Shawkea T1各种检测报告.docx

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ShawkeaT1各种检测报告

2.ShawkeaT-1使小白鼠的生殖激素增加，并增加了中年白鼠的排卵数

日本生殖医学学会报刊57卷4号2012年

株式会社德润医药研究所邵辉野崎利晃；大阪市立大学妇产科本田谦一

【目的】

使用ShawkeaT-1（DT-1E）对小白鼠进行6周的用药后，发现使用DT-1E的一组要比注射促性腺激素的一组，在子宫的ERα,ERβ,及PRmRAN以及卵巢的FSHRmPNA的数量上要明显高于后者。

即使从免疫分析的结果来看，也显示DT-1E上述的受容体值升高。

对中年的白鼠经口投药后确认到输卵管内卵子数量的增加。

本次的试验也表明对有生殖激素障碍的临床治疗上，DT-1E有可以运用的可能性。

【方法】

用电离子对ShawkeaT-1进行分离后，再进行分子过滤。

使用10周大的小白鼠，分成对照组和DT-1E组各2组，对其中的任意一组使用用绒毛膜促性腺激素5IU的灭菌水0.1毫升，进行腹腔内注射。

【结果】

注射促性腺激素后，白鼠子宫内的ERα,ERβ,及PRmRAN的数值来看。

DT-1E要比对照组有明显优势。

使用ERα,ERβ,以及PR,FSHR的抗体对白鼠的子宫上皮细胞以及子宫间质细胞进行的免疫组织化学染色试验表明，DT-1E组的卵子数量也多于对照组。

【结论】

DT-1E可以促使一连串生殖激素受体的增加。

据此结果认为其有可增进对激素的应变及感受能力的可能性。

因其可以增强排卵机能，所以DT-1E对于排卵机能不全者，有使用的价值。

本次结论是DT-1E对有生殖激素障碍的临床治疗上，有可以运用的可能性。

【结论】

ShawkeaT-1在以前的研究中表明，其可以增加成年白鼠的生殖激素受体数量。

在本次使用中年的白鼠相当于人类的40岁作为试验对象，确认到ShawkeaT-1增加了生殖激素受体和排卵的数量。

基于此证明ShawkeaT-1对于40岁以上的使用者，可以增强其卵巢机能以及排卵能力。

3.ShawkeaT-1可以活化下丘脑和脑下垂体的机能以及促进和增加排卵的作用

中国天津第5届国际医药大会2008年

神户东洋医疗学院邵辉小林里佳早川敏弘工藤妇产医院工藤卓天津中医药大学高秀梅

宋新波产业医科大学柳原延章

【主题】

一直以来中国和德国在妇产科领域经常会使用到蒲公英，特别是对卵巢机能不全、不孕症、更年期障碍等等的临床治疗上的使用。

西医认为其对下丘脑、脑下垂体、性腺的内分泌学上有密不可分的关系。

备孕期女性在服用前和服用3个月后对各项激素的变化进行的测试结果表明，多数患者都有脑内分泌的激素有上升，泌乳素下降、雌激素和孕酮升高的趋势。

另外表明对痛经、体寒有明显的改善趋势。

通过使用雌性小白鼠检验使用ShawkeaT-1对促进排卵的效果以及对下丘脑-下垂体-性腺器官的影响，并加上了以LH-RH（促黄体激素释放激素）的分泌为中心的观察。

观察到脑神经传达物质、烟碱受体、下丘脑内LH-RH的增加。

推测为由下丘脑对上位中枢作用的效果。

所以推测ShawkeaT-1可以活化以下丘脑、下垂体为中心的排卵技能。

另外由于活化下丘脑-下垂体，确认到也活化了神经传达物质。

【实际实验及结果】

本次通过对在排卵障碍、不孕症真的治疗上经常被使用的从蒲公英中提取的T-1成分为主，在其作用机序上加上对内分泌方面的研讨，从LH-RH的分泌观点上，验证了其对排卵以及中枢有效果。

【对性激素的影响】

对正处在生殖期的58位女性，每天服用36mg蒲公英T-1，3个月后与服用前在周期内的FSH值、E2值、P值的变化情况进行了检测。

【结果】

检测项目

58人中上升的人数（人）

上升率

促卵泡生成素（FSH）

30

51.7%

促黄体生成素（LH）

36

62.1%

雌激素（E2）

43

74.1%

孕酮（P）

21

36.2%

【调查结论】

在FSH值的变化中，58人中有30人（51.7%）的值出现上升。

LH值的变化中，58人中有36人（62.1%）的值出现上升。

雌激素值得变化中，58人中有43人（74.1%）的值出现上升。

孕酮值的变化中，58人中有43人（36.2%）的值出现上升。

另外在58人中有55人（94.8%）的痛经、体寒等症状得到了改善。

对上述症状严重的患者的改善效果明显。

这是因为其改善末梢循环的结果。

【雌激素（E2）和孕酮（P）的变化】

下图是服用蒲公英T-1口服液的43人，服用前和服用3个月后E2和P值的变化。

E2（pg/ml）

P（ng/ml）

服用前

75

15.5

服用后

111

20.7

实验证明43人的雌激素平均升高了36pg/ml，21人的孕酮平均升高了5.2ng/ml.

【调查结论】

性激素的分泌量升高并不仅仅是因为脑下垂体的命令，也是因为卵巢和卵泡的感受性上升以及由卵泡的激素分泌能力上升所致。

【蒲公英T-1口服液对脑下垂体分泌的FSH/LH的改善】

对老鼠进行每公斤体重36mg用量的蒲公英T-1口服液连续投用，确认到脑下垂体分泌的LH、FSH在出生29天发生变化。

对血中LH的对照中，没有使用T-1的为0.75ng/ml，使用的为1.10.75ng/ml.另外血液中FSH的变化中，未使用的仅为1.1ng/ml，使用的达到5ng/ml。

所以两个激素值都得到了明显的改善。

【调查结论】

根据上述实验可以得出T-1可以促进老鼠的排卵.作用于下丘脑-脑下垂体，增加LH-RH、LH、FSH的分泌。

【下丘脑、脑下垂体机能的活性化】

实验表明T-1对幼鼠的排卵有效果。

使用出生38天在自然周期内可以确认排卵的幼鼠，分成3组，分别是出生后25-31天仅仅使用T-1，连续使用一周；出生25-31天使用T-1和HMG,连续使用一周；只使用HMG.对每组的排卵进行观察。

实验发现排卵比例为54%；的排卵比例为89%；的排卵比例为65%。

【对排卵的影响】

文献资料显示蒲公英对从年轻人到老年人之间存在的卵巢机能不全、不孕症、更年期障碍、先兆流产等的妇科领域被广泛应用。

其适用于卵巢机能不全、无月经、无排卵周期、黄体功能不全的临床治疗上。

蒲公英通过作用于下丘脑-脑下垂体、以及下丘脑的促卵泡和促黄体的分泌，唤醒卵巢活力。

【结果】

排卵率上升。

对幼鼠进行每公斤体重36mg用量的蒲公英T-1口服液连续投用，在显微镜下观察两段输卵管中卵子的数量，观察发现与不服用的对照组相比，使用T-1的一组排卵数增加了20%。

【调查】

上述事实揭示T-1可以直接或间接的增强下丘脑以及脑下垂体的活性。

【总结】

脑下垂体分泌刺激卵巢的FSH和LH，因为在血液中检测到其浓度的上升，所以可以判断为是使用的T-1作用在了脑下垂体。

也就是说通过促进刺激卵巢，从而促进卵泡的成长。

此外因为T-1不含激素类成分，所以不需要担心FSH值过度升高。

【对神经传达物质的影响】

实验1

实验表明T-1有促进卵巢排卵的效果，同时其对脑细胞有怎样的影响也进行了调查。

对小白鼠使用T-1，对其出生后第29天脑内的NE、DA、SR进行了检测。

检测表明使用的一组的NE是对照组的7.2倍，DA为6.8倍，呈现明显的增长。

SR仅增加0.15倍。

（表1）

实验2

对出生第29天、32天的老鼠脑内的nACHR进行了检测。

检测第29天使用T-1的一组是对照组的2倍，第32天是对照组的2.7倍。

对nACHR一旦使用尼古丁，对其产生影响的物质效果会迅速增强，所以连续3天在皮下使用尼古丁，之后对出生第29天和第32天的老鼠脑内的nACHR进行了检测。

实验表明出生第29天和第32天的使用T-1和尼古丁的一组要比其他组有显著的增加。

第29天的是对照组的4.7倍，32天的为对照组的3.9倍。

鉴于由于使用尼古丁，从而使T-1的效果大幅度增强，所以表明T-1作用于nACHR。

（表2）

（表1）T-1对排卵的促进效果

项目

NE（ng/mg）组织

DA（ng/mg）组织

SR（ng/mg）组织

对照组

56

15

178

T-1使用组

403.2

101.67

204.6

（表2）老鼠脑内的nACHR含量

29日龄

32日龄

对照组

145

187

T-1使用组

290

504.6

尼古丁对照组

190

196

T-1+尼古丁

681.7

729.2

实验3

本实验是通过T-1的离子通道，采用副肾髓质培养细胞作为交感神经系的实验载体，检测其对CA的生成合成、分泌、以及影响。

【结论】

通过实验得出T-1可以提升脑内激素的分泌量的同时降低泌乳素的分泌。

另外也可以确认到其有雌激素以及孕酮值的倾向。

在动物试验中确认到其有促进排卵的作用。

因确认到下丘脑内的LH-RH，以及脑下垂体被的LH、FSH的增加，可以认定T-1作用于下丘脑-脑下垂体一线。

另外用为检测到神经传达物质、NE、DA、SR的增加，上述物质与痴呆有症息息相关联系，所以T-1的药用价值多样化很值得期待。

【调查结论】

T-1可以促进CA的合成、分泌。

实验揭示T-1通过促进在脑、交感神经、副肾髓质的儿茶酚胺的分泌、合成，从而使中枢神经系统兴奋，末梢的交感神经亢奋。

4.蒲公英T-1对不孕治疗的意义

健康科学关西2004第4届学术大会讲集

德润有限会社野崎利晃，神户东洋医疗学院邵辉

【目的】

T-1中主要为成分为蒲公英，现在已将其作为清凉饮料进行产品化推广。

因为使用的主要成分为蒲公英的叶子（利尿药），所以通过减少体内的水分达到改善高血压的效果。

另外据报道其对治疗肺炎、支气管炎、上呼吸道感染、抗病毒、促进脑下垂体的LH-RH有效。

特别是对其治疗不孕症有的改善效果，被多家报道。

对脑内神经传达物质的变化进行了测试。

本次我们为特定T-1在脑内的作用机序，采用副肾髓质培养细胞作为交感神经系的实验载体，对神经键间的nAChR的变化、CA的生成合成、分泌、以及影响进行了测试。

另外报告指出T-1可以缓解精神上的压力从而改善不孕症以及过敏性皮肤病。

压力、精神上的兴奋可以让CA在中枢以及末梢的交感神经和副肾髓质里合成和分泌。

所以推测T-1在此过程中应该起着什么重要的作用。

【结果】

从下图可以看出，出生29天和32天的小白鼠使用T-1和尼古丁的一组要比其他单独使用一种的群组相比脑内的nAChR显著增加、29天的为对照组的4.7倍、32天的为对照组的3.9倍。

由于尼古丁的使用T-1的效果增大，所以可以断定T-1的作用对象为nAChR。

出生后29天

出生后32天

对照组

145（fMmg）

187（fMmg）

仅使用T-1组

290（fMmg）

504.6（fMmg）

仅使用尼古丁组

190（fMmg）

196（fMmg）

使用T-1和尼古丁组

681.7（fMmg）

729.2（fMmg）

【调查】

因为压力的原因，引起从大脑皮层到下丘脑、脑下垂体的神经传达异常。

本次实验是除了其对性激素的促进作用外，期待通过改善受体低下和促进多巴胺的合成从而达到治疗不孕症的目的。

实验确认T-1通过促进在脑、交感神经、副肾髓质的儿茶酚胺的分泌、合成，从而使中枢神经系统兴奋，末梢的交感神经亢奋。

实验显示T-1对高泌乳素症、帕金森症有利尿作用，认为正是因为T-1促进了多巴胺的生成所产生的。

可以认为今后T-1通过促进对副肾髓质CA的的生成，从而达到促进肾动脉血流的目的。

另外因为其有利尿功效，所以对泌尿器官疾病的临床治疗应用的巨大潜力。

另外对被认为是忧郁症的受体感受性低下、神经物质的合成分泌低下的改善作用有巨大的潜力。

【调查结论】

接受不孕治疗的患者，在配合使用T-1后因使用促排卵药物产生的负面情绪减少、高温期的体温升高、持久，排卵数量也随之增加的好评如潮。

月经周期

对促排卵药物的负面情绪

高温期的体温

排卵数量

使用T-1的患者（12人）

趋向规则

减少

平均体温上升0.15度，高温期延长0.76天

增加

未使用患者（3人）

推迟

非常强烈

减少

【医师的反映情况】

改善了卵子的质量增加了卵子的数量。

根据神琦妇产科医院、西山妇产科医院、汉方野崎药店等汇总的34名患者中，使用T-1的患者获得的卵子等级高，数量多。

以往的治疗方法

配合服用T-1

治疗时间

18个月

14个月

排卵周期

10个月

8个月

妊娠率（%）

50%

70%

通过对使用以往治疗方法（12人）和配合使用T-1治疗的32人对比发现，后者的治疗时间和排卵周期分比缩短了4个月和2个月，怀孕率却提高了20%。

（摘自一般经营性社团宝宝顾问集）。

5.T-1蒲公英提取物增加老鼠生殖激素受体数量

大阪市立大学院医学研究科妇产科科学讲堂

【摘录】

生殖激素通过各类组织中的受体来发挥其作用。

本次论文主要是调查了使用T-1蒲公英提取物（DT-1E）6周后的老鼠，其脂肪组织生殖器官的雌激素受体（ERα及ERβ）、孕酮受体（PR）以及促卵泡生成激素受体（FSHR）的变化。

使用实时荧光定量PCR（聚合酶链式反应）分析的结果显示使用含有DT-1E的饲料对老鼠进行喂养后，其脂肪细胞中ERα及ERβmRNA的发现量要高于对照组。

另外注射绒毛膜促性腺激素后，使用DT-1E一组在ERα及ERβmRNA还有卵巢FSHRmRNA的等级要高于对照组。

对免疫组织进行的化学分析也显示DT-1E组的受体等级明显上升。

从本次的实验表明口服DT-1E，老鼠本身的ERα及ERβmRNA还有卵巢FSHRmRNA等级升高，同时揭示了其对生殖激素障碍的临床治疗上有利用的可能性。

关键词：

雌激素受体ERα、雌激素受体ERβ、孕酮受体、促卵泡生成激素受体、T-1蒲公英提取物、老鼠

【介绍】

雌激素、孕酮、以及促卵泡生成素等生殖类激素和各种生物化学、生理学的过程有着密不可分的关系，所以其可导致女性中的包括更年期症状、肥胖、各种癌变等各种病症。

通常是通过调整激素值来治疗因激素值引起的各类病症。

比如说使用激素补充疗法（HRT）虽然可以减轻更年期症状，但是同时也有对其产生依赖的风险。

另外因为激素都是通过受体发挥其作用的，所以大可以通过查明受体来了解有激素引起的各类病症。

本方法可以替代激素补充治疗法，对开发更加方便，副作用风险更小的治疗法有所帮助。

今年来因为汉方药逐渐开始普及、疗效理想的同时副作用小，所以广被使用。

虽然现在对其的作用机序还不是很明了，但是汉方药广泛使用在由女性的生殖激素导致的各类病变上。

所以我们假设汉方药关乎于生殖激素的量以及对受体等级的影响。

基于以上观点，本次的实验使用含有DT-1E的饲料对雌鼠进行6周的喂养后，对其血清中激素的浓度变化、脂肪组织、子宫、以及卵巢的雌激素受体（ERα及ERβ）、孕酮受体（PR）以及促卵泡生成激素受体（FSHR）的等级以及对排卵的影响做了调查了。

材料及方法

动物和饲料

本实验的环境以及使用的动物均按照大阪市立大学动物实验基准进行、且得到校内动物实验委员会认可的。

试验用36只4周龄的雌鼠为从横滨的专业机构购买，将其任意分为4组（每组9只）后放入容器，保持固定的温度（23±1）和湿度（55%）,昼夜12小时/12小时进行单独喂养。

6周的饲养时间段内，雌鼠可以自由摄取饲料和水。

对其中的2组对照组投用不含有植物性雌激素的普通饲料，，对剩余2组投用DT-1E含量为0.03%的饲料。

DT-1E的成分为87%的蒲公英提取物，5%的薏米、5%的蔗糖、3%的黑蚂蚁。

对对照组和DT-1E组的其中各一组的雌鼠，在达到10周龄时注射绒毛膜促性腺激素。

先将稀释在0.1毫升杀菌用生理盐水的孕马血清注入到各雌鼠体内5IU，46小时后再将用0.1毫升杀菌用生理盐水稀释的绒毛膜促性腺激素5IU，注入到雌鼠体内。

注射后12小时，将包括另外两组在内的4组实施安乐死。

之后进行解刨，取出子宫旁脂肪组织、子宫以及卵巢。

测定血清中的激素浓度

在解刨雌鼠的过程中，对腹部大动脉进行血样采集，使用从美国加州专门的医疗机构购买的器械采用放射免疫测定法对血清中的雌激素浓度进行了检测。

检出值的上限为1.4pg/ml、检测期间的变动值分别为1.75%和2.58%。

提取核糖核酸、反转录、实时荧光定量PCR

使用另一种购自美国加州的设备根据其说明书提取出脂肪细胞、子宫以及卵巢内的核糖核酸（RNA）。

之后在-80℃的环境下保存至下一步处理工序。

第二阶段进行实时荧光定量聚合酶链式反应，测定出mRNB值。

使用TaqMan反转录实验药品在cDNA上对保存的核糖核酸（RNA）进行反转录。

基于TaqMamGoldRT-PCR的规定，将调制的反转录酶反应混合液1ul加入到核糖核酸（RNA）样品中，最终容量达到100ul.反转录的反应温度和时间分别是25℃，10分钟、37℃，60分钟、95℃，10分钟。

TaqMan量化实时PCR是用ABISM7700持续探测系统（均按照生产商的操作说明）在50-μl混合物中进行，使用适当的3'-6-羧基标记的小沟粘结剂的引物和探针为cDNA对ERα（Mm00433153_m1）,ERßMm00599821_m1）,PR（Mm00435628_m1）,andFSHR（Mm00442819_m1）（AppliedBiosystems）编码.虽然寡居核苷酸不是公认的最合适的，但是他们是被生产商确认有效的。

mRNA转录产物数量值是按照相对CT（ΔΔCT）法进行操作的。

符合内源参数标准-18SrRNA（美国应用生物系统公司）及于校准器有关的目标值是通过估算2-ΔΔCT（11-13）得出的，其相关公式是ΔΔCT=ΔCT,s-ΔCT,cb。

CT是一种ABIPRISM7700持续探测软件给出的作为参数的数值，其与反应系统中的内在的mRNA原始数值有负关联。

ΔCT是指目标值和参数值之间的循环阈值的不同。

ΔCT,s是样品的ΔCT值。

ΔCT,cb是校准器的ΔCT值（控制组的中线）。

脂肪组织中和生殖器官的免疫组织化学。

为了ERα,ERßPR和FSHR的免疫组织化学研究，我们去掉了小鼠脂肪组织，子宫和卵巢中的石蜡包埋部分（4-μm厚）的石蜡包埋切片脂肪组织。

抗原修复程序侵泡在柠檬酸缓冲液（pH6.0）中进行，并持续15分钟在110˚高压消毒锅中高温加热。

经过磷酸盐生理缓冲液中（PBS）清洗后，组织部分和5%山羊血清一起在含有0.05%Tween-20的容器中封锁十分钟。

我们把每个载玻片和抗小鼠ERα，抗小鼠ERß，抗小鼠PR或者抗小鼠FSHR，兔血清在夜晚4˚温度的环境里进行培养。

经过在含有0.05%Tween-20的PBS中清洗后，为了得到ERαandERß值，组织部分和rhodamine-conjugatedanti-rabbitIgGdonkeyantibody（ChemiconInternational,Inc.,Temecula,CA,USA）在室温环境下培养1个小时，同时为了PRandFSHR，组织部分和fluoresceinisothiocyanate（FITC）-conjugatedanti-rabbitIgGgoatantibody（SouthernBiotech,Birmingham,AL,USA）也在相同环境下培养。

然后再次在含有10%PBS的甘油溶液中清洗，这样通过荧光显微镜就能发现免疫荧光图像。

体积计算。

注射hCG12小时后从小鼠切除的输卵管中收集卵子。

卵子数量通过使用立体显微镜（SZX-ZB12;OlympusCorporation）来计算。

统计：

各组之间区别使用5.0版本StatView并通过非参数统计分析来进行比较。

P<0.05被认为是统计学的象征。

数据分析的结果通过box-plots图表展现出来,50%的数据被总结在这个图表上。

每个图表上的线代表了中值，图表外的线代表了90%信赖区间。

【结果】

血清雌激素浓度。

经过检查小鼠血清中雌激素浓度，注射或者不注射促性腺激素，DT-1E组和另外两组之间没有发现明显区别。

对于那些没有注射促性腺激素的小鼠来说，在控制组的小鼠的雌二酮浓度是9.3±1.8pg/ml，食用DT-1E小组中小鼠的雌激素浓度是10.8±2.5pg/ml。

经过注射促性腺激素后，控制组的小鼠雌二酮浓度是12.3±6.5pg/ml，DT-1E组的小鼠雌二酮浓度是12.4±4.4pg/ml。

脂肪组织和子宫中的ERα和ERßRNA量化分析。

我们对投用普通食物没有注射促性腺激素的雌鼠子宫和脂肪组织使用TaqManreal-timeRT-PCR检测ERα和ERßRNA值。

从TaqMan商业试剂的功效成一贯性上可以表明小鼠脂肪组织和子宫中ERamRNA值比ERa高许多。

脂肪组织中ERa和ERß的表现情况。

通过量化实时RT-PCR（P<0.05）（图.2），对于没有注射促性腺激素的小鼠脂肪组织中的ERα和ERßRNA检测后发现，DT-1E组明显高于对照组（无DT-1E）.DT-1E组的ERs的免疫荧光比对照组（图.5A和C）更明显。

子宫中的ERα,ERß和PR的表现情况。

对于没有注射促性腺激素的两组，ERα,ERßorPRmRNA值没有很明显的区别。

然而，经过注射促性腺激素后，DT-1E组的子宫ERα,ERß和PRmRNA表达值明显高于控制组（不食用DT-1E）（P<0.05）（图.3）。

而且对ERα,ERß和PRmRNA抗体注射促性腺激素的雌鼠的子宫上皮组织子宫间质细胞免疫组织实验可以看出DT-1E组（图6B、D和F）要明显强于对照组（图6A、C和E）.

各组小鼠卵巢FSHR的表现情况比较。

在没有注射促性腺激素的的雌鼠中，DT-1E组和对照组的雌鼠卵巢中FSHR、mRNA表现值没有明显区别。

然而，经过注射促性腺激素后，DT-1E组的卵巢FSHR、mRNA表现值明显高于对照组（不食用DT-1E）（P<0.01）（图.4）。

注射促性腺激素的雌鼠卵巢颗粒细胞FSHR的免疫荧光，与对照组（图.7A）相比，DT-1E组（图.7B）更明显。

注射促性腺激素后雌鼠体内的卵子数量。

进行注射促性腺激素后，我们在解剖过程中，取出了雌鼠的输卵管，并计算了卵子数量。

数据表明DT-1E组（中间值7）比对照组（中间值5）（P<0.05）存在有更多的卵子。

图一

投用普通饲料的雌鼠（未注射促性腺激素），的脂肪组织及子宫中的ERa和ERbmRNA的表现情况。

实线代表阈值。

X-轴线代表循环阈值。

循环阈值是指，CT就是当PCR产品达到阈值的时候，循环增幅的值。

ERa表现为小的循环阈值，和ERb相比，无论是脂肪组织（A）中还是子宫（B）中，ERa显示出更多的mRNA。

右边方框中表现了与ΔΔCT中等的ERa和ERbmRNA数值。

图二

未注射促性腺激素的DT-1E组和对照组雌鼠脂肪组织中的ERα和ERßRNA的表现情况。

TaqManreal-timeRT-PCR量化分析表明经过6周的正常喂食后，DT-1E组中脂肪组织的ERα（A）和ERßB）mRNA明显高于对照组（P<0.05）。

如上图所示。

图三

注射促性腺激素后雌鼠子宫内的ERα,ERß和PRmRNA表现情况。

通过TaqManreal-timeRT-PCR分析，注射促性腺激素后，DT-1E组中