蛋白质组学.docx
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蛋白质组学
蛋白质组学(Proteomics)一词,源于蛋白质(protein)与基因组学(genomics)两个词的组合,意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。
蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征,包括蛋白质的表达水平,翻译后的修饰,蛋白与蛋白相互作用等,由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生,细胞代谢等过程的整体而全面的认识,这个概念最早是由MarcWilkins在1995年提出的。
前言
蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础,也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。
通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析,我们可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”,它们可成为新药物设计的分子靶点,或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志。
确实,那些世界范围内销路最好的药物本身是蛋白质或其作用靶点为某种蛋白质分子。
因此,蛋白质组学研究不仅是探索生命奥秘的必须工作,也能为人类健康事业带来巨大的利益。
蛋白质组学的研究是生命科学进入后基因时代的特征。
基本策略
蛋白质组(Proteome)的概念最先由MarcWilkins提出,指由一个基因组(genOME),或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(PROTein).蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别,它随着组织、甚至环境状态的不同而改变.在转录时,一个基因可以多种mRNA形式剪接,并且,同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰.故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物,蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目.蛋白质组学(Proteomics)处于早期“发育”状态,这个领域的专家否认它是单纯的方法学,就像基因组学一样,不是一个封闭的、概念化的稳定的知识体系,而是一个领域.蛋白质组学集中于动态描述基因调节,对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定,鉴定疾病、药物对生命过程的影响,以及解释基因表达调控的机制.作为一门科学,蛋白质组研究并非从零开始,它是已有20多年历史的蛋白质(多肽)谱和基因产物图谱技术的一种延伸.多肽图谱依靠双向电泳(Two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)和进一步的图象分析;而基因产物图谱依靠多种分离后的分析,如质谱技术、氨基酸组分分析等.
研究基础
蛋白质组学的研究基础
90年代初期开始实施的人类基因组计划,在经过各国科学家近10年的努力下,已经取得了巨大的成就。
不仅完成了十余种模式生物(从大肠杆菌、酿酒酵母到线虫)基因组全序列的测定工作,还有望在2003年提前完成人类所有基因的全序列测定。
那么,知道了人类的全部遗传密码即基因组序列,就可以任意控制人的生老病死吗?
其实并不是这么简单。
基因组学(genomics)虽然在基因活性和疾病的相关性方面
为人类提供了有力根据,但实际上大部分疾病并不是因为基因改变所造成。
并且,基因的表达方式错综复杂,同样的一个基因在不同条件、不同时期可能会起到完全不同的作用。
关于这些方面的问题,基因组学是无法回答的。
所以,随着人类基因组计划的逐步完成,科学家们又进一步提出了后基因组计划,蛋白质组(proteome)研究是其中一个很重要的内容。
目前,在蛋白质功能方面的研究是极其缺乏的。
大部分通过基因组测序而新发现的基因编码的蛋白质的功能都是未知的,而对那些已知功能的蛋白而言,它们的功能也大多是通过同源基因功能类推等方法推测出来的。
有人预测,人类基因组编码的蛋白至少有一半是功能未知的。
因此,在未来的几年内,随着至少30种生物的基因组测序工作的完成,人们研究的重点必将转到蛋白质功能方面,而蛋白质组的研究正可以完成这样的目标。
在蛋白质组的具体应用方面,蛋白质在疾病中的重要作用使得蛋白质组学在人类疾病的研究中有着极为重要的价值。
基因组(genome)包含的遗传信息经转录产生mRNA,一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的mRNA称为转录子组(transcriptome)。
很显然,不同细胞在不同生理或病理状态下转录子组包含的mRNA的种类不尽相同。
mRNA经翻译产生蛋白质,一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome)。
同理,不同细胞在不同生理或病理状态下所表达的蛋白质的种类也不尽相同。
蛋白质是基因功能的实施者,因此对蛋白质结构,定位和蛋白质-蛋白质相互作用的研究将为阐明生命现象的本质提供直接的基础。
生命科学是实验科学,因此生命科学的发展极大地依赖于实验技术的发展。
以DNA序列分析技术为核心的基因组研究技术推动了基因组研究的日新月异,而以基因芯片技术为代表的基因表达研究技术为科学家了解基因表达规律立下汗马功劳。
在蛋白质组研究中,二维电泳和质谱技术的黄金组合又为科学家掌握蛋白质表达规律再铸辉煌。
蛋白质组学(proteomics)就是指研究蛋白质组的技术及这些研究得到的结果。
蛋白质组学的研究试图比较细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同,对相关蛋白质进行分类和鉴定。
更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能。
研究内容
蛋白质组学的研究内容
1.蛋白质鉴定:
可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术,利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。
2.翻译后修饰:
很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化,糖基化,酶原激活等。
翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式,因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。
3.蛋白质功能确定:
如分析酶活性和确定酶底物,细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。
可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。
另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。
Clontech的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。
4.
对人类而言,蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康,主要指促进分子医学的发展。
如寻找药物的靶分子。
很多药物本身就是蛋白质,而很多药物的靶分子也是蛋白质。
药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。
在基础医学和疾病机理研究中,了解人不同发育、生长期和不同生理、病理条件下及不同细胞类型的基因表达的特点具有特别重要的意义。
这些研究可能找到直接与特定生理或病理状态相关的分子,进一步为设计作用于特定靶分子的药物奠定基础。
不同发育、生长期和不同生理、病理条件下不同的细胞类型的基因表达是不一致的,因此对蛋白质表达的研究应该精确到细胞甚至亚细胞水平。
可以利用免疫组织化学技术达到这个目的,但该技术的致命缺点是通量低。
LCM技术可以精确地从组织切片中取出研究者感兴趣的细胞类型,因此LCM技术实际上是一种原位技术。
取出的细胞用于蛋白质样品的制备,结合抗体芯片或二维电泳-质谱的技术路线,可以对蛋白质的表达进行原位的高通量的研究。
很多研究采用匀浆组织制备蛋白质样品的技术路线,其研究结论值得怀疑,因为组织匀浆后不同细胞类型的蛋白质混杂在一起,最后得到的研究数据根本无法解释蛋白质在每类细胞中的表达情况。
虽然培养细胞可以得到单一类型细胞,但体外培养的细胞很难模拟体内细胞的环境,因此这样研究得出的结论也很难用于解释在体实际情况。
因此在研究中首先应该将不同细胞类型分离,分离出来的不同类型细胞可以用于基因表达研究,包括mRNA和蛋白质的表达。
LCM技术获得的细胞可以用于蛋白质样品的制备。
可以根据需要制备总蛋白,或膜蛋白,或核蛋白等,也可以富集糖蛋白,或通过去除白蛋白来减少蛋白质类型的复杂程度。
相关试剂盒均有厂商提供。
蛋白质样品中的不同类型的蛋白质可以通过二维电泳进行分离。
二维电泳可以将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离。
成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离。
电泳后对胶进行高灵敏度的染色如银染和荧光染色。
如果是比较两种样品之间蛋白质表达的异同,可以在同样条件下分别制备二者的蛋白质样品,然后在同样条件下进行二维电泳,染色后比较两块胶。
也可以将二者的蛋白质样品分别用不同的荧光染料标记,然后两种蛋白质样品在一块胶上进行二维电泳的分离,最后通过荧光扫描技术分析结果。
胶染色后可以利用凝胶图像分析系统成像,然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分析,并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。
通过专门的蛋白质点切割系统,可以将蛋白质点所在的胶区域进行精确切割。
接着对胶中蛋白质进行酶切消化,酶切后的消化物经脱盐/浓缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特定的材料的表面(MALDI-TOF)。
最后这些蛋白质就可以在质谱系统中进行分析,从而得到蛋白质的定性数据;这些数据可以用于构建数据库或和已有的数据库进行比较分析。
LCM-二维电泳-质谱的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线,除此以外,LCM-抗体芯片也是一条重要的蛋白质组学研究的技术路线。
即通过LCM技术获得感兴趣的细胞类型,制备细胞蛋白质样品,蛋白质经荧光染料标记后和抗体芯片杂交,从而可以比较两种样品蛋白质表达的异同。
Clontech最近开发了一张抗体芯片,
可以对378种膜蛋白和胞浆蛋白进行分析。
该芯片同时配合了抗体芯片的全部操作过程的重要试剂,包括蛋白质制备试剂,蛋白质的荧光染料标记试剂,标记体系的纯化试剂,杂交试剂等。
对于蛋白质相互作用的研究,酵母双杂交和噬菌体展示技术无疑是很好的研究方法。
Clontech开发的酵母双杂交系统和NEB公司开发的噬菌体展示技术可供研究者选用。
关于蛋白质组的研究,也可以将蛋白质组的部分或全部种类的蛋白质制作成蛋白质芯片,这样的蛋白质芯片可以用于蛋白质相互作用研究,蛋白表达研究和小分子蛋白结合研究。
Science,Vol.293,Issue5537,2101-2105,September14,2001发表了一篇关于酵母蛋白质组芯片的论文。
该文主要研究内容为:
将酵母的5800个ORF表达成蛋白质并进行纯化点样制作芯片,然后用该芯片筛选钙调素和磷脂分子的相互作用分子。
最后有必要指出的是,传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质,而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境(分子)的关系。
因此蛋白质组学的研究通常是高通量的。
适应这个要求,蛋白质组学相关研究工具通常都是高度自动化的系统,通量高而速度快,配合相应分析软件和数据库,研究者可以在最短的时间内处理最多的数据
研究意义和背景
蛋白质组学研究的研究意义和背景
随着人类基因组计划的实施和推进,生命科学研究已进入了后基因组时代。
在这个时代,生命科学的主要研究对象是功能基因组学,包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。
尽管现在已有多个物种的基因组被测序,但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。
目前功能基因组中所采用的策略,如基因芯片、基因表达序列分析(Serialanalysisofgeneexpression,SAGE)等,都是从细胞中mRNA的角度来考虑的,其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。
但事实并不完全如此,从DNAmRNA蛋白质,存在三个层次的调控,即转录水平调控(Transcriptionalcontrol),翻译水平调控(Translationalcontrol),翻译后水平调控(Post-translationalcontrol)。
从mRNA角度考虑,实际上仅包括了转录水平调控,并不能全面代表蛋白质表达水平。
实验也证明,组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好,尤其对于低丰度蛋白质来说,相关性更差。
更重要的是,蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等则几乎无法从mRNA水平来判断。
毋庸置疑,蛋白质是生理功能的执行者,是生命现象的直接体现者,对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制
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