双重回生处理锥栗淀粉的理化特性及体外抗氧化学士学位论文.docx

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双重回生处理锥栗淀粉的理化特性及体外抗氧化学士学位论文

毕业论文

题目：

双重回生处理锥栗淀粉的理化特性及体外抗氧化

学院：

化学化工学院

专业：

生物工程班级：

0901学号：

200906030128

学生姓名：

周子愉

导师姓名：

谢涛

完成日期：

2013年6月10日

毕业设计（论文）任务书

题目：

双重回生处理锥栗淀粉的理化特性及体外抗氧化

姓名：

周子愉学院：

化学化工学院专业：

生物工程班级：

0901班学号：

200906030128

指导老师谢涛职称教授教研室主任谢涛

一、基本任务及要求：

基本任务：

1、采用双重回生的方法处理锥栗淀粉；

2、测定双重回生处理锥栗淀粉的溶解度和膨胀因数、平均聚合度、直链淀粉含量及沥滤率等理化性质；

3、测定双重回生处理锥栗淀粉的体外消化性分析其组分含量；

4、测定双重回生处理锥栗淀粉的体外抗氧化性能或自由基清除过程（包括总抗氧化性的测定、DPPH自由基清除能力、ABTS+·清除能力测定、清除超氧离子自由基、脂质过氧化抑制作用的测定、亚硝酸盐清除率）

要求：

在写好开题报告的前提下，按照设计计划进行实验，对实验中遇到的困难和问题，在参考资料和书籍的情况下，仔细分析并且找到解决之道。

在确定实验方案不能取得理想结果的情况下，积极调整实验方案，确定最佳试验条件。

在开始实验设计之后，每天要首先作好当天的内容安排，按计划行事，认真作好相关的实验原始数据记录，仔细观察实验现象，总结每天的进展情况，在计划期内圆满地完成整个毕业课程实验。

最后要按毕业设计的要求总结实验成果，撰写毕业论文，完成毕业论文答辩。

二、毕业论文的进度安排及完成时间：

2013年2月25日到3月24日，查阅文献资料，撰写文献综述和开题报告

2013年3月25日到3月31日，上交开题报告（含文献综述）

2013年3月25日到6月9日，进行毕业论文实验

2013年6月3日到6月9日，撰写毕业论文，补充实验，归还仪器，离开实验室

2013年6月10日到6月12日，上交毕业论文等相关资料，修改毕业论文，准备答辩

2013年6月13日到6月16日，毕业答辩，修改毕业论文，评定成绩，提交成绩单

诚信声明

本人声明：

1、本人所呈交的毕业设计（论文）是在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果；

2、据查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，毕业设计（论文）中不包含其他人已经公开发表过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位而使用过的材料；

3、我承诺，本人提交的毕业设计（论文）中的所有内容均真实、可信。

作者签名：

日期：

年月日

目次

摘要I

AbstractII

1前言1

1.1本课题研究意义及国内外研究现状分析1

1.2本课题的主要目的及需解决的问题2

1.2.1本课题研究的目的2

1.2.2本课题研究的主要任务2

2材料与方法2

2.1原料制备2

2.2实验试剂和仪器3

2.3实验方法3

2.3.1双重回生处理锥栗淀粉3

2.3.2直链淀粉含量的测定3

2.3.3沥滤率的测定4

2.3.4平均聚合度的测定4

2.3.5溶解度和膨胀因数的测定4

2.3.6RDS、SDS与RS含量的测定5

2.3.7体外抗氧化性5

3结果与讨论7

3.1双重回生处理锥栗淀粉中表观直链淀粉含量7

3.2双重回生处理锥栗淀粉的沥滤率8

3.3双重回生处理锥栗淀粉的平均聚合度9

3.4双重回生处理锥栗淀粉的溶解度和膨胀因数9

3.5双重回生处理锥栗淀粉中RDS、SDS、RS含量10

3.6双重回生处理锥栗淀粉体外抗氧化性11

3.6.1总抗氧化活性11

3.6.2DPPH自由基清除能力12

3.6.3ABTS自由基清除能力13

3.6.4超氧阴离子自由基清除能力14

3.6.5脂质过氧化的抑制作用14

3.6.6亚硝酸盐的清除能力15

4结论16

参考文献17

致谢20

双重回生处理锥栗淀粉的理化及其体外抗氧化

摘要：

以自制锥栗淀粉为原料,采用双重回生处理锥栗淀粉得到了9个变性样品，测定了它们的理化特性和样品中快速消化淀粉（RDS）、缓慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）含量；并从中挑选三个代表性样品，研究其体外抗氧化性。

实验结果表明：

⑴与锥栗原淀粉相比，双重回生处理锥栗淀粉样品中直链淀粉含量有比较显著的增加；对它们的平均聚合度、溶解度和膨胀因数有显著增加。

两次回生时间对锥栗淀粉表观直链淀粉含量、沥滤率和膨胀因数的影响都不显著；对它们的平均聚合度有比较显著的增加，溶解度有比较显著减少。

⑵测定双重回生处理锥栗淀粉样品中快速消化淀粉（RDS）、缓慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）的含量，发现双重回生处理能够提高缓慢消化淀粉（SDS）含量。

⑶测定了总抗氧化能力、对脂质过氧化的抑制作用、清除DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子、亚硝酸盐的能力这6种方法来评价双重回生处理锥栗淀粉样品中三个典型样品的体外抗氧化性，发现在2-10mg/ml的浓度范围内，其体外抗氧化能力随浓度的升高而增大。

关键词：

双重回生处理；锥栗淀粉；理化性质；体外抗氧化性

PhysicochemicalandantioxidativepropertiesofCastaneahenryistarchestreatedbydual-retrogradation

Abstract:

Withself-madeCastaneahenryistarchasmaterial,ninemodifiedsamplesweremadebydual-retrogradationtreatment,theirphysicochemicalproperties,andcontentsofreadydigestiblestarch（RDS）,slowlydigestiblestarch（SDS）andresistantstarch（RS）weredeterminated.Theinvitroantioxidantactivitiesofthreetypicalsamplesselectedfromthemwerestudied.Theresultsshowedthat:

⑴Comparedwithnativestarch,theamylosecontentofdual-retrogradationofallsampleshavemoresignificantincrease;Theaveragepolymerization,solubilityandswellingfactorofallsampleshavegreatlyincrease.Impactsoftworetrogradationtimeonamylosecontent,amyloseleachingandswellingfactorwerenotsignificant,whiletheiraveragepolymerizationhavemoresignificantincrease,thesolubilityhavemoresignificantdecrease.

⑵Thecontentsofreadydigestiblestarch（RDS）,slowlydigestiblestarch（SDS）,resistantstarch（RS）ofallsamplesweremeasured.Itwasfoundtheslowlydigestiblestarch（SDS）contentsofallsamplescanbeimprovebydual-retrogradationtreatment.

⑶Bydeterminationoftotalantioxidantactivity,inhibitionoflipidperxidation,scavengingabilityofDPPHfreeradical,ABTSfreeradical,superoxideanionandnitrite.Theinvitroantioxidantofthreetypicalsamplescanbeevaluated.Itwasfoundthatin2-10mg/mlconcentrationrange,theinvitroantioxidantactivitiesincreasewiththeirincreaseofconcentration.

Keywords:

dual-retrogradation;Castaneahenryistarch;physicochemicalproperties;theinvitroantioxidantcapacity.

1前言

1.1本课题研究意义及国内外研究现状分析

淀粉是食品中最重要的产生葡萄糖的组分之一，因为它是由传统的主食材料提供的，如谷物、块根和块茎，以及各种由这些原料制成的产品。

与生糖指数的分类相似，淀粉已经根据Englyst[1-2]体外消化法分为快速消化淀粉（RDS），慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）。

缓慢消化淀粉（SDS）是指那些能在小肠中被完全消化吸收但速度较慢的淀粉（20～120min），可持续缓慢地释放能量。

淀粉的消化与人体的许多疾病密切相关，对于糖尿病和心血管疾病患者而言，食用低血糖指数的食物对其疾病具有一定的疗效，而人体对食物的血糖反应很大程度取决于食物的消化速度，抗性淀粉和缓慢消化淀粉含量高的食物血糖指数低。

因为缓慢消化淀粉具有被酶完全缓慢水解的特性，对人体健康非常有益，越来越受到人们的关注。

临床证明，这类改性淀粉可以有效改善糖负荷，将成为一类新型的功能性食品。

这种产品不单针对糖尿病[3]、心血管疾病[4]、肥胖症[5]的患者，对于作为运动员，尤其是马拉松等长跑运动员的碳水化合物补充剂，因为缓慢消化淀粉能使运动员在运动过程中有一个稳定持久的能量释放来源。

当代社会，糖代谢不正常人群所占比例越来越高，因此，开发低血糖指数的食品将有利于高胰岛素人群、糖过敏患者和糖尿病人等使用。

随着生活水平的提高，人们对食品的健康和营养问题越来越重视和关注，越来越多种类的功能性食品是21世纪食品工业的发展的大方向。

淀粉作为仅次于纤维素的可再生资源，具有价廉易得、可降解和良好的生物相容性等功能特性，是食品工业的主要原料，于是对淀粉的研究便成为了一大热点。

到目前为止，国外关于SDS颗粒的显微结构、理化特性及富SDS制备方法[6-8]等方面的研究较多，Hamaker、Shi[9-10]等申请的专利中提及可将SDS应用添加到不同淀粉食品中，如将SDS应用到烘焙食品、快餐、乳制品等领域，而国内相关的研究还较少，对SDS的认识还不够清楚全面，各方面方法技术还不成熟，且基本尚未投入工业化生产。

对SDS的将来的研究需要把中心集中在新颖的SDS制造技术、发展评价不同SDS原料品质的体内方法，并深入理解SDS的生理作用。

同时，也需要研究SDS和不同膳食纤维之间的生理联系及他们对结肠的影响来全面描绘出碳水化合物的营养作用，更好地控制食物中葡萄糖的释放和传递。

1.2本课题的主要目的及需解决的问题

1.2.1本课题研究的目的

本课题以锥栗淀粉为原料，通过双重回生的方法处理锥栗淀粉，分析检测用该方法处理的锥栗淀粉的理化特性，并且在体外消化条件下，测定双重回生处理锥栗淀粉样品中快速消化淀粉（RDS）、缓慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）的含量。

最后挑选三个典型样品测定其体外抗氧化性能。

通过本课题研究，可以探讨锥栗淀粉在双重回生处理后理化特性和体外抗氧化性，为锥栗淀粉的深加工和锥栗淀粉的食品工业应用提供重要的理论依据。

1.2.2本课题研究的主要任务

⑴锥栗淀粉的处理：

以自制锥栗淀粉为原料，采用双重回生的方法处理锥栗淀粉。

⑵双重回生处理锥栗淀粉理化性质的研究：

通过对样品溶解度和膨胀因数、平均聚合度、直链淀粉含量和沥滤率的测定，分析其基本理化性质。

⑶双重回生处理锥栗淀粉体外消化性的研究：

构建淀粉体外消化模拟过程，测定并分析得到RDS、SDS及RS的含量。

⑷双重回生处理锥栗淀粉的体外抗氧性能：

评价天然物的体处抗氧化活性的方法多种多样，主要有清除自由基型、还原金属离子、抑制脂质过氧化等化学评价方法，以及体外抗氧化活性细胞的生物学方法。

通过总抗氧化性的测定、脂质过氧化抑制作用的测定、总还原能力的测定、清除超氧离子自由基、DPPH清除率、ABTS清除能力测定、亚硝酸盐清除率的测定等，可反映出双重回生处理锥栗淀粉样品的体外抗氧化性能。

2材料与方法

2.1原料制备

锥栗淀粉：

市场购买锥栗，实验室自制锥栗淀粉

2.2实验试剂和仪器

⑴酶制剂：

猪胰α-淀粉酶（3000U/g，上海希美生物科技有限公司）、淀粉葡萄糖酶（105789U/g，上海金穗生物科技有限公司）。

化学试剂：

无水乙醇、氢氧化钠、碘试剂、醋酸、醋酸钠、浓硫酸、磷酸钠、钼酸铵、PBS、硫氰化铁、ABTS、冰醋酸、卵磷脂、TCA、TBA、浓盐酸、三氯化铁、邻苯三酚、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠、DPPH、维生素C，以上试剂均为分析纯。

⑵实验仪器：

WFZUV-2100型紫外可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）、SBA-40C型生物传感分析仪（山东省科学院生物研究所）、GL-3250B型恒温磁力加热搅拌器（苏州江东精密仪器有限公司）、TDZ5-WS型自动平衡离心机（赛特湘仪离心机仪器有限公司）、V-1100D型可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）、XOSHZ•A水浴恒温振荡器（南京先欧仪器制造有限公司）、SPX-250B-Z型生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、DZKW-4电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）、DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱（上海基玮试验仪器设备有限公司）、FE20实验室pH计（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。

2.3实验方法

2.3.1双重回生处理锥栗淀粉

参照Tian[11]等的处理方法并作适当修改：

称取10g锥栗淀粉溶于2倍蒸馏水中，并在沸水浴中加热30min，将所得的淀粉浆密封并在4℃下分别保存24h、36h、48h，之后将回生样品置于沸水浴中20min，然后在4℃下分别保存24h、36h、48h，将样品烘干后过140目筛得锥栗淀粉产品。

2.3.2直链淀粉含量的测定

采用碘比色法[12]测定锥栗淀粉的直链淀粉含量：

⑴标准曲线的绘制：

取50mg支链淀粉标准样品，加入50mL容量瓶中，加入1mL无水乙醇润湿，再加10mL0.1mol/LNaOH，沸水浴振荡加热10min溶解淀粉，用蒸馏水定容摇匀。

用同样方法配制直链淀粉标准溶液。

精确吸取标准溶液于50mL容量瓶中，配置一系列梯度标准溶液。

向各容量瓶加20mL蒸馏水，用0.1mol/LHCl调pH值为3.0。

再加入0.5mLI2-KI（碘试剂），定容摇匀，静置10min，在620nm下，测吸光度（以蒸馏水作参比溶液）绘制标准曲线。

所得直链淀粉含量测定标准曲线计算公式为y=0.0164x（R2=0.9979）。

⑵样品测定：

准确称取样品100mg，加1mL无水乙醇，润湿振荡，再加10mL0.5MNaOH，沸水浴加热溶解10min，冷却后用蒸馏水定容摇匀得样品液。

吸取2.5mL样品液于50mL容量瓶中，加20mL蒸馏水后用0.1mol/LHCl调pH值为3.0，加0.5mLI2-KI，定容摇匀，静置10min。

在620nm下，测吸光度。

并用标准曲线计算直链淀粉含量。

2.3.3沥滤率的测定

参考ChungHJ[13]测沥滤率的方法。

取20mg淀粉样品加入10mL蒸馏水中，80℃密封水浴加热30min。

冷却至室温，2000r/min下离心10min。

倒出上清液，测定上清液直链淀粉含量。

（沥滤率表示每100g干淀粉浸出的直链淀粉的百分比）。

2.3.4平均聚合度的测定

采用碘吸收法[14]，称取淀粉样品20mg加入0.5mL无水乙醇润湿样品，加入2mol/L的KOH溶液1mL，使样品充分溶解。

加入10mL去离子水，用0.1mol/L的HCl溶液将pH值调至6.0～7.0，加水定容至50mL。

取10mL于100mL容量瓶，加入80mL去离子水和2mLI2-KI溶液（I22mg/mL和KI20mg/mL），定容至100mL，立即混匀。

用紫外分光光度计扫描，波长450～800nm。

采用紫外-可见分光光度计进行扫描波长范围为450~800nm，测定最大吸收峰；淀粉是不同分子质量同系的混合物，所以表示时用平均聚合度（DP）。

根据Banks[15]公式①：

①

2.3.5溶解度和膨胀因数的测定

参照KooSH[16]等的研究方法，准确称取M0=0.6g淀粉样品，加入到30mL的蒸馏水中，在85℃下磁力搅拌器中充分搅拌30min，再在2026r/min下离心15min。

小心将上清液倒入培养皿中，并将离心管中的吸胀淀粉称重得M1。

将上清液烘干直到恒重，称得培养皿上淀粉重M2。

用公式②计算溶解度和膨胀因数。

②

2.3.6RDS、SDS与RS含量的测定

参照Miao[17-18]等的方法，略做改动。

称取50mg淀粉粉末放入15mL离心管，用2.5mL含0.02%叠氮钠、pH5.2的醋酸-醋酸钠缓冲液混匀，预热至37℃。

将8g猪胰α-淀粉酶（3000U/g，上海希美生物科技有限公司）溶于10mL上述缓冲液中，于37℃孵育10min，1500g离心得到的上清液即为α-淀粉酶溶液。

使用前在α-淀粉酶溶液中混入125μL（300U/mL）淀粉葡萄糖酶（105789U/g，上海金穗生物科技有限公司）即得混合酶液。

3份200μL混合酶液与100μL淀粉乳液的混合液配制后，立即置于37℃往复式振荡水浴（170次/min）中依次反应0、20和120min，加入96%的乙醇溶液900μL钝化酶活性并使之沉淀。

沉淀在4℃贮放1h，4℃离心（5000g）10min。

上清液中的还原糖含量采用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶（GOPOD）分析试剂（Wicklow公司，爱尔兰），用SBA-40C生物传感分析仪测定。

快速消化淀粉（RDS）、缓慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉含量由0min（G0）、20min（G20）、120min（G120）时的葡萄糖含量以及样品的初始干重（S）按表达式③④⑤计算而得：

③

④

⑤

2.3.7体外抗氧化性

2.3.7.1总抗氧化活性的测定—磷钼络合物法

参考Prieto[19]等的方法，并作适当修改。

配制浓度分别2、4、6、8、10mg/mL的双重回生锥栗淀粉淀粉溶液。

取4mL磷钼试剂液（0.6mol/L浓硫酸、28mmol/L磷酸钠和4mmol/L钼酸铵），加入2mL不同浓度的锥栗淀粉样品液，95℃水浴中恒温90min。

以蒸馏水调零，测定其在695nm波长下测吸光度。

吸光度越高抗氧化能力越强，以Vc作阳性对照（Vc配置浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL）。

2.3.7.2DPPH自由基清除率的测定

参考Thaipong等[20]的方法，并作适当修改。

浓度对DPPH自由基清除率的影响：

配制不同浓度双重回生处理锥栗淀粉样品液，精确吸取2.0mL，加入0.2mmol/LDPPH溶液2.0mL，摇匀，常温放置30min，用无水乙醇调零，测定517nm处吸光度Ai。

然后，测定样品溶液2.0mL与乙醇2.0mL混合液在517nm处吸光度Aj；测定DPPH溶液2.0mL和乙醇2.0mL混合液在517nm处吸收度Ac。

以Vc作阳性对照。

DPPH自由基清除率按公式⑥计算。

以样品的不同浓度对清除率作图，可得清除率达到50%时所需样品的量，即IC50值。

⑥

2.3.7.3ABTS+·清除能力的测定

参考Re[21]等的方法，并作适当修改。

配制浓度分别2、4、6、8、10mg/mL的双重回生处理锥栗淀粉样品溶液。

精确吸取2mL，加入2mLABTS+·测定液，准确振荡30s后，以蒸馏水调零，测定734nm波长处的吸光度Ai；以等量蒸馏水代替ABTS+·测定液，同样方法测定吸光度Aj。

以Vc作阳性对照。

清除率按公式⑦进行计算。

⑦

2.3.7.4超氧阴离子自由基清除能的测定

参照李燕凌等[22]的方法。

吸取pH8.3的Tris-HC1缓冲液2mL，加入不同浓度的双重回生锥栗淀粉溶液2mL，混匀后，37℃水浴放置20min，再加入37℃预热的10mmol/L邻苯三酚1mL，混匀后准确反应4min。

加入1滴浓盐酸终止反应，于420nm波长下测定吸光值Ai；以蒸馏水代替邻苯三酚，同样方法测定吸光值Aj；以蒸馏水代替样品液，同样方法吸光值Ao。

以Vc作阳性对照。

清除率按公式⑧进行计算。

⑧

2.3.7.5脂质过氧化抑制作用的测定

参考Ock-Sook等[23]的方法，并作了适当改进。

配制浓度分别2、4、6、8、10mg/mL的双重回生锥栗淀粉溶液。

于样品管中依次加入1mLLLS溶液、1mL0.4mmol/L三氯化铁溶液、2mL不同浓度的锥栗淀粉样品溶液，混匀。

37℃水浴避光反应1h，再加入2mLTCA-TBA-HCl混合液，95℃水浴15min，迅速冷却，以4000r/min离心10min，以蒸馏水调零，取上清液在535nm测吸光度值Ai；以等量蒸馏水代替样品液，同样方法测得吸光度Ao。

以Vc作阳性对照。

抑制率按公式⑨进行计算：

⑨

2.3.7.6亚硝酸盐清除率的测定

参考赵二劳[24]等的方法，取5mg/L的NaNO2标准液2.0mL于25mL比色管中，加入不同浓度的双重回生处理锥栗淀粉样品溶液，常温放置30min后，加入0.4%对氨基苯磺酸2.0mL，摇匀静置5min，再加入0.2%盐酸萘乙二胺1.0mL，用蒸馏水稀释至刻度，放置15min后，以蒸馏水调零，测定其在540nm波长下的吸光度值Ai，平行做三次。

以等量蒸馏水代替样品液，同样方法测定其吸光值Ao。

以Vc作阳性对照。

清除率按公式⑩进行计算。

⑩

3结果与讨论

3.1双重回生处理锥栗淀粉的表观直链淀粉含量

双重回生处理锥栗淀粉样品中的表观直链淀粉含量见表1。

由表1可知淀粉表观直链淀粉含量都在（20.975±0.425）%~（23.385±0.095）%范围内。

对表1中数据进行单因素方差分析可知，两次回生时间对表观直链淀粉含量的影响不显著（P＞0.05）。

未处理锥栗原淀粉表观直链淀粉含量16.77%，与