实验室方法验证方法及实例.docx

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实验室方法验证方法及实例

一、方法验证的方法应包含以下几个方面：

　　1、对执行新方法所需的人力资源的评价，即检测/校准人员是否具备所需的技能及能力，必要时应进行人员培训，经考核后上岗。

　　2、对现有设备适用性的评价，是否要补充新的的标准器或标准物质。

　　3、对物品制备，包括前处理、存放等各环节是否满足新方法要求的评价。

　　4、对操作规范、不确定度，原始记录、报告格式及其内容是否适应新方法要求的评价。

　　5、对设施和环境条件的评价，必要时进行验证。

　　6、对新方法正确运用的评价，当有旧方法变更时，应对新旧方法进行比较，尤其是差异分析与比对的评价。

　　7、按新方法要求进行两次以上完整模拟检测/校准，出具两份完整结果报告。

　　注意：

　　1.方法确认应有文件规定和相应记录，当修改已经确认过的方法时，应确定这些修改的影响，如果影响到原有的确认，应重新进行确认。

　　2.方法验证应有文件规定和相应记录，当方法变化后，应重新进行验证。

二、实验室方法验证的具体要求      

1、检出限的验证

　　确定检出限，按方法操作步骤及流程进行分析操作，计算结果的平均值、标准偏差、相对标准偏差、检出限等各项参数。

最终的方法检出限为各验证实验室所得数据的最高值。

2、精密度的验证

　　有证标准物质/标准样品的测定：

采用高、中、低3种不同含量水平（应包括一个在测定下限附近的浓度或含量）的统一样品，每个样品平行测定6次以上，分别计算不同浓度或含量样品的平均值、标准偏差、相对标准偏差等各项参数。

　　实际样品的测定：

各验证实验室应对1～3个含量水平的同类型样品进行分析测试，按每个样品平行测定6次以上，分别计算不同样品的平均值、标准偏差、相对标准偏差等各项参数。

　　对各验证实验室的数据进行汇总统计分析，计算实验室间相对标准偏差、重复性限r和再现性限R。

3、准确度的验证

　　若各验证实验室使用有证标准物质/标准样品进行分析测定确定准确度，则需对1～3个不同含量水平的有证标准物质/标准样品进行测定，按全程序每个有证标准物质/标准样品平行测定6次以上，分别计算不同浓度或含量水平有证标准物质/标准样品的平均值、标准偏差、相对误差等各项参数。

　　若实验室对实际样品进行加标分析测定确定准确度，则需对每个样品类型的1～3个不同含量水平的统一样品中分别加入一定量的有证标准物质/标准样品进行测定，

　　每个加标样品平行测定6次以上，分别计算每个统一样品的加标回收率。

　　对各验证实验室的数据进行汇总统计分析，计算其相对误差或加标回收率的均值及变动范围。

三、方法验证的实施步骤  

方法验证的实施分两种情况:

首次使用的标准和在使用过程中更新版本的标准。

2.1首次使用的标准首先明确所选择的标准方法为最新有效版本。

其次，由技术管理者对实验室资源进行评估，包括人员（人员配备是否符合方法要求，人员是否经过相关培训、考核、授权）;设备（配备是否符合要

求，测量设备是否经过溯源）;材料（是否充足，是否满足使用要求/是否有效的验收或核查）;环境;样品;记录;以及确定是否需要编制作业指导书。

第三，组织技术验证工作。

结合标准的具体情况，对实验室能否达到方法的各项指标进行证实。

如检出限、回收率、正确度和精密度等。

此处建议，针对标准作出规定的指标进行技术验证。

如标准规定了允许差，则通过分析有证标准物质，看实验室的分析值与标值的差异是否符合允许差要求;如果标准规定了检出限，则通过多次空白试验（一般取10次以上测定值的3倍标准偏差所对应的浓度值作为方法的检出限）验证实验室所得到的检出限不大于标准的规定值。

第四，将标准和作业指导书（如果有）下发至检测现场，下发使用通知，确定方法可以投入使用，并明确正式投入使用的时间。

2.2更新版本的标准

CNAS－CL01:

2018中规定，若发布机构修订了方法，应在所需的程度上重新进行验证。

说法较为笼统，这一点可以参考A002化学领域的检测说明:

“当检测标准发生变更涉及到检测方法原理、仪器设施、操作方法时，需要通过技术验证重新证明正确运用新标准的能力”。

对于实验室正在使用的标准方法下发新版本后，首先应对新旧版本的标准进行核查比对，明确变更内容;必要时对人员进行重新培训，修订作业指导书。

其次，符合A002中的说法时，应由技术管理者组织进行技术方面的验证。

技术验证的重点是针对变更的项目，证明实验室仍能满足更新后的标准要求。

第三，将新版标准和作业指导书（如果有）下发至检测现场，同时注意回收旧版标准;下发通知，明确新版标准的投入使用时间。

方法验证实例：

色谱法方法验证

研究内容

操作过程

技术要点说明

方法摸索优化

目标优化梯度条件，确定分析波长。

1、样品溶剂选择；

2、滤膜吸附试验；

3、DAD检测器下，波长选择主成分最大吸收或平台处。

4、分离条件选择；

5、色谱柱对比；（根据情况酌定）

6、DAD检测器下，水、1mol/l酸、碱、氧（10%双氧水）、光照、高温破坏，各起始物料，中间体，辅料（制剂研究时需同时进行空白辅料破坏）等成分分离。

1、一般在无参考标准或标准的方法无法直接套用时,需进行此项研究内容，如3类药。

2、样品溶剂：

对样品有很好的溶解能力，实验室自然放置稳定存放12小时以上，与流动相有良好的互溶效果。

3、续滤液峰面积达稳定最大值，续滤液体积在5ml以下时较为适宜，否则需要重新筛选溶剂。

4、破坏程度10%左右（5%—15%）为宜，2mol/l酸或碱90℃水浴12小时无破坏即视为样品稳定，不必再追求降解度。

4500lx光照48小时，样品粉末及溶液需要同时做。

破坏后的样品溶液及空白溶剂均需调整至流动相pH方可进样，可避免对色谱柱产生不良影响。

如果破坏超过20%，需要降低破坏条件。

5、分离度良好，测定无干扰，各峰峰纯度符合单峰要求。

6、梯度变化要有最高洗脱能力过程，目的证明所有的杂质成分均能够被洗脱检测。

7、方法摸索优化实验一般是不上资料的，只是体现在实验记录本中，除非是没有方法依据时，如3类药申报时，梯度选择及波长选择等均需要在资料中体现。

8、方法优化完成后，最后在同一天同一人，用同一台机器，对所有样品进行分析测定，具有可比性。

9、方法摸索优化实验采用工艺已经确定的实验室小试、实验室放大样品进行，前期用于原料合成样品配合检测时，可以采用大范围的梯度洗脱进行模糊检测分析。

专属性

目的为了验证方法对目标成分检测的区分能力及全面的杂质分析评价。

DAD检测器或适宜的通用型检测器下，水、1mol/l酸、碱、氧（10%双氧水）、光照、高温破坏，各起始物料，中间体，辅料，各杂质对照品等在同一天进行分析，可以作为申报资料中杂质谱的论述内容。

1、参照上述过程进行破坏样品制备，空白及阴性样品都要做。

2、分离度良好，测定无干扰，各峰峰纯度符合单峰要求。

3、梯度要有最高洗脱能力过程。

4、以前期确定的分析条件及方法，在同一天同一人，用同一台机器，对所有样品进行分析测定，具有可比性。

5、本部分数据进资料，最佳采用生产线验证的第1批样品进行。

当色谱条件与有关物质检查方法相同时，专属性实验数据可以共用。

出图时主成分峰的紫外光谱图及峰纯度图均要出图。

检测限

信噪比法，S/N≥3倍时的浓度为检测限。

先进空白，再进对照品浓溶液（1mg/ml），在主峰相同位置处选择空白溶剂1—2min范围的基线积分得出峰高，按照峰高的3倍计算样品浓度，直接用浓溶液稀释至目标浓度附近即可，资料中体现至少3张图（空白溶剂、浓溶液、及稀释液）。

定量限

信噪比法，S/N≥10倍时的浓度为定量限。

按照基线峰高的10倍计算样品浓度，直接用检测限浓溶液稀释至目标浓度附近即可，连续进样6针，计算峰面积RSD<2%（可以放宽至5%），资料中体现6张图（6张稀释液）。

与检测限在同一天做，出图时纵轴标尺与检测限一致，减少审评员审图时的信息误导，提高审图效率。

线性与范围

5点或7点法，酌情设置。

第一个点在定量限浓度，中间点为100%浓度，最后一个点为200%浓度（160%或180%），必须采用稀释法，不得采用调整进样量的方式。

r>0.999。

采用对照品进行。

线性范围一定要将回收率试验的最高浓度包含进去，否则回收率浓度超过线性范围，缺乏定量依据，这个错误非常常见。

精密度

同一份供试品（样品）溶液，连续进6次。

计算峰面积RSD<2%，资料中体现7张图（1张空白，6张样品液）。

进资料的图谱必须采用生产线验证的第1批样品进行。

溶液稳定性

与精密度在同一天穿插进行，实验前进行良好的排序设置，能共用的图尽量共用减少工作量。

以下时间点必做（除非已知稳定性情况可减少时间点）。

0、4、6、8、10、12、18、24。

实验过程中可取精密度中的图作为2h或4h，甚至6h。

做7至8个时间点，在撰写申报资料时最后以6个数据填报。

溶液稳定性数据至少做到16h稳定（尽量做得更长时间，都是自动进样，一个过夜就至少在12小时以上，时间太短无法证明溶液稳定性），极特殊情况下可以采用低温进样器或特殊的保存方法或现配现分析等操作，但要求有数据作为支持依据，方可将特殊处理方法定入标准。

6个数据计算峰面积RSD<2%。

重复性

同一批号样品，同一人员同法操作分别称取2份对照品及6份供试品（样品）溶液，各进1次。

计算含量RSD<2%，资料中体现9张图（1张空白，2张对照，6张样品）。

进资料的图谱必须采用生产线验证的第1批样品进行。

中间精密度

同一批号样品，不同人员，不同设备，同法操作，分别称取2份对照品及6份供试品（样品）溶液，各进1次。

推荐次日操作，避免产生压针的疑问（万一审评老师没有注意到设备编号，所以别自找麻烦，推荐次日操作）。

对照品也要重新称取。

与重复性的6个数据，共同参与统计，计算12个含量数据结果，RSD<2%，资料中体现18张图，其中重复性9张，次日数据9张（1张空白，2张对照，6张样品）。

进资料的图谱必须采用生产线验证的第1批样品进行。

准确度

采用回收率试验方式进行，通常采用直接回收率实验法，按照80%、100%、120%比例分别称取样品，同法操作，每个比例各3份样品，各进1次。

以中间精密度的含量均值作为理论含量，计算回收率，回收率变动范围98%—102%，回收率RSD<2%，资料中体现12张图（1张空白，2张对照，9张样品）。

进资料的图谱必须采用生产线验证的第1批样品进行。

原料药采用直接回收率。

制剂采用加样回收率测定：

采用20片或粒制剂单位终产品混合研碎后，按比例称取进行加样回收，加样回收率采用80%、100%、120%比例，1:

1加入，加样回收率不能达标时（辅料有吸附或干扰较大时），方可采用直接回收率。

回收率变动范围98%—102%，回收率RSD<2%，资料中体现12张图（1张空白，2张对照，9张样品）。

耐用性实验

改变色谱柱

不同品牌的色谱柱，共3个品牌。

比较分离度，保留时间，含量测定结果。

如果品牌不足3个可采用多个批号或不同品牌多个批号的方式，不能采用废柱子进行实验。

最好在同一天对俩份样品溶液和俩份对照溶液进行。

3个品牌的色谱柱共15张图（每个色谱柱1张空白，2张对照，2个样品各1张），各条件下的含量数据（n=6）的RSD<2%。

进资料的图谱必须采用生产线验证的第1批样品进行。

流动相比例

流动相的低组分比例变化约±5%。

最好在同一天对俩份样品溶液和俩份对照溶液进行。

3个不同比例的流动相15张图（每个比例1张空白，2张对照，2个样品各1张），各条件下的含量数据（n=6）的RSD<2%。

进资料的图谱必须采用生产线验证的第1批样品进行。

最优标准条件的图谱每天都要重做，为了避免色谱柱效能下降或引起其他问题无法确认。

流速变化

流速±10%。

最好在同一天对俩份样品溶液和俩份对照溶液进行。

3个不同流速的流动相15张图（每个比例1张空白，2张对照，2个样品各1张），各条件下的含量数据（n=6）的RSD<2%。

进资料的图谱必须采用生产线验证的第1批样品进行。

最优标准条件的图谱每天都要重做，为了避免色谱柱效能下降或引起其他问题无法确认。

不同

pH

pH值±0.2

最好在同一天对俩份样品溶液和两份对照溶液进行。

3个不同pH的流动相15张图（每个比例1张空白，2张对照，2个样品各1张），各条件下的含量数据（n=6）的RSD<2%。

进资料的图谱必须采用生产线验证的第1批样品进行。

最优标准条件的图谱每天都要重做，为了避免色谱柱效能下降或引起其他问题无法确认。

柱温

柱温±5℃

25℃、30℃（或最优参数）、35℃

最好在同一天对俩份样品溶液和一份对照溶液进行。

3个不同温度15张图（每个比例1张空白，2张对照，2个样品各1张），各条件下的含量数据（n=6）的RSD<2%。

进资料的图谱必须采用生产线验证的第1批样品进行。

最优标准条件的图谱每天都要重做，为了避免色谱柱效能下降或引起其他问题无法确认。

0天样品检测

方法学研究结束且各项考察数据符合要求后，对3批生产线验证样品及被仿品在同一天进行检测。

此数据在申报资料产品检验报告单中体现，且可作为稳定性的0天数据。

双样双针。

对照品也为双样双针。