病毒性肝炎检验诊断进展与评价上下.docx
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病毒性肝炎检验诊断进展与评价上下
病毒性肝炎检验诊断进展与评价(上)
张东华单位:
上海第二医科大学瑞金医院
摘要:
病毒性肝炎是一种常见传染病,由于其发病率高,易引起慢性肝损害,所以临床对病毒性肝炎的诊断与治疗方法的进展也非常关注。
本文介绍了甲型、乙型、丙型病毒性肝炎的病原学、血清学、肝组织病理学的检查项目及其在病毒性肝炎分型、分期中的意义。
关键词:
病毒性肝炎 病原学 病理学 血清学 检验诊断
病毒性肝炎目前已经确定的有甲型、乙型、丙型、丁型、戊型五种病毒引起,有待阐明的有庚型肝炎病毒、TTV及SEN-V等。
除肝炎病毒外,其他病毒如巨细胞病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒、埃可病毒、风疹病毒等均可引起肝脏损害,但这类病毒所致肝炎为全身感染的一部分,不属于病毒性肝炎。
病毒性肝炎的诊断应包括对感染病原的检测和病变状态的较全面的了解。
包含病原学、血清学、肝组织病理学等数方面。
对血清病毒标志物的认识仍在发展中,如HBeAg(-)未必表示病毒复制终止;HBsAg(-)也未必是排除HBV感染。
PCR技术的问世有效提高了肝炎病原学的诊断水平,已证明HBeAg(-)、甚至HBsAg(-)时可能仍存在病毒复制,因此,PCR是分子病毒学研究的重要技术。
一些传统的肝酶和肝功能试验仍较实用,如血清转氨酶(ALT、AST)反应病变的活动性,白/球蛋白定量及其比率反应病变的慢性化,凝血酶原时间延长则反应肝功能衰竭。
肝组织病理学是肝脏疾病分类的重要依据,通过肝活体组织检查能判定潜在的病变活动状态,但并不能“一锤定音”,由于国内肝穿刺开展很不普遍,目前开展的对纤维化的血清学试验,其灵敏性和特异性都较低,只能有限地提示肝纤维化的动态发展。
第一节 肝炎病毒病原学检测
一、病毒感染标志物检测
病毒感染标志物用酶免疫法(enzymeimmunoassay,EIA)或放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)检测。
EIA和RIA只是配体的标记不同,反应模式基本相同。
按待检标志物的性状,分别有夹心法、竞争抑制法和捕获法。
EIA的灵敏性在ng/ml水平以上(RIA更灵敏一些),是当前应用最为广泛的方法。
Axyme、Imx系统是近年来Abbott公司推出的一种全自动封闭式的酶联分析仪,它是在酶联免疫和荧光极化免疫技术的基础上设计、并可用以进行各种免疫试验的仪器,我国已引进了该仪器及进口试剂。
用Axyme、Imx系统进行检测,与普通酶联免疫技术所不同的是包被载体不是通常使用的聚乙烯反应板,而是不足1mM的微粒,这一方法被称为MEIA(microparticleenzymeimmunoassay)。
其基本原理为:
①待测标本中抗原或抗体与微粒上已包被相应的抗体或抗原结合,形成免疫复合物。
②免疫复合物被吸附于玻璃纤维上,MEIA试验专用的反应杯中有1孔含有特别的玻璃纤维,它可以吸附前一步中所形成的免疫复合物,而其它未被吸附的物质,则通过仪器的自动冲洗从大的孔径中流出。
③酶标记物与免疫复合物相结合。
④加入荧光底物后,经酶催化显色。
⑤通过光学系统检测荧光变化速率,可计算出被检标志物的含量。
(一)甲肝病毒标志物检测
应用固相放射免疫法(SPRIA)或酶联免疫法(ELISA)检测粪悬液中HA-Ag,于起病前二周即可检测到,发病后一周阳性率为45%,二周为12%。
提示甲肝急性期或无症状感染者均可作为传染源,常用于甲肝患者粪中排毒规律或传染期的观察。
1.抗HAV-IgM 是最可靠的常规检测指标。
有固相放射免疫(SPRIA)或酶免疫试验(ELISA)。
血清中抗HAV-IgM出现于甲肝病毒感染的早期,发病后数天滴度很快升至峰值,高滴度持续2~4周,并在短期内降至较低水平,通常在3~6个月转为阴性(个别可超过1年)。
因此是甲型肝炎早期诊断最简便和较可靠的血清学标志,也是流行病学上区分新近感染(包括临床和无症状的亚临床感染)与既往感染甲肝病毒的有力证据。
2.HAV总抗体或抗HAV-IgG HAV总抗体包括抗HAV-IgM和抗HAV-IgG,前者出现早,消失快;后者出现稍晚,于2~3个月达到高峰,然后缓慢下降,持续多年或终身。
单份抗-HAV阳性表示受过HAV感染,但不能区分该感染是新近还是既往,适用于流行病学调查。
双份血清检测抗-HAV,滴度有4倍以上增长,在临床上也可作为诊断甲型肝炎的依据。
(二)乙肝病毒血清标志物检测
1、HBsAg 在HBV感染者中出现最早,滴度最高,是乙肝诊断的重要标志。
典型急性乙肝,潜伏期先出现HBsAg,经2~6周才出现肝炎症状、体征及肝功能异常,在血中可持续1~2个月,于恢复期消失,若持续6个月以上,常发展为慢性肝炎。
除见于急慢性乙肝外,尚可在慢性无症状携带(AsC)、肝炎后肝硬化和肝细胞癌患者中检测到。
2、抗HBs 是一种保护性抗体,能清除病毒,防止HBV感染,在急性乙肝中最晚出现(发病后3个月),常示疾病恢复。
在暴发型肝炎中抗HBs常呈高滴度,并与HBsAg形成免疫复合物,是致肝细胞块状坏死的原因。
接种乙肝疫苗后,可出现抗HBs,也是评价乙肝疫苗的重要标志。
在HBV感染恢复期中约有3%的个例可同时检出HBsAg和抗HBs,这是由于近年来试剂敏感度特别是抗HBs检测率提高所至,意义是形成免疫复合物、HBV多种亚型感染的结果或机体免疫紊乱。
3、抗HBc
(1)抗HBc总抗体 在HBV感染后早于抗HBs出现,高滴度,可持续数十年。
高滴度的抗HBc(主要是IgM)表示现行感染,常与HBsAg并存,并有ALT异常;低滴度的抗HBc(主要是IgG)标志过去感染、无肝损害或肝损害已静息,由于抗体持续时间长,常用于流行病学调查;献血员筛选采用HBsAg,若能加上抗HBc,即可进一步减少输血后肝炎;亦是疫苗安全性观察指标。
(2)IgM抗HBc 阳性意味着HBV所致的特异性肝损。
低滴度可以是非特异性的,高滴度被认为是诊断急性乙肝的确诊指标。
在慢性乙肝活动期可呈阳性,缓解期可消失。
急性乙肝:
IgM抗HBc>IgG抗HBc,
慢性乙肝:
IgM抗HBc<IgG抗HBc,
暴发型肝炎:
两种抗体呈高滴度。
4、HbeAg 于HBsAg稍后出现,与HBVDNA关系密切,是临床上表达病毒复制较实用的血清标志物,目前可半定量检测,若HBeAg持续阳性,则可发展为慢性乙肝;孕妇HBeAg阳性,其母婴传播率可高达90-100%;HBeAg亦可作为抗病毒药物疗效考核指标之一。
5、抗HBe 急性乙肝时,抗e的出现表示病情恢复,病毒复制减少或终止;慢性乙肝携带者和肝癌中出现抗HBe,示病毒复制减少,并不意味着疾病的恢复,且易发生HBVDNA整合现象。
抗HBe出现示传染性小,但不能作为无传染性标志。
近年来,发现HBeAg阴性,HBVDNA阳性的慢性乙肝,是前C区变异株所致。
HBV血清标志物小结:
HBV标志物不仅是诊断HBV感染的根据,而且有助于对感染状态和病变活动性作出分析,反映了HBV的感染过程(表1)
但标志物常是联合存在的,在感染中的变动也有相互关联性(表2)。
(三)丙肝病毒抗体检测
1、抗HCV 第一代试剂盒含有C-100(NS3区)抗原;第二代试剂盒包括C-100、C-22(C区)、C33(NS3),抗体检出较第一代早32-90天,检出率增加20%;第三代试剂增加了NS5抗原成分,并相应降低了核心区抗原成分,这在提高灵敏度及降低低危人群的非特异反应确实起了很大作用。
但有些研究证实,核心区抗原减少可能太多了,因此在检测中可能产生一定的漏检。
所以,有必要在新一代试剂中提高核心区抗原成分。
其临床意义:
(1)抗HCV-IgG 于发病后1-3个月阳转,急性丙肝不能早期发现,一次阴性不能否定HCV感染,是慢性丙肝诊断的主要标志。
(2)抗HCV-IgM 急、慢性丙肝中均可测到阳性,有人认为可作为评价抗病毒药物治疗丙肝的参考指标。
2、重组免疫印迹试验(RIBA) RIBA即重组免疫印迹分析(recombinantimmunoblotassay),是作为一种旁证实验(suplementtest)随着第一代HCV抗体检测试剂而产生的。
当时,由于C100是HCV基因与SOD基因融合增加一起表达的重组蛋白,在实际检测中经常产生与SOD蛋白的非特异性反应。
为验证实验结果的特异性, Chiron公司推出了RIBA实验方法,做为一种旁证实验应用于HCV的临床检测。
第一代的RIBA是将C100,5-1-1及SOD抗原共同点在一张膜上,将此膜与被检血清反应,两种抗原均呈阳性,且SOD带为阴性,则判为阳性反应。
仅有一种抗原阳性判为可疑。
第二代的RIBA实验又增加了C33c和C22抗原,两种或两种以上呈阳性反应则判为阳性。
只对其中一种抗原呈阳性反应则判为可疑。
目前发展的第三代RIBA试剂包括核心区的C22p,NS3区的C33c,NS4区的5-1-1p和C100p及酵母表达的NS5抗原。
作为HCV抗体的确诊试验,RIBA能检测HCV不同成分多肽的相应抗体,并可排除非特异性所致的假阳性,其中C33和C22与PCR检测HCVRNA有较好符合率;C33和C22为早期抗体,C-100和5-1-1为晚期抗体。
RIBA实验提高了抗体检测的特异性,但其灵敏度稍逊,不适于常规检测。
二、病毒核酸检测
病毒核酸是病毒感染的直接证据,是反映体内病毒复制的良好指标,也是反映血液有否传染性的重要标志,亦是抗病毒药物疗效评价的重要指标。
斑点杂交可检出2~10pg/ml或105~6拷贝/ml的HBVDNA,大多数感染者的血清病毒水平较此为高,少数患者及抗病毒治疗后期可低于这一的检出水平。
聚合酶链反应(polymerasechainreactionPCR)又称无细胞分子克隆法,只需数小时即可用电泳法检出0.1mg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列,较斑点杂交又大大增加了敏感性,随着研究工作不断深入,PCR的方法也不断改进,相继建立了有探针杂交的PCR-ELISA、荧光PCR等方法,检测灵敏度可达102拷贝/ml。
随着抗病毒药物的临床使用,人们越来越关注病毒水平与疗效的关系,认识到从基因定量角度作病情分析的重要性。
定量检测病毒基因有多种方法,从技术类型分有两大类,即分子杂交和PCR法。
前者包括:
①分支链DNA信号扩增试验(branchedDNA,bDNA,Bayer),②杂交捕获试验(HybridCaptureⅡ,Digene),③液相杂交(Liquidhybridization,Abbott);后者有④PCR-Amplicor(Roche)和⑤实时荧光PCR(MolecularBeacons)等。
基因定量分析除了应用于抗病毒药物疗效研究之外,还在转基因动物、基因治疗、蛋白疫苗和核酸疫苗和动物试验及耐药研究、流行病学研究、HBV血液制品污染监测等方面具有重要的应用价值。
第二节 血清肝酶和肝功能试验
血清肝酶和肝功能生化试验对作出正确诊断、判定病情重度、估计预后和评估治疗效果是非常重要的。
血清肝酶(包括转氨酶和某些其它血清酶)反映肝细胞炎症坏死,并不表达肝脏的功能状态。
肝脏炎症活动时,有血清肝酶水平的增高,同时有肝功能试验的异常。
一种试验难以反映肝功能损害的全貌,过多的试验又难以作为临床常规,当前常用的一些试验方法是在长期临床实践中选择出来的(表3)。
每一种试验只说明肝脏功能或肝脏病变的某一个方面,并不能反映其全貌。
一些慢性肝病,即使已是肝硬化或肝细胞癌,肝功能试验可无异常;反之,肝脏生化试验异常,又可由于肝外脏器的病变。
因此,需结合临床及其它检查全面分析,还需进行动态观察。
第三节 肝组织病理学检查
肝活体组织检查对病人的肝脏情况提供重要的、甚至可能是决定性的资料,如慢性乙型肝炎的临床诊断,一旦标明“经肝活体组织检查证实”,则将极大提高资料的可信度和论点的说服力。
旧的组织病变活性积分系统及分级、分期方法因存在种种不足,难于作为常规工作应用。
新的分类不止区别病变的重度(分级)、进展的阶段(纤维化,结构的改变,分期),而且要求结合病原学。
(一)分级和分期
当前按病毒分类,以肝穿刺时组织炎症坏死活性的程度分级,纤维化也有了半定量的评分系统,可按纤维化的积分和组织结构改变的程度分期(表4)。
慢性肝炎时组织病变的活性(积分),主要取决于界面炎症和腺泡内炎症的程度(即有无桥接坏死和融合性坏死),汇管区炎的浸润细胞数量增加并不相应增加积分。
炎症分级和纤维化分期常同步发展,也可不尽一致。
炎症分级可复发加重和消退,纤维化分期总是随病程稳定发展。
分级(G)和分期(S)不同步时,G>S时按G分度,G<S时需分别描述。
如G2S3可诊断轻度炎症、中度纤维化,G1S4可诊断轻度炎症、早期肝硬化。
(二)分度
临床诊断还需要按病情程度分度。
组织学分度由分级和分期的数值综合确定(表5)。
不论由何种病毒所引起,急性和慢性病毒性肝炎的病理学有相同的基本表现,各种病毒性肝炎组织病变的相似超过了相互间的差异。
这些差异可能启发对诊断的推测,并可能评估混合感染中不同病毒的相对作用,以及由病变的差异分析发病机制的可能差异。
病毒性肝炎检验诊断进展与评价(下)
张东华单位:
上海第二医科大学瑞金医院
摘要:
病毒性肝炎是一种常见传染病,由于其发病率高,易引起慢性肝损害,所以临床对病毒性肝炎的诊断与治疗方法的进展也非常关注。
本文介绍了病毒性肝炎实验诊断在临床诊断于鉴别时的意义。
关键词:
病毒性肝炎 核酸定量检测
第四节 病毒性肝炎实验诊断在临床中的应用
一、病毒核酸定量检测的比较
基因定量技术的发展历史不长,但由于有定性技术为基础,以及与其它学科方法的融汇,发展速度很快,目前趋于成熟。
最常用的基因检测方法是杂交法和PCR法,两种方法各有优势,但又各有不尽如人意之处。
比较肯定的是:
杂交法的特异性、稳定性优于PCR法,PCR法的敏感度胜过杂交法(表6)。
无论是选择杂交法还是PCR法,应从技术条件、临床需要、检测成本等多方面综合考虑加以选择。
二、甲型肝炎实验诊断与临床的关系
肝脏是人体主要的代谢器官,可以接受众多治病因子的刺激,诸如病原微生物、代谢影响和理化损害等。
然而,肝脏对不同刺激的应答相当一致,不论何种病原,急性损害的临床表现是大体近似的。
我国目前发生的急性病毒性肝炎主要是甲型肝炎,污染了甲型肝炎病毒(HAV)的水和食物可引起甲型肝炎的暴发流行。
甲型肝炎发病时没有特征性的生化改变,HAV的感染是以EIA检出IgM抗HAV抗体为诊断依据。
有关HAV感染及临床表现见图1。
戊型肝炎除在新疆南部有流行外,全国许多地区都有散在发生。
戊型肝炎的临床表现与甲型肝炎相似而较轻,黄疸发生率较高,且可后于ALT复常,HEV不引起慢性肝病。
HEV感染的病原诊断以重组克隆表达的蛋白或合成寡肽作为试剂抗原发展的EIA,已可用于临床诊断,但IgM抗HEVM试剂盒有待完善,IgG抗体在感染后又可保持多年,只有除外其它肝炎病毒后才可作出戊型肝炎诊断。
同时检出其它肝炎病毒血清标志物者,不能轻易诊断为与戊型肝炎的混合感染。
三、乙型肝炎实验诊断与临床的关系
(一)急、慢性乙肝的鉴别诊断
乙型肝炎病毒(HBV)感染在我国流行多年后,当前乙型肝炎虽是我国最重要的肝炎,但在急性病毒性肝炎中急性乙型肝炎已远较甲型肝炎和戊型肝炎为少,须谨慎诊断。
经特殊标定的IgM抗HBc试剂盒(AbbottLab,Ⅲ,USA),可鉴别急性和慢性HBV感染;IgM抗HBc(+),即使HBsAg(-),也可诊断急性乙型肝炎;反之,IgM抗HBc(-)的急性乙肝,即使HBsAg(+),却可能是慢性HBV感染重叠其它病原的急性病变。
(二)慢性乙肝与非活动性HBsAg(+)携带的鉴别
长期以来,许多临床医生试图寻求临床表现与病理改变的一致性,从而避免肝穿刺的创伤性检查。
虽临床表现可能是病理改变的反映;然而,肝脏“沉默”的特性,有时因病变活动性较轻而症状轻微,但长期积累肝组织病变却可以很重。
对每一病例的全面诊断应包括:
①病原检测,以鉴别其它病因引起的慢性肝炎和慢性肝病;②测定病毒感染水平;③鉴定病变活动性;④确定病情分度。
按照AASLD2001实践指南,慢性乙肝与非活动性HBsAg(+)携带者的诊断见表7
对慢性乙型肝炎病变的活动性鉴定,除病原检测外,其临床症状、体症、生化反应的实验室种种参数都是非特异性的,并不经常确切反映病变的性质,因而较难以作为鉴别活动性的可靠依据。
若无肝活体组织检查,有时很难明确诊断。
肝穿刺组织学检查是诊断慢性乙型肝炎的有效指标,但有时由于病变分布不均匀,仍不能完全避免误诊。
表8提出一些鉴别的思路可供参考。
鉴别活动性与非活动性主要在于两种的预后不同,判定疾病发展的重要因素是有无融合性坏死或桥接坏死,肝组织无桥接坏死的病例一般不发展为肝硬化或肝衰竭。
乙型肝炎恢复标准(AASLD2001指南):
l有急性或慢性乙肝病史
l抗HBc(+)和/或抗HBs(+)
lHBsAg(-)
lHBVDNA(-)(用敏感的PCR方法有可能检出极低水平HBV DNA)
lALT正常
(三)HBV DNA变异与临床的关系
我国的HBV感染者中约30%HBeAg(+)。
HBeAg(+)者中约80%经无症状的病变活动而HBeAg阴转,感染趋向恢复,这是HBV感染自然史的主流;约10%的HBeAg持续(+),病变反复活动;另约10%虽HBeAg(-),多因表达变异,病变也反复活动。
随着PCR技术的出现及DNA测序技术的完善,乙型肝炎病毒本身的基因结构及其自然变异与临床表现之间的关系得到了越来越广泛的研究。
目前发现,在HBV基因组的各个编码区段存在着大量的有意义的自然变异或药物诱导的变异,并由此产生不同的变异株,从而导致HBV感染的不同血清学及临床表现。
国内目前已建立的荧光PCR变异检测试剂,能对临床标本进行快速、有效地检测,尤其是拉咪夫啶治疗后的YMDD变异。
采用基因芯片技术同时检测多个变异位点的试剂盒也即将问世。
四、丙型肝炎实验诊断与临床的关系
HCV感染的血清学检测较不稳定,主要由于病毒变异及其复制水平低下。
对HCV抗体,应用中证明抗HCV的IgM组份的灵敏性不及IgG,目前常规用EIA检测IgG抗HCV;对检测HCVRNA,因病毒血症水平常很低,需两轮PCR反应(巢式PCR)才能检出,由于反应高度灵敏,必须在严格控制下,结果才能稳定。
在急性丙型肝炎,HCVRNA在ALT升高前即可检出,而抗HCV的出现却较迟;在慢性丙型肝炎,抗HCV和HCVRNA常长时间持续阳性;而ALT却多波动,有长短不一的间隙期,提示病毒血症及其抗体应答,并不经常伴随明显的肝脏病变活动;另外,肝内病毒虽持续存在,病毒血症却可能波动,血清HCVRNA可间隙性出现。
(一)HCVRNA基因分型
近年来,HCV分子生物学的研究进展十分迅速。
对HCV全基因克隆的序列分析,发现来自不同国家地区HCV克隆的核苷酸序列有很大差异。
至今,世界上完成了上百株HCV毒株的全序列分析,被分为十几种不同的基因型,应用较多的为分成6个基因型(Simmonds)或4个亚型(Okamoto)。
但基因型的分类和命名至今尚未统一。
目前用于HCVRNA基因分型相对可靠的方法是线探针杂交分型(INNO-Lipa,比利时Innogenetic)。
将C区HCV基因进行PCR扩增,然后和型特异性核酸探针在硝酸纤维膜杂交,根据反应条带的位置及条带组合结果,可将HCV分成四个基因型若干亚型。
其它的分型方法还有:
全基因序列测定、引物特异性基因分型(Okamoto法)、酶切分型等。
基因分型临床意义:
①了解基因型分布概况,阐明流行病学意义;②探讨HCV的传播途径,特别是对母婴传播的研究有重要意义,同时也有人证明家庭内传播的可能性,但总的传染率不高,而主要传播途径为输血。
③基因分型与抗病毒治疗效果的关系;④基因分型与疫苗研究的关系。
(二)定量核酸检测与抗病毒疗效的评价
由于慢性丙肝的肝脏病变活动并不与ALT水平保持绝对一致的关系,而抗病毒治疗的结果在临床上又存在多种表现,如有效(持续反应)、无效(无反应)、复发和突发等(图-2)。
因此,动态观察HCVRNA水平成为评价、监测抗病毒药物疗效,指导临床合理用药的一个重要指标。
(三)预测抗病毒疗效的多因素分析
对丙型肝炎抗病毒治疗的临床实践证明,治疗效果的好坏除了机体个体差异的因素外,还与HCVRNA水平、基因型及药物剂量大小和疗程长短有关(表9~11)。
综合以上各单因素分析结果,采用Logistic多因素回归分析,发现12个月时,HCVRNA低滴度比高滴度、用药剂量6MU比3MU对病毒清除率有显著差异。
提示影响抗病毒疗效的多项因素中,治疗前的病毒滴度和用药剂量是决定治疗有效与否的较关键指标(表12)。
五、其他可能的肝炎病毒
尽管人们已建立了HAV、HBV、HCV、HDV及HEV的实验室诊断方法,但临床上仍有部分肝炎患者病因无法明确。
因此,有学者推测除现有肝炎病毒外,还存在新的病毒,如HGV、TTV、SANBAN、YONBAN、TLMV以及SEN-V等。
尽管对这些病毒的分子生物学特性以及致病性等方面了解不多,但这些新型病毒与肝炎关系的研究正日益成为国内外学者关注的重点之一。
目前确定HGV感染的主要方法是采用RT-PCR法检测HGVRNA,抗HGV检测假阳性高,应用较少。
对TTV感染的检测目前以PCR扩增TTV DNA为主要诊断方法。
随着分子生物学技术的广泛应用,有学者建议采用以下原则来确定新病原:
①假定的病原序列应出现在大多数所致疾病的病例中;②这种序列主要出现在患者的靶器官;③在健康人体或其器官中假定病原的序列应无或几乎没有;④该序列在病变组织中经过原位杂交(+)和/或电镜下观察到病毒颗粒;⑤以序列为基础的证据应在其他实验室得到重复;⑥随着疾病的恢复,该病毒拷贝数降至检测不到;⑦发病前能检测该序列的时间应为短暂的,和/或序列拷贝数与疾病严重程度相关。
2002-09-10
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