western blot操作步骤.docx

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westernblot操作步骤

westernblot操作步骤

背景：

蛋白质印迹的发明者是斯坦福大学GeorgeStark。

NealBurnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被称为WesternBlot。

最开始做印迹的是一个叫Southern的科学家，但印迹的对象是DNA链，他把这种技术称为Southernblot，后来出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对RNA，一个对蛋白质，人们分别把这两种技术的称为Northern和Western，与这两个技术的发明人没有关系了。

一、蛋白质的样品制备

由于这一步方法各异，具体步骤请参考试剂盒的说明书即可。

蛋白质的样品制备是WesternBlotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题:

>在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

>选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。

尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。

>防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂）。

>样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后保存与-20°或-80℃中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。

>若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了。

除此之外loadingbuffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时也应注意将样品与loadingbuffer混合均匀。

二、蛋白质定量

如果要定量的话，一般选择BCA或者Bradford方法，BCA要求检测波长为562nm，Bradford为595nm。

具体方法见各试剂盒说明书。

为避免假阳性结果，建议先把lysisbuffer加入BCA工作液或考马G250混合看是否产生颜色。

测完蛋白含量后，计算含50~100ug蛋白的溶液体积即为上样量（一般8cm宽的迷你胶每个泳道最大能承载的蛋白质量为150ug，所以如果从组织提取蛋白的话上样量不宜过大）。

网上有人喜欢等质量上样（即每个泳道的上样体积不一但质量一定），也有使用等体积上样（即先把各个样品稀释到某一固定浓度，然后等体积等质量上样，计算上样体积时需包含loadingbuffer的体积）。

按分子克隆的说法，还是使用等体积上样比较好。

上样总体积一般不超过15ul，加样孔的最大限度可加20ul样品。

上样前要将样品置于烧杯内，将烧杯置于石棉网上用酒精灯加热至沸腾，在沸水中煮3~5min使蛋白充分变性。

也可以使用PCR仪95°加热5min，效果佳，操作方便。

之后样品可以在4℃冰箱短时间保存，也可在-20°冰箱保存数月，但是反复冻融会使蛋白质的抗原特性改变。

三、SDS－PAGE电泳

1.清洗玻璃板：

蘸点洗洁精轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

若不继续使用，需用无水乙醇擦拭后晾干再妥善收起来，玻璃板之间垫玻璃纸隔开。

梳子应用水洗干净，临用前用无水乙醇擦拭晾干。

2.灌胶与上样

①玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶（操作前先往玻璃板间灌水，检查是否漏）。

②按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配置，最后加入TEMED，之后摇匀即可灌胶。

配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜，特别是过硫酸铵。

灌胶时掌握好速度，避免气泡产生（注意浓度越小的胶含水越多，凝固后胶体积缩小越多）。

然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。

操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。

加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形）。

未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套防护。

梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡。

注意给积层胶留出足够的空间（分子克隆推荐长度为插入的梳齿长再加1cm）。

③当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。

再等几分钟觉得差不多的时候就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

聚合时间由AP以及TEMED决定，通常在30min左右，AP不新鲜会导致聚合变慢，气温较低时胶是会凝得慢一些，必要时可适当增加AP以及TEMED的量，但通常不会超过1h，若超过1h甚至更长仍未聚合，应检查配制的操作有无错误。

由于TEMED催化APS释放相关化学基团，再由APS释放的基团催化Acr/Bis聚合，所以如果APS不新鲜的话加再多的TEMED效果也不佳，这就是为什么推荐APS每周新鲜配置的原因。

④按说明书配积层胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

插梳子时要使梳子保持水平。

由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固前最好在两边补胶至刚刚冒顶。

待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

⑤趁积层胶聚合的这段时间，取适当体积样本混合1XSDSloadingbuffer（最好事前分装好，每次从冰箱里取一管即可），95~100°加热5min，若有沉淀可用稍低温度，比如45~55°加热1h达到变性的目的。

我一般习惯分装20ul到PCR管里，先和loadingbuffer混合好，临用前用PCR仪加热95°C5min，效果不错。

⑥胶做好后连同玻璃板一起安装到电泳槽上，加入电泳缓冲液后开始准备上样（我们使用的是大连竞迈科技公司的MV-III型小型单垂直板电泳槽，电泳液至少要漫过内测的小玻璃板，电泳槽下面不用倒太多电泳液）。

加样前可用5ml注射器或加样器先冲洗一下加样孔。

用微量加样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。

将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。

加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。

目前我们做的mini胶上有10个上样孔，一般在第一个孔加入marker（我用的是Fermentas预染marker），其余9个孔加入样品，也可在头尾孔内加入marker，中间8个孔加样品。

加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品。

在未加样的孔中应加入等量的样品缓冲液。

上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。

也可使用10ul的枪头就行，比用微量加样器快很多，用枪头时注意不要插得太深，容易把玻璃板撑开，样品就落到胶和玻璃板之间的空隙了。

3.电泳

电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺，网上有资料建议低电压短时间的预电泳，清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通，但是在《分子克隆》上却反对这种做法，理由是会破坏缓冲系统pH的不连续性。

请各位按照实际经验来做即可。

电泳时间和电压说法各异。

按照各实验室的惯例或者电泳槽的使用说明来操作。

电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应直接或者转印。

四、转膜

我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。

对于转印90kd以下的蛋白，转膜液都不用加SDS，如果是蛋白分子量大的话可以加入0.037%的SDS。

1.在电泳结束前20min开始准备转膜所需的东西。

转一张膜需准备6张的滤纸（长一般为8.1~8.3cm，宽度根据裁的胶大小实际测量，但胶一般会缩水，所以裁8cm就行）和1张PVDF膜。

切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。

PVDF膜使用前用无水甲醇中浸泡1min~2min。

目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

2.将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。

撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲，效果出奇的好）。

除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。

也可取10ml注射器吸满转印缓冲液，往玻璃板与凝胶之间注水，使液体的压力将两者自然分开。

取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。

之后有两种方法供选择，一是按照marker指示，把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来，二是把整张胶转膜，前一种方法更加节约材料，但操作稍微麻烦了一点。

在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的PVDF膜和滤纸，平衡10min左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的SDS。

3.带上手套，平放转移槽的底座，依次在石墨电极上叠放3张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF膜（此时可在PVDF右上角减去一个角，以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面）、刚刚完成电泳的凝胶和另外3张浸泡过缓冲液的滤纸。

用枪头或移液管在叠层的滤纸上滚动，除去气泡。

注意每叠一层就要用玻璃棒或圆筒试管赶去气泡，因为一个气泡的厚度对于蛋白来说都是十万八千里的。

用干净纱布将叠层上面和周围的多余缓冲液吸干（这一步很重要，宁可太干也不能太湿，太干容易烧胡，太湿的话多余的缓冲液会导致电流短路，大大降低转移效率，如果同时转好几条胶的时候更要小心，有一个胶短路就会影响整体的转移效率）。

最后将转移槽的上盖扣上，接通电源开始转膜。

由于设备昂贵，第一次操作应向熟手请教，否则短路可能烧坏设备！

转完后立即清洗设备，特别是金属上盖，转膜液特别容易在金属上盖上形成结痂，影响设备的正常使用，我们实验室今年做western的同志因为忽略这一点，转膜仪烧坏了好几次。

4.依据分子量大小电泳15~60min。

如果初次转膜，可以根据一般经验，即多少kD的蛋白就转多少分钟，再根据结果调整时间。

之后断开电源，取出转移膜进行后继实验。

5.为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染。

传统方法是将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。

然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。

实际上更常用且简便的方法是先将膜晾干，然后浸入20%的甲醇，待完全浸湿后取出透光观察即可看到蛋白条带（此方法仅仅适合PVDF膜）。

将膜晾干备用。

使用预染marker话可以看见marker的颜色转印到了膜上，但是凭借这个颜色来判断是否转印完全或转印过头是不可靠的。

五、免疫杂交反应

1.将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h即可。

如果是自己配置的封闭液，最好过滤一下以消除固体杂质。

实际经验表明与其封闭过夜，不如一抗孵育过夜，具体原因可以参考这个帖子：

2.将一抗用封闭液稀释（一般用封闭液稀释即可，如果背景不高用TBST稀释也可以，当然熟练后还可以自由发挥，配制一些自己的复方稀释液）至适当浓度（可以在1.5mlEP管中配置工作液，常用稀释倍数为1:

200，1:

500，1:

1000，具体需要预实验进行摸索，用后可回收重复用2~3次，但回收重复利用的效果如何就要看抗体的质量，分装的抗体不推荐回收。

稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡（也可使用手术室的病理袋，质量不错，减去下面的折叠部分，用封口器（40~80元一个）封上，不漏液即可）。

37°孵育1h之后转移到室温下再孵育1h（或者4°孵育过夜），用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。

也可以多洗几次，比如4次，每次5min。

3.在培养皿内加入二抗稀释液（10ml足够了，一般1:

1000甚至1:

10000用TBST稀释），放在摇床上，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。

选择好一个合适的条件不要轻易改变，另外相比一抗，二抗作用的时间应严格控制，实践证明一抗时间长点可能没什么关系，而二抗时间若过长过短都将会直接影响结果。

二抗孵育之后还要注意好好洗涤，否则显影是背景可能脏。

六、化学发光（ECL），显影，定影

1.现在工作台上铺一张保鲜膜，将PVDF膜放在保鲜膜上。

将ECL的A和B两种试剂在EP管内等体积混合（注意吸完A试剂后吸B试剂前要患枪头），然后均匀滴在PVDF膜的蛋白面，反应1~2min后，将PVDF膜上多余的ECL工作液吸干，之后转移到在X片夹中预先铺好的保鲜膜上一侧，把另一侧翻过来盖在其上。

用透明胶把保鲜膜固定在片夹上。

2.在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min到2min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果（也有人重叠压好几张片，固定曝光5~10分钟，从这好几张片中选出最合适的底片）；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。

显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干（注意：

显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响）。

X光片一般选用柯达原装的生物实验专用柯达X-OMATBT胶片。

显影液和定影液最好每周配置一次，避光室温保存，显影和定影液是最便宜的试剂了，千万不要因为它而影响了整个结果。

七、凝胶图象分析

将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值，比如bio-rad的QuantityOne。

如何使用请看这里

主要参考资料

1、WB实战指南+正确使用QuantityOne定量byjacqueslm2001

2、Abcam的western新手指南

3、土豆网的westernblot视频上海交大出品

4、《分子克隆实验指南》精编版化学工业出版社

5、《抗体技术实验指南》科学技术出版社

6、milipore的westernblot的优化方案

7、Westernblot步步看（网络流传最广的资料）作者不详

8、Bio-rad蛋白印迹手册

9、穷人的劳斯莱斯-我的五年westernblot体会byseagate

附：

WesternBlotQuickGuide（以及Western的时间规划）

前期准备：

蛋白已经定量，各样本已经稀释到某固定浓度，已经和SDSloadingbuffer混合，已经分装好，保存与-20°。

头天下午或晚上配胶，分离胶和浓缩胶一起配好，带上梳子，放入潮湿的自封袋内放入4°冰箱备用。

8:

00从冰箱里取出蛋白样品，用PCR仪95度加热5min。

混合均匀并离心。

8:

30取出昨晚配好的胶，组合，加电泳液。

在电泳液里拔梳子能稍微容易一些。

用10ul的枪加样。

9:

00开始电泳。

恒流30mA一般1个小时足够了。

9:

30开始准备转膜用的滤纸和PVDF膜，PVDF膜泡甲醇。

一般8cm的宽是固定的，所以如果要裁胶的话可以先大概估计一下。

10:

10电泳结束（假设电泳用了70分钟），起开玻璃板，裁出胶上所要的条带，如果整块胶转就更方便了。

把胶放在盛有转膜缓冲液的培养皿里。

11:

00转膜开始（这里裁纸和铺三明治还是比较费时间的，我一般要用30分钟到50min，所以这里要抓紧时间）。

12:

00转膜结束（这里按60min的半干转的时间来计算）。

开始封闭1h。

13:

00封闭结束，开始孵育一抗（在这里你可以选择一抗孵育过夜，如果不过夜的那一天就能结束），如果不过夜的话我一般选择37°1h然后在室温（23°左右）再1h。

15:

00一抗孵育结束。

TBST洗涤3*10min或者5*6min。

15:

30开始孵育二抗。

室温1h足够了。

16:

30二抗孵育结束。

TBST洗涤3*10min或者5*6min，这里推荐采用5*6min。

17:

00ECL发光，压片10min，显影1min，定影10min，那么在18:

00之前你就能看到结果了，呵呵，如果结果不好还有后招，用stripping（一抗二抗洗脱液）洗涤，我用的是碧云天的碱性一抗二抗洗脱液，按照说明书来一般20min就行，然后洗涤几次，重新封闭1h，然后一抗过夜，明日在继续战斗。

这样的话18:

30之前也能结束战斗了。

附：

我的五年westernblot体会

1.抗体的选择

对于国内的大多数实验室来讲，做westernblot实验选择抗体是个头疼的问题。

原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。

在这五年的westernblot实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。

进口抗体一般不会出现闪失：

abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的价最贵；比较有性价比的是CST的抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种，1:

1000的稀释比下，还没有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和westernblot实验，还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。

Santa的多克隆抗体质量可以，但是选用Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。

进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是抗体大多只能用一次。

我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对（抗体品种，货号等完全一致），在都能做出来的前提下，原装抗体能重复使用的次数要多出许多。

具体原因我已经揣测了好几年，不敢说出来，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖，也会有所不同。

揣测归揣测，假如只为了发论文毕业走人，可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。

国产抗体比较知名的就几家，但质量确实不敢恭维。

westernblot能做出来的确实不多，而且杂带多，背景不干净。

我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化，怎么说呢，应付硕士论文够了。

我也帮别人自制过抗体，再用抗原亲和纯化。

效价非常不错，夸张的时候1：

10000都能做出条带，唯一的麻烦是兔子太骚（骚臭），不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。

如果读书非常悠闲，老板又特别想拥有手工作坊的情况下，可以自己伺候折腾兔子来玩玩，刚开始的时候还是蛮有成就感的。

只是单凭抗原表达和制备多抗，是不是可以写成论文毕业，估计因校而异了。

2.WesternBlot设备

目前最好的垂直槽和转移槽还是Biorad（伯乐），尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶，但通常用不上，由此造成垂直缓冲液的浪费，而且MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽，容易漏液，塑料夹应该是有疲劳寿命的，估计日子一长，弹性就会改变，所以如果你们实验室刚买了MINI4，赶紧用，遭殃的肯定是某一级的师弟师妹们。

Biorad的一套系统得两万多，西部能玩得起伯乐的还真不多。

好在咱中国人聪明，上海天能的外观和构造和伯乐的MINI3几乎一模一样，而且可以通用，不带电泳仪是5千多一套，挺好用的。

唯一的不足是塑料寿命不如伯乐，胶架容易断裂。

不过仔细算算，三套天能也就是一套伯乐的价格，值了。

北京六一的垂直槽很转移槽很好用，但垂直槽配胶不方便，玻板太厚，散热不好，但能用，六一的电泳仪（电源）还是很好用的。

3.WesternBlot实验条件

WesternBlot实验条件我基本是按ABCAM公司经典教材做的，按以下的网址下载下来就可以了（的SM1811,2微升就很清晰了，兰州的代理是上海生工。

要强调的是垂直电泳缓冲液千万不能回收用，具体愿因你只需上网查查SDS-PAGE的原理就知道了。

转移电泳缓冲液可以回收再用两次。

转膜我通常是快转两百200毫安/2小时，慢转80毫安/12小时。

快转是一定得做冰水浴，就是把槽子泡在冰水混合液里。

封闭我通常用BD的脱脂奶粉，不归，260元500克，也是从北京华美买的。

ECL我用pierce的，500毫升1650元，比国产的还便宜好用。

胶片是柯达的，以前用过乐凯的，不如柯达。

我很少用丽春红或考马斯染膜或染胶，总觉得是脱裤子***的事。

4.WesternBlot实验关键

WesternBlot操作步骤多，每一步的失误都会造成全盘失败，综合而言，抗体仍然是决定成败的关键，如果抗体很滥，就是神仙也没招。

其中内参抗体很重要，因为内参抗体的选择关系到全盘实验的考评。

Actin，Tubulin，GAPDH我都用过，Actin，Tubulin的缺点是有时候会出现复带，比较稳定的还是GAPDH。

如果用心看看cell，nature，science上的文章，大多用GAPDH做内参。

进口的，国内分装的，国产的，我都用过。

进口的最强的1:

10000都能做出条带（Upstate，现在被Minipore招安了），国内分装的也好用，但就是不好回收重复使用，国产的一般只能用一次。

我要特别强调的是，实验室里最贵的抗体实际上是内参抗体，因为只要WesternBlot开工，每次都得用内参抗体，而一般目的蛋白的抗体也就用几次，重复三次就了事。

但内参抗体是不折不扣的耗材，严格意义上将，每跑一次胶，就得杂一次内参，使用频率最高决定了内参是最花钱的抗体。

我也自己制备过内参抗体，但好像因为种属同源性太高，背景总是不干净。

进口的好，太贵；国产的只能使用一次，年终算账，不比进口的便宜。

我自己的体会是多抗制备并不是技术含量极高的事，为什么国内企业高的早不了，低的造不好呢？

现在我用的是杭州贤至的GAPDH兔多抗，200微升420元钱，我在蛋白上样量12微升/孔的情况下，按1:

2000稀释比，条带非常清晰，没有杂带，是我目前用过的最好的国产抗体，我估计按1:

4000照样能做出来，因为按按1:

2000稀释做，在暗室里