蜂巢形棉布载体固定化米根霉产果胶酶的半连续化发酵研究毕业论文.docx

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蜂巢形棉布载体固定化米根霉产果胶酶的半连续化发酵研究毕业论文

蜂巢形棉布载体固定化米根霉产果胶酶的

半连续化发酵研究

摘要

天然纤维素（如橘皮、烟梗）是一种可再生生物质资源，但由于纤维素、半纤维、木质素和果胶等交织在一起形成紧密复杂的结构，造成微生物利用天然纤维素生产乳酸、乙醇等的困难。

米根霉在一定培养条件下能产生降解果胶质的酶系。

果胶酶被广泛用于食品、纺织、生物技术等领域，其市场需求量日益增长。

本文采用一种研究较少但有产果胶酶能力且富有商业价值的安全菌种—米根霉，结合棉布载体固定化细胞的技术进行发酵产果胶酶。

采用DNS法测定果胶酶（PEC）酶活力和用粘度法测定聚半乳糖醛酸内切酶（Endo-PG）酶活力。

首先从纯果胶发酵产果胶酶出发，考察了固定化发酵与游离发酵差别，优化了纯果胶培养基，优化了培养条件并进行半连续发酵试验，研究了发酵液部分果胶酶酶学性质；然后优化烟梗浸液培养基，优化了培养条件并进行半连续试验，还研究了发酵液中纤维素酶活力变化情况。

首先，对纯果胶发酵产果胶酶进行研究。

在优化前培养基和培养条件下，固定化和游离发酵相比，固定化发酵48h就达到最大产酶量，缩短发酵时间24h，提高产酶量115%。

采用单因素和正交试验法优化培养基，结果表明影响产果胶酶的因素依次为：

果胶

Tween80

Zn2+

硫酸铵。

发酵培养基为：

果胶2.5%，硫酸铵1.5%，ZnSO40.6mmol/L，Tween800.15%，K2HPO40.4%，KH2PO40.4%；在此基础上采用单因素法优化培养条件，结果为：

果胶2.5%，硫酸铵1.5%，ZnSO40.6mmol/L，Tween800.15%，K2HPO40.4%，KH2PO40.4%，转速190r/min、装液量50ml/250ml、发酵温度30ºC、发酵初始pH5.0、初始孢子浓度0.75

106个/mL，培24h，PEC酶活力和Endo-PG酶活力分别为973.47U/mL和165.08U/mL。

通过对粗酶液作用pH和温度的研究，得到PEC和Endo-PG为酸性果胶酶，最适pH为4.5，PEC和Endo-PG最适温度分别为45ºC和55ºC。

半连续发酵试验结果表明，在第5批次出现最高PEC酶活力和Endo-PG酶活力，分别为1253.95U/mL和181.94U/mL，分别比首次提高29.8%和18.3%。

。

然后，对烟梗浸液发酵产果胶酶进行研究。

采用单因素和正交试验法优化

培养基，结果表明影响产果胶酶的因素依次为：

烟梗

硫酸铵

Zn2+

Tween80。

发酵培养基为：

烟梗10%，硫酸铵1.5%，ZnSO40.6mmol/L，Tween800.05%，K2HPO40.2%，KH2PO40.2%。

在此基础上采用单因素法优化培养条件，结果为：

烟梗10%，硫酸铵1.5%，ZnSO40.6mmol/L，Tween800.05%，K2HPO40.2%，KH2PO40.2%，发酵初始pH5.0，初始孢子浓度0.5

106，，30ºC，装液量50mL，转速170r/min，培养48h，PEC酶活力和Endo-PG酶活力最高分别为361.27U/mL和49.22U/mL。

烟梗浸液发酵96h，出现纤维素酶活力高峰，滤纸酶活力和羧甲基纤维素钠酶活力分别为33.25U/mL和83.13U/mL。

半连续发酵试验结果表明，在第2批次出现最高PEC酶活力和Endo-PG酶活力，分别为430.83U/mL和51.73U/mL，PEC酶活力比首批次提高约22.8%。

关键词：

米根霉，果胶酶，聚半乳糖醛酸内切酶，固定化，半连续化发酵

ABSTRCT

Naturalcelluloseisoneoftherenewableresources,suchasorangepeelandtobaccostem,whicharemadeofcellulose,halffiber,ligninandpectin.Theintertwinedcombinationamongthemleadstoformatightandcomplexstructure,whichishardformicroorganismstodigest.Hence,theproductionoflacticacidorethanolthroughusingnaturalcellulosebymicroorganismsisfacedwithproblems.Rhizopusoryzaehastheabilitytoproducepectinolyticenzymestodegradepectin.Theremoveofpectincanmakeseparationoffiber,fiberandlignineasier.Thereisagrowingmarketdemandofpectinolyticenzymesforthefactthatpectinolyticenzymesarewidelyusedinthefiledoffood,textile,pharmaceutical,papermaking,biologicaltechnologyandsoon.Rhizopusoryzae,whichownstheabilitytodegradepectinandisrichincomercialvalue,isusedtoproducepectinolyticenzymesinthisresearch.TheimmobilizedRhizopusoryzaewithmatrixcomposedofasterisk-configurationfibrousmatricesinahoneycomb-shaped,theproductionofpectinolyticenzymeswerecarriedoutfromcitruspectinandtobaccostempectin.Pectinolyticenzymes（PEC）activitywasdeterminedbyDNSassayandendopolygalacturonase（Endo-PG）activitywasmeasuredbyviscositymethod.

Fistly,thepurepectinwasselectedasthesbustrateforfermentation.Then,thecoparisonofenzymesproductionbetweenimmobilizedcellsandfreecellswasmade.Afterthat,optimizationofculturemediumandgrowthconditionswasinvestigatedthroughsinglefactorvariableanalysisandsoon.Also,somepropertiesoftheenzymewereunderreasearch.Finally,optimizationofculturemediummadefromtobaccostemwasinvestigatedthroughsinglefactorvariableanalysisandorthogonalexperiment.Optimizationofgrowthconditionswasinvestigatedthroughsinglefactorvariableanalysis.Sixbatchesofsemi-continuousfermentationwerecarriedoutinshakeflasks.

Firstofall,thestudyofpurepectinwascarriedout.ImmobilizedcellshadahigherproductionofPECoverfreecells.Immobilizedcellshadamaxproductionin48hours,whichsaved24hourscomparedwithfreecellsandimprovedproductionby115%.Resultsofsinglefactorandorthogonalexperimentalwithimmobilizedshowedtheorderoffactorsinfluencingtheproductionofpectinasewas:

pectin

Tween80

ZnSO4

（NH4）2SO4.Thesuitableculturemediawascomposedofpectin2.5%,（NH4）2SO41.5%,ZnSO40.6mmol/L,Tween800.15%,K2HPO40.4%，KH2PO40.4%，rotationspeed190r/min,liquidvolume50ml/250ml,temperature30ºC,initialpH5.0,initialsporeconcentration0.75

106/mL.After24hours,thePECactivityandEndo-PGactivitywere973.47U/mLand165.08U/mLseparately.EffectsofpHandtemperatureoncrudeenzymesfluidwerecarriedout.PECandEndo-PGmightbeacidicpectinolyticenzymes.TheoptimumpHwas4.5forPECandEndo-PG,optimumtemperaturewas45°Cand55°Crespectively.ThehighestPECactivityandEndo-PGactivitywere1253.95U/mLand181.94U/mLinthe5thbatch,about29.8%and18.3%higherthanthe1stbatch.

Secondly,optimizationofculturemediummadefromtobaccostemwasinvestigatedthroughsinglefactorvariableanalysisandorthogonalexperiment.Resultsshowedtheorderoffactorsinfluencingtheproductionofpectinasewas:

tobaccostem

（NH4）2SO4

ZnSO4

Tween80.Thesuitableculturemediawascomposedoftobaccostem10%,（NH4）2SO41.5%,ZnSO40.6mmol/L,Tween800.05%,K2HPO40.2%，KH2PO40.2%，rotationspeed170r/min,liquidvolume50ml/250ml,temperature30ºC,initialpH5.0,initialsporeconcentration0.50

106/mL.After48hours,thePECactivityandEndo-PGactivitywere361.27U/mLand49.22U/mLseparately.After96hours,celluloseenzymeactivityreachedapeakwithfilterpaperactivityof33.25U/mLandsodiumcarboxymethylcelluloseactivityof83.13U/mL.ThehighestPECactivityandEndo-PGactivitywere430.83U/mLand51.73U/mLinthe2ndbatch.PECactivitywasabout22.8%higherthanthe1stbatch.

Keywords:

Rhizopusoryzae,pectinolyticenzymes,endopolygalacturonase,immobilization,semi-continuousfermentation

目录

摘要I

ABSTRCTII

1绪论1

1.1问题的提出及研究意义1

1.1.1问题的提出1

1.1.2研究意义2

1.2国内外研究现状2

1.2.1果胶分布、化学结构和分类2

1.2.2果胶酶分类和作用方式3

1.2.3果胶酶生产菌种4

1.2.4真菌果胶酶的表达调控6

1.2.5微生物果胶酶条件优化研究现状7

1.2.6米根霉产果胶酶研究进展7

1.2.7固定化细胞产果胶酶的进展8

1.2.8果胶酶生产过程中的影响因素9

1.2.9果胶酶的应用11

1.2.10果胶质原料的研究12

1.3本课题研究的目的及主要内容12

1.3.1研究目的12

1.3.2本课题研究的主要内容12

1.3.3创新点13

2.棉布载体固定化发酵产果胶酶的研究14

2.1前言14

2.2材料和方法14

2.2.1菌种14

2.2.2主要仪器和试剂14

2.2.3培养基15

2.2.4载体的制备15

2.2.5发酵培养方法15

2.2.6分析方法16

2.3结果分析18

2.3.1酶液稀释倍数的确定18

2.3.2游离发酵与固定化发酵的比较19

2.4讨论19

2.4.1酶液稀释倍数对酶活力测定准确性的影响19

2.4.2游离发酵与固定化发酵19

2.5小结19

3固定化发酵果胶酶纯果胶培养基的优化20

3.1前言20

3.2材料和方法20

3.2.1菌种20

3.2.2主要仪器和试剂20

3.2.3培养基21

3.2.4发酵培养方法21

3.2.5分析方法21

3.3结果分析22

3.3.1碳源种类的选择22

3.3.2果胶浓度选择23

3.3.3氮源种类选择23

3.3.4硫酸铵浓度选择24

3.3.5Tween80对产酶的影响25

3.3.6金属离子的对产酶的影响25

3.3.7发酵培养基的正交实验26

3.4讨论27

3.4.1碳源种类及果胶浓度对产酶的影响27

3.4.2氮源种类及硫酸铵对产酶的影响28

3.4.3Tween80对产酶的影响28

3.4.4金属离子对产酶的影响28

3.4.5正交实验结果分析29

3.5小结29

4．纯果胶培养基半连续发酵果胶酶30

4.1前言30

4.2材料和方法30

4.2.1菌种、主要仪器和试剂30

4.2.2培养基30

4.2.4发酵培养方法31

4.2.5分析方法31

4.3结果分析31

4.3.1转速的选择31

4.3.2装液量选择32

4.3.3温度选择32

4.3.4初始pH的选择33

4.3.5初始孢子浓度的选择33

4.3.6生长和产酶的时间曲线34

4.3.7半连续发酵试验35

4.3.8粗酶液部分酶学性质36

4.4讨论37

4.4.1转速和装液量对产酶的影响37

4.4.2pH对产酶的影响37

4.4.3初始孢子浓度对产酶的影响38

4.4.4产酶与pH变化的关系38

4.4.5半连续发酵的稳定性38

4.4.6粗酶液部分酶学性质38

4.5小结39

5.固定化发酵果胶酶烟梗浸液培养基的优化40

5.1前言40

5.2材料和方法40

5.2.1试剂和设备40

5.2.2烟梗浸液的制备41

5.2.3培养基及发酵培养方法41

5.2.4分析方法41

5.3结果分析41

5.3.1两种制备烟梗浸液方法的比较41

5.3.2烟梗浓度的选择42

5.3.3硫酸铵浓度的选择42

5.3.4Zn2+离子浓度的选择43

5.3.5Tween80浓度的选择43

5.3.6发酵培养基的正交试验44

5.4讨论45

5.4.1制备烟梗浸液方法45

5.4.2培养基的优化45

5.5小结45

6.烟梗浸液培养基半连续发酵果胶酶47

6.1前言47

6.2材料和方法47

6.2.1试剂和设备47

6.2.2烟梗浸液的制备47

6.2.3培养基及发酵培养方法47

6.2.4分析方法48

6.3结果分析49

6.3.1初始pH的选择49

6.3.2初始孢子浓度的选择49

6.3.3生长和产酶的时间曲线50

6.3.4半连续发酵试验51

6.3.5最优发酵条件下纤维素酶活力51

6.4讨论52

6.4.1发酵条件的优化52

6.4.2生长和产酶的时间曲线52

6.4.3半连续发酵的稳定性53

6.4.4发酵过程中纤维素酶活力的变化53

6.5小结53

7.结论与展望54

7.1结论54

7.2对后续工作的展望55

致谢56

参考文献57

附录62

蜂巢形棉布载体固定化米根霉产果胶酶的

半连续化发酵研究

1绪论

1.1问题的提出及研究意义

1.1.1问题的提出

天然纤维素原料如橘皮、烟梗、稻草、玉米秸秆等是被废弃的资源，同时由于其内部纤维素与果胶之间紧密作用造成利用生物技术转化天然纤维素原料时的困难。

天然纤维素原料在进行微生物转化过程中，一般需要先进行半纤维素和木质素等预处理过程，然后进行纤维素酶解和微生物发酵产乙醇、丙醇、丁醇、柠檬酸和乳酸等。

预处理过程的好坏很大程度上决定了酶解的难易程度，如酶结合性和催化水解率[1]。

果胶质的存在对半纤维、木质素去除的有一定程度的影响，主要表现在增加处理过程中溶液的粘度和溶剂的使用量。

米根霉在微生物转化纤维素的众多研究中有着重要的地位。

米根霉作为一种公认的安全菌，能产生广泛的代谢物，如酶类（如果胶酶等），有机酸（如乳酸等）以及生物乙醇等，有着极大商业价值[2]。

果胶酶在食品、纺织、医药、造纸、环境、生物技术、饲料等领域都有广泛应用[3]，这就使得果胶酶的需求量逐年递增。

果胶酶生产量占全部工业酶制剂的10%左右[4]，其中在食品酶的销售额中约占到了25%[5]。

固定化米根霉的形式可视为特殊的生物活性结构单元，它可以将精制原料如淀粉、葡萄糖等或是天然纤维素原料如玉米秸秆、稻草等转换为乳酸、乙醇等，但还未应用于降解果胶质产酶的研究。

国内外在米根霉利用果胶质这一领域尚存在诸多空白，为数不多的研究[6-12]，主要着力在固态发酵产果胶酶酶性质上的研究，如聚半乳糖醛酸酶和聚半乳糖醛酸裂解酶等的性质，未涉及固定化米根霉降解果胶的研究，对产酶培养基和培养条件的研究也不足，因此降解果胶产果胶酶的能力不高。

细胞固定化与细胞游离培养相比有许多优势，如细胞密度的增加，细胞产率的提高，细胞分离更加方便从而有利于半连续和连续发酵[13-14]。

真菌细胞的固定可以通过吸附于聚合物载体或者包埋于天然聚合物（海藻酸盐凝胶和合成凝胶）。

凝胶颗粒包埋细胞易阻碍物质传输，影响发酵能力，还需要耗费时力制备大量凝胶颗粒。

棉布载体固定化细胞的方式由于将细胞吸附于棉布表面，同时金属网状支撑骨架利于物质传输，因此菌体形态和发酵效果好。

此外，棉布载体还具有重复使用性好和工业组装方便等特点，具有工业化生产的潜力[15]。

据此，本文设想将棉布载体固定化米根霉这一生物活性单元引入到降解果胶质产酶的研究中，优化生物活性单元产酶的培养基和培养条件，并进行半连续试验，考察载体的重复使用性和稳定性。

1.1.2研究意义

本文试图将一种研究较少但有产果胶酶能力且富有商业价值的安全菌种-米根霉，结合以棉布载体固定化细胞的技术，用于降解果胶质的研究，有助于天然纤维素生物转换为下游产品如乳酸和乙醇等，同时收获果胶酶粗酶液。

1.2国内外研究现状

1.2.1果胶分布、化学结构和分类

果胶，最早由Bracennot在胡萝卜中提取得到的[16]。

果胶广泛存在于高等植物的根、茎、叶和果实中，水果皮如柑橘、柠檬、柚子等含有约30%的果胶，商品天然果胶多用酸从这些果皮或果渣中提取制得。

果胶，分子式为（C6H10O6）n，相对分子质量5万-30万。

果胶在高等植物初生壁和胞间层中存在，在初生壁中与木质纤维的微纤丝以及某些伸展蛋白相互交联作用下，使得细胞组织结构坚固,维持细胞固有的形态。

它是以α-1,4糖苷键键合D-半乳糖醛酸形成的多糖主链，同时与带有鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖等中性糖侧链共价键合的聚合物。

果胶骨架基本单位是D-半乳糖醛酸，同时还含有如甲醇、乙酸和阿魏酸等非糖成分，其中D-半乳糖醛酸上的羧基可被甲基不同程度的脂化。

一般可将果胶的结构分为光滑区和须状区,主要由三个结构域组成，即HGA、RG-I和RG-II，其中RG-II常为二聚体形式（如图1.1所示）。

果胶有多分子、多分散、多结构，高级空间构象的特点[17]。

果胶质可分三类，即原果胶（protopectin）、果胶（pectin）和果胶酸（pecticacid）。

1944年，果胶术语制定委员会对果胶物质作出明确的定义，具体如表1.1所示[18]。

表1.1果胶物质的定义

Tab.1.1Thedefinitionofpecticsubstances

分类

定义

溶解性

果胶酸

（pecticacid,pectate）

完全未甲酯化的聚半乳糖醛酸链，由D-半乳糖醛酸脱水缩合，以α-1,4糖苷键连接形成的直链状聚合物

微溶于水

果胶

（pectin,pectinate）

羧基不同程度甲酯化和中和的聚半乳糖醛链，分为低酯果胶（LM）和高酯果胶（HM）

可溶于水

原果胶

（protopectin）

存在于未成熟果蔬的细胞壁中，与纤维和半纤维结合的甲酯化聚半乳糖醛酸链

不溶于水

图1.1果胶的结构简图

Fig.1.1Schematicrepresentationoftheprimarystructureofpectin

1.2.2果胶酶分类和作用方式

果胶酶通常分为原果胶酶、酯酶和解聚酶三种类型：

原果胶酶将不溶于水的原果胶降解为高度聚合的可溶性果胶；酯酶通过对甲基的去除，促使果胶酯水解；解聚酶打断果胶质