农药虫螨腈含量的测定HPLC法检验检疫标准管理信息系统.docx
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农药虫螨腈含量的测定HPLC法检验检疫标准管理信息系统
农药虫螨腈含量的测定HPLC法
编制说明
一、制定本标准的任务来源和意义
1.任务来源
本标准的制定工作是根据国家认监委“国认科函【2009】132号”文件《国家认证认可监督管理委员会关于下达2009年出入境检验检疫行业标准制(修)订计划项目的通知》下达的任务而进行的,项目编号为2009B068,由陕西出入境检验检疫局承担研究和起草工作。
2.目的和意义
虫螨腈(Chlorfenapyr)又叫溴虫腈,化学名称为4-溴-2-(4-氯苯基)-1-乙氧甲基吡咯-3-腈(4-Bromo-2-(4-chlorophenyl)-1-(ethoxymethyl)-5-(trifluoromethyl)-1H-pyrrole-3-carbonitrile)(化学结构式见图1),分子式C15H11BrClF3N2O,分子量407.62,是由美国氰胺公司开发的含三氟甲基吡咯腈结构的新型杀虫杀螨剂。
其纯品为白色固体,熔点100~101℃。
能溶于丙酮、二甲亚砜、乙醚、四氢呋喃、乙腈、醇类等有机溶剂,水中溶解度为0.13g~0.14g/100g水。
10%的虫螨腈悬浮剂又叫“除尽”,外观为白色至棕黄色悬浮液体,密度1.05g/mL(25℃),pH7.5~9.0,粒径在2.5~3.5µm之间,悬浮率大于70%,粘度400~500mPa•s,结冰点-5℃。
按中国农药毒性分级标准,虫螨腈属低毒杀虫剂。
原药大鼠急性经口LD50为626mg/kg,兔急性经皮LD50(24h)大于2000mg/kg。
10%除尽悬浮剂大鼠(雄)急性经口LD505359mg/kg,兔(雄)急性经皮LD50大于2000mg/kg。
对兔眼睛及皮肤无刺激作用;对豚鼠皮肤无致敏作用。
图1:
虫螨腈化学结构式
虫螨腈作用机理新颖,在叶面渗透性强,有一定的内吸作用,杀虫谱广,对常规农药无交互抗性,可以控制对氨基甲酸酯类、有机磷酸酯类和拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性的昆虫和某些螨,具有防止害虫用量少、有效期长、低毒安全等优点,被美国国家环保署广泛推荐使用在蔬菜、水果、甘蔗、茶叶、家禽和畜牧产品上。
近年来虫螨腈的市场不断增加,2001年全球销售额达到1.45亿美元。
随着国家高毒农药替代政策的出台以及人们环保意识的提高,作为无公害农产品病虫防治推荐农药品种的代表,低毒高效的虫螨腈越来越广泛地使用在出口农产品和高品质农产品上。
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我国目前尚没有虫螨腈含量的检测标准,这给农药虫螨腈的管理和进出口质量的监督把关造成了困难,为了满足政府管理、加工企业质量控制和检验检疫行政执法的需求,我们开展了《农药虫螨腈含量的测定——高效液相色谱法》标准的起草工作。
二、编制依据
1.本标准方法根据GB/T1.1-2000《标准化工作导则》第一单元:
标准的起草与表述规则第一部分:
标准的结构和编写规则和SN/T1831-2006《进出口化矿金商品化学分析方法标准编写的基本规定》的要求编写制订。
2.本标准参考有关文献,经研究、改进和验证后制定。
三、方法概述
将试样用甲醇溶解并定容,过滤后经C18色谱柱分离,用配有紫外检测器或二极管阵列检测器的高效液相色谱仪检测,保留时间定性,外标法定量。
四、实验论证
1.试样溶剂的选择
通常采用单一溶剂或混合溶剂溶解试样以确定溶解效果。
根据相似相容原理,并结合文献[1,2],以不同体积比的甲醇和水的混合溶剂溶解试样并测定。
分别称取0.25g(精确至0.0002g)10%虫螨腈悬浮剂6份于25mL容量瓶中,加入不同体积比的甲醇和水的混合溶剂20mL,超声5min,定容至刻度,摇匀。
在4000r/min下离心4min,过0.45µm滤膜。
从溶解过程观察,试样以水溶解呈浑浊,离心后未见澄清,不容易通过滤膜;随着溶剂中甲醇比例的增加,试样溶液浑浊度降低,离心后澄清,容易通过滤膜;当溶剂为纯甲醇时,试样溶液离心后完全澄清,容易通过滤膜。
处理后的试样溶液在色谱柱为C18柱、柱温为35℃、流速为1.0mL/min、检测波长为260nm、进样体积为5µL、流动相为甲醇+水=85+15(体积比)的条件下测定虫螨腈含量,结果见表1。
表1:
(甲醇+水)体积比变化对试样溶解效果的影响
试样名称
称样量
g
甲醇+水
体积比
定容体积
mL
保留时间
min
峰面积mAu*s
10%虫螨腈悬浮剂
0.2552
0+100
25
/
/
0.2491
60+40
7.298
1236
0.2560
70+30
7.299
2162
0.2508
80+20
7.302
4751
0.2574
90+10
7.302
7321
0.2568
100+0
7.272
8430
表1的数据表明,以纯水溶解时,没有虫螨腈色谱峰出现;随着混合溶剂中甲醇比例的增高,虫螨腈的响应值不断增大;当溶剂为纯甲醇时,虫螨腈的响应值最大。
说明甲醇的溶解效果最好,本方法选择甲醇为溶剂。
2.仪器条件选择
1)色谱柱的选择:
文献[1]中对C18柱和C8柱的分离效果进行了比较,发现虫螨腈在C18柱上与杂质的分离效果更好。
由于C18通用性更强,本方法选择C18柱作为分离柱,发现其分离虫螨腈的效果满意。
2)检测波长的确定:
本方法参考了文献[1,2],以0.5µg/mL虫螨腈标准溶液在色谱柱为C18柱、柱温为35℃、流速为1.0mL/min、进样体积为5µL、流动相为甲醇+水=90+10(体积比)的条件下,分别在205nm和260nm的波长下测定,得到的色谱峰见图1和图2。
图1:
205nm下0.5µg/mL虫螨腈标准溶液的色谱图
图2:
260nm下0.5µg/mL虫螨腈标准溶液的色谱图
从图1和图2可以看出,0.5µg/mL虫螨腈标准溶液在205nm下响应值高,但基线不稳定,干扰杂质多;在260nm下,该溶液基线平稳,无杂质干扰。
本方法选择260nm为检测波长。
3)流动相比例的确定:
改变流动相中甲醇和水的体积比,对20µg/mL虫螨腈标准溶液进行测定,结果见表2,色谱峰见图3~图6。
表2:
流动相(甲醇+水)体积比变化的影响
甲醇+水(体积比)
保留时间min
峰高
90+10
5.247
45.8
85+15
7.143
31.2
80+20
11.030
21.2
75+25
18.567
12.9
图3:
流动相为甲醇+水=90+10(体积比)下的20µg/mL虫螨腈标准溶液的色谱图
图4:
流动相为甲醇+水=85+15(体积比)下的20µg/mL虫螨腈标准溶液的色谱图
图5:
流动相为甲醇+水=80+20(体积比)下的20µg/mL虫螨腈标准溶液的色谱图
图6:
流动相为甲醇+水=75+25(体积比)下的20µg/mL虫螨腈标准溶液的色谱图
从测定结果看,随着混合流动相中甲醇比例的减少,虫螨腈的灵敏度降低;随着水的比例的增加,虫螨腈的保留时间增大。
选择分离条件的原则是色谱峰的保留时间短、峰尖锐、峰形对称性好。
因此本方法选择流动相为甲醇+水=90+10(体积比)。
3.最佳试验条件:
通过上述试验,确定的条件如下:
a)试样溶液的配制:
称取约含0.05g(精确至0.0002g)虫螨腈的试样于100mL容量瓶中,加入80mL甲醇。
将容量瓶放入超声波水浴中超声5min,用甲醇定容至刻度,摇匀。
于4000r/min离心4min,用1mL移液管准确吸取上层清液1mL,转移至100mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。
经0.45µm滤膜过滤,供高效液相色谱测定。
b)溶剂:
纯甲醇。
c)色谱柱:
ODS-3(C18)反相色谱柱。
d)流动相:
甲醇+水=90+10(体积比)。
e)流速:
1.0mL/min。
f)色谱柱温度:
35℃。
g)检测波长:
260nm。
h)进样体积:
5µL。
4.方法验证:
1)线性试验:
按照上述所建方法,分别配制浓度为0.5µg/mL、5µg/mL、20µg/mL、100µg/mL、
500µg/mL、1000µg/mL和2000µg/mL的虫螨腈标准溶液,在上述所建方法的仪器条件下测定,结果见表3。
标准曲线的线性方程为:
Y=15.195X+157.1(X为虫螨腈标准溶液浓度,Y为峰面积),相关系数r=0.9995,标准曲线见图8。
表3:
线性试验结果
虫螨腈标准溶液浓度
µg/mL
峰面积
mAu*s
0.5
7
5
71
20
285
100
1674
500
7987
1000
15996
2000
30170
图7:
虫螨腈标准曲线
2)精密度试验:
按照上述所建方法分别配制虫螨腈原药溶液、10%虫螨腈悬浮剂溶液和8%虫螨腈悬浮剂溶液各12份,经过离心、过滤后测定,结果见表4。
表4:
虫螨腈含量精密度测定结果
平行试样
测定次数
虫螨腈原药浓度
%
10%虫螨腈悬浮剂浓度
%
8%虫螨腈悬浮剂浓度
%
1
93.30
10.24
7.08
2
92.63
10.20
7.03
3
93.08
10.26
6.93
4
93.52
10.26
7.03
5
93.74
10.24
7.05
6
93.74
10.26
7.07
7
93.52
10.26
7.03
8
93.30
10.24
7.05
9
93.08
10.26
7.03
10
93.74
10.26
7.07
11
93.74
10.24
7.01
12
93.30
10.24
7.00
算术平均值
93.39
10.25
7.03
标准偏差SD
0.348
0.018
0.040
相对标准偏差
RSD%
0.37
0.18
0.57
由表4可以看出,虫螨腈原药测定结果的相对标准偏差为0.37%,10%虫螨腈悬浮剂测定结果的相对标准偏差为0.18%,8%虫螨腈悬浮剂测定结果的相对标准偏差为0.57%。
本方法的精密度试验结果符合《基本规定》的要求。
3)准确度试验:
取一定量虫螨腈原药溶于甲醇,经测定溶液中虫螨腈含量为4.69µg/mL,吸取1mL该溶液并添加0.5mL的5µg/mL的虫螨腈标准溶液(含虫螨腈2.5µg),混匀,过滤后测定。
按照同样方法向1mL上述试样溶液中添加1.0mL和1.5mL的5µg/mL的虫螨腈标准溶液(分别含虫螨腈5.0µg和7.5µg)。
每个添加水平分别测定12次,结果见表5。
表5:
虫螨腈原药的回收率和精密度测定结果
测定次数
添加水平
2.5μg
5.0μg
7.5μg
测得值
μg
回收率
%
测得值
μg
回收率
%
测得值
μg
回收率
%
1
7.09
96.0
9.68
99.8
12.15
99.5
2
7.02
96.4
9.68
99.8
12.01
97.6
3
7.03
97.2
9.65
99.2
12.03
97.9
4
7.08
96.8
9.66
99.4
12.15
99.5
5
7.08
97.6
9.68
99.8
12.28
101.2
6
7.06
98.4
9.67
99.6
12.23
100.5
7
7.02
97.6
9.68
99.8
12.35
102.1
8
7.05
96.8
9.64
99.0
12.12
99.1
9
7.06
99.6
9.66
99.4
12.30
101.5
10
7.02
100.4
9.69
100.0
12.11
98.9
11
7.04
101.6
9.70
100.2
12.33
101.9
12
7.05
99.6
9.67
99.6
12.12
99.1
平均值
7.14
98.2
9.67
99.63
12.18
99.9
标准偏差
SD
0.044
/
0.017
/
0.114
/
相对标准偏差
RSD%
0.62
/
0.18
/
0.94
/
取一定量10%的虫螨腈悬浮剂溶于甲醇,经测定溶液中虫螨腈含量为5.40µg/mL,吸取1mL该溶液并添加0.5mL的5µg/mL的虫螨腈标准溶液(含虫螨腈2.5µg),混匀,过滤后测定。
按照同样方法向1mL上述试样溶液中添加1.0mL和1.5mL的5µg/mL的虫螨腈标准溶液(分别含虫螨腈5.0µg和7.5µg)。
每个添加水平分别测定12次,结果见表6。
表6:
10%虫螨腈悬浮剂的回收率和精密度测定结果
测定次数
添加水平
2.5μg
5.0μg
7.5μg
测得值
μg
回收率
%
测得值
μg
回收率
%
测得值
μg
回收率
%
1
8.01
104.4
10.41
100.2
12.78
98.4
2
8.03
105.2
10.36
99.2
12.72
97.6
3
7.99
103.6
10.33
98.6
12.80
98.7
4
7.98
103.2
10.35
99.0
12.83
99.1
5
8.05
106.0
10.38
99.6
12.85
99.3
6
8.07
106.8
10.30
98.0
12.82
98.9
7
7.97
102.8
10.37
99.4
12.79
98.5
8
7.95
102.0
10.36
99.2
12.73
97.7
9
7.93
101.2
10.33
98.6
12.83
99.1
10
7.93
101.2
10.39
99.8
12.88
99.7
11
7.95
102.0
10.37
99.4
12.85
99.3
12
7.96
102.4
10.42
100.4
12.87
99.6
平均值
7.98
103.4
10.36
99.3
12.81
98.8
标准偏差
SD
0.046
/
0.034
/
0.051
/
相对标准偏差
RSD(%)
0.58
/
0.33
/
0.40
/
取一定量8%虫螨腈悬浮剂溶于甲醇,经测定溶液中虫螨腈含量为5.42µg/mL,吸取1mL该溶液并添加0.5mL的5µg/mL的虫螨腈标准溶液(含虫螨腈2.5µg),混匀,过滤后测定。
按照同样方法向1mL上述试样溶液中添加1.0mL和1.5mL的5µg/mL的虫螨腈标准溶液(分别含虫螨腈5.0µg和7.5µg)。
每个添加水平分别测定12次,结果数据见表7。
表7:
8%虫螨腈悬浮剂的回收率和精密度测定结果
测定次数
添加水平
2.5μg
5.0μg
7.5μg
测得值
μg
回收率
%
测得值
μg
回收率
%
测得值
μg
回收率
%
1
7.93
100.4
10.45
100.6
12.98
100.8
2
8.03
105.2
10.38
99.2
12.90
99.7
3
8.01
104.4
10.51
101.8
12.95
100.4
4
7.99
103.6
10.49
101.4
12.93
100.1
5
7.89
99.6
10.39
99.4
12.84
98.9
6
7.98
103.2
10.37
99.0
13.05
101.8
7
7.93
101.2
10.43
100.2
13.08
102.2
8
7.85
98.0
10.40
99.6
13.04
101.7
9
7.88
99.2
10.35
98.6
12.92
100.0
10
7.97
102.8
10.52
102.0
12.99
101.0
11
7.82
96.8
10.33
98.2
12.88
99.4
12
7.89
99.6
10.47
101.0
13.13
102.9
平均值
7.93
101.2
10.42
100.1
12.97
100.7
标准偏差
SD
0.066
/
0.064
/
0.084
/
相对标准偏差
RSD(%)
0.84
/
0.61
/
0.64
/
由表5~表7可以看出,虫螨腈原药的平均回收率的相对标准偏差为0.18%~0.94%;10%虫螨腈悬浮剂的平均回收率的相对标准偏差为0.33%~0.58%;8%虫螨腈悬浮剂的平均回收率的相对标准偏差为0.61%~0.84%。
本方法的回收率试验结果符合《基本规定》的要求。
4)实验室间验证试验:
5)结论
综上所述,该方法快速简便,步骤少,试剂消耗低,适用于市场上常见的虫螨腈原药、10%的虫螨腈的悬浮剂和8%的虫螨腈悬浮剂的含量测定。
经过条件试验、精密度试验、线性试验、回收率试验和试验时间验证试验,各项技术指标均满足含量检测的需要和《基本规定》的要求。
五、参考文献
[1].高巍,武中平.溴虫腈高效液相色谱分析方法的研究[J].现代农药,2007,6(5):
24-25.
[2].刘育清.虫螨腈的高效液相色谱分析方法[J].农药科学与管理,2002,23(4):
14-15.
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- 农药 虫螨腈 含量 测定 HPLC 检验 检疫 标准 管理信息系统