适应范围时，光合细菌的生长达到顶点，随后生长下降。

如果能及时调整菌液的酸碱度，使pH值保持在最适范围，则光合细菌能继续生长繁殖。

为了延长光合细菌的指数生长期，提高培养基的利用率和单位水体的产量，测定和调整PH值是非常重要的。

一船采用加酸的办法来降低菌液的酸碱度，醋酸、乳酸和盐酸部可使用，最常用的是醋酸。

在日常的管理工作中，必须每天或隔天测定菌液的pH值，当pH值上升超出最适范围，即加酸调整。

如果在培养过程中不测定、调整酸碱度，当光合细菌的生长达到一定密度后pH值也上升到9以上，细菌生长受阻，此时应采收或再扩大培养。

在培养过程中不调整PH值，获得的最终产量低。

　　2．生长情况的观察和检查光合细菌生长情况的好坏是培养成败的标准。

在培养过程中，可以通过观察菌液的颜色及其变化来了解光合细菌生长繁殖的大体情况，菌液的颜色是否正常，接种后颜色是否由浅变深，均反映光合细菌是否正常生长繁殖以及繁殖速度的快慢。

必要时可通过显微镜检查，了解情况。

　　3．问题的分析和处理通过日常管理、检测、检查，了解光合细菌的生长情况，就可以结合当时环境条件的变化进行分析，找出影响光合细菌生长繁殖的原因，采取相应的措施。

影响光合细菌生长的原因很多，内因是菌种是否优良，外因是光照、温度、营养、敌害和厌气程度等。

温度、光照和pH值都能影响着光合细菌的生长，而且温度、光照和pH值之间是互相制约的，温度与光照的强弱是对立统一的，所以光合细菌生长的最适条件应是互应的，即温度高，光照应弱；温度低，光照应强。

如果是温度高，光照强，pH值就会迅速升高，培养基产生沉淀，抑制光台细菌的生长；如果温度低，光照弱，光合细菌得不到最佳能源，生长速度也慢。

经试验得出光合细菌生长的最适条件是：

①温度15～20℃时，光照30000～50000lx，培养基pH值为7.0；②温度25～30℃时，光照为3000～5000lx，培养基的pH值为7.0。