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本科生毕业设计（论文）

开题报告

题目：

中药菊花有效成分的提取及含量测定

姓名：

冷晶

学号：

************

*******

班级：

药剂051班

所在院系：

生命科学与工程学院

本科生毕业设计（论文）开题报告考核

一、导师对开题报告的评语：

指导教师200年月日

成绩

二、开题报告答辩评语及成绩:

答辩小组负责人200年月日

开题报告

一课题名称：

中药菊花有效成分的提取及含量测定

二选题目的及意义

随着中药研究的不断深入，中药现代化得到不断推进，中药所含物质研究的现代化和中药质量控制的现代化成为当前中药现代化研究的两个重要方面。

中药菊花为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat的干燥头状花序,以产于浙江的杭白菊最负盛名，享誉全国各地及东南亚地区，是国家卫生部第一批批准的药食同源的道地药材之一，具有散风清热、平肝明目的作用,临床应用广泛。

其主要含挥发油、黄酮类有效成分，本课题旨在利用现代科学的理论方法和技术对杭白菊的两类主要活性成分进行含量测定，并对提取工艺进行研究，同时考察不同种植基地、不同采摘时间、不同炮制工艺及不同等级的杭白菊中有效成分含量变化，从而有助于更好的对杭白菊的质量进行控制以及更合理的开发利用。

三研究背景

（一）2005版药典对菊花的介绍

1.性状

菊花为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序。

9-11月花盛开时分批采收，阴干或焙干，或熏、蒸后晒干。

药材按产地和加工方法不同，分为“毫菊”、“滁菊”、“贡菊”、“杭菊”。

我们以杭菊为研究对象，提取其挥发油，并用气相色谱法鉴定其主要成分。

2005版中国药典第一部上记载：

亳菊，呈倒圆锥形或圆筒形，有时稍压扁呈扇形，直径1.5-3cm，离散。

总苞碟状；总苞片3-4层，卵形或椭圆形，草质，黄绿色或褐绿色，外面被柔毛，边缘膜质。

花托半球形，无托片或托毛。

舌状花数层，雌性，位于外围，类白色，劲直，上举，纵向折缩，散生金黄色腺点；管状花多数，两性，位于中央，为舌状花所隐藏，黄色，顶端5齿裂。

瘦果不发育，无冠毛。

体经，质柔润，平时松脆。

气清香，味甘、微苦。

滁菊，呈不规则球形或扁球形，直径1.5-2.5cm。

舌状花类白色，不规则扭曲，内卷，边缘皱缩，有时可见淡褐色腺点；管状花大多隐藏。

贡菊，呈扁球形或不规则球形，直径1.5-2.5cm。

舌状花白色或类白色，斜升，上部反折，边缘稍内卷而皱缩，通常无腺点；管状花少，外露。

杭菊，呈碟形或扁球形，直径2.5-4cm，常数个相连成片。

舌状花类白色或黄色，平展或微折叠，彼此粘连，通常无腺点；管状花多数,外露。

2.鉴别方法

取本品1g，剪碎，加石油醚20ml，超声处理10分钟，弃去石油醚，药渣挥干，加稀盐酸1ml与乙酸乙酯50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。

另取绿原酸对照品，加乙醇制成每1ml含0。

5mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法（附录ⅥB）试验，吸取上述两种溶液各0.5-1μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（1:

15:

1:

1:

2）的上层溶液为展开剂，展开，取出。

晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

3.含量测定

照高效液相色谱法（附录ⅥD）测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液〔取磷酸二氧纳（NaH2PO4·2H2O）15.6g，加水至1000ml．制成0.1molL的溶液，加入磷酸适量，使pH值为2.7〕-甲醇（70:

30）为流动相；检测波长为328nm。

理论板数按绿原酸峰计算应不低于2500。

对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，置棕色量瓶中，加水制成每1ml含0.2mg的溶液，即得（10℃以下保存）。

供试品溶液的制备取本品粉末（过一号筛）约1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流2小时，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，蒸干，残渣加三氯甲烷5m1，浸渍3分钟，弃去三氯甲烷液，残渣挥去三氯甲烷、加水适量使溶解，并转移至5ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得（应于当日测定）。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品按干燥品计算，含绿原酸（C16H18O9）不得少于0.20％。

（二）菊花挥发油中的主要成分

包括脂肪族、单萜、倍半萜及含氧衍生物。

单萜、倍半萜的含氧衍生物多具有较强的生物活性和香气,是医药、化妆品和食品工业的重要原料。

刘伟等采用毛细管柱气相色谱-质谱技术对菊花的挥发油的化学成分进行了初步研究,鉴定出二十余种萜烯类化学成分:

α-侧柏烯、β-菲兰烯、χ-菲兰、γ-松油烯、1,8-桉叶素、叔丁基苯、χ-萜品烯、蒲勒烯、优葛缕酮、樟脑、龙脑、异龙脑、醋酸冰片酯、芳樟醇、β-石竹烯、β-榄香烯、假紫罗酮、γ-松油醇、Dihgdrkhusilol等;并指出因产地及加工炮制方法的不同,挥发油的成分不同,导致其药效不同。

黄保民等利用毛细管气相色谱-质谱-计算机联用技术研究怀菊挥发油的化学成分,鉴定了45个化合物,主要成分是β-菲兰烯、对聚伞花烯、菊烯酮、1,8-桉油精、冰片及桧烯等。

周维书等采用气相色谱-质谱-计算机联用技术对香菊挥发油成分进行了质谱分析,测定了香菊挥发油含a-蒎烯（16.6%）、樟烯（12.47%）、异缬草酸丁酯（6.8%）、冰片（4.42%）、γ-桉醇（7.25%）、松油醇（4.12%）等为主的43个成分。

其中异领缬草酸丁酯、苦橙油醇、γ-桉醇在常用药用菊花或野菊花中很少发现,这三个挥发油成分占挥发油总重的15.88%,能代表香菊的独特香气。

（三）菊花挥发油的主要药理作用

1.抑菌作用

现有研究认为挥发油是菊花抗菌作用的物质基础,其中的樟脑、龙脑则是其发挥抗菌作用的主要成分。

李英霞等对不同产地的菊花挥发油的抑菌作用进行了研究。

结果发现,不同产地的菊花对金黄色葡萄球菌、白葡菌、变形杆菌、乙型链球菌、肺炎链球菌均有一定的抑制作用,尤其对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最明显。

2.抗肿瘤作用

菊花挥发油中含有较多的β-榄香烯,而β-榄香烯具有广谱抗肿瘤等广泛的药理作用。

国家一类新药β-榄香烯乳剂已用于癌症病人的临床治疗。

因此菊花挥发油部位具有潜在的抗肿瘤作用。

3.其他作用

丁香烯具有平喘作用,是治疗老年性慢性支气管炎的有效成分之一;1,8-桉叶素和蒎烯均有较强的抗炎和祛痰作用。

（四）气相色谱法简介

气相色谱法（GasChromatography，GC）是一种重要的分离分析方法。

这种技术广泛应用于石油化工医药卫生等许多领域。

在药物的原料中间体成品制剂分析、中药成分的分离分析、药物代谢研究、毒物分析及环境检测等方面，GC是必不可少的工具。

它是采用气体为流动相（载气）流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。

物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。

1.原理

气相色谱法的分离原理基于物质在流动气体和固定相两相分配的不同而导致分离。

载气经减压阀减压后进入净化干燥器，通过汽化室进入色谱柱。

试样由进样器进入汽化室，则液体试样立即汽化为气体并被载气带入色谱柱。

因色谱柱中的固定相对试样中不同组分的吸附能力或溶解能力不同，从而使试样中各种组分彼此分离而先后流出色谱柱，并进人检测器，检测器得到不同组分的浓度（或质量）变化转变为电信号，并经放大器放大通过记录仪即可得到色谱图。

由组分及其浓度即检测器输出的样品信号（电压或电流）随时间变化的曲线成为色谱图。

如果分离完全则每个色谱峰代表一种组分，并且根据色谱峰的位置可进行定性分析；根据色谱峰的面积或高度可进行定量分析；根据色谱峰的峰宽和峰间距可评价色谱柱的分离效能和考察操作条件是否恰当等因素。

2.分类

在GC中，流动相是气体，固定相是固体吸附剂（气-固色谱法，gas-solidchromatography，GSC）或涂在惰性固体表面的液膜（气-液色谱法，gas-liquidchromatographyGLC）。

其中以GLC应用最为广泛。

3.特点

气相色谱具有高选择性、高灵敏度和高分辨率。

高选择性指GC能分离结构极为相似的异构体（位置异构、结构异构和空间异构）等，并可用于制备色谱纯物质。

高灵敏度是指GC可测定ppm、ppt级的物质。

高分辨率是指GC的一般填充柱约为每米2000理论塔板数，而毛细管柱可达每米105～1O7理论塔板数。

4.气相色谱法测定挥发油的缺点

所选用的指标成分不能代表组成复杂的挥发油，实验的结果完全取决于所选用的指标成分的稳定性如何，因此从挥发油组成成分性质差异大的角度考虑，至少需要2种或2种以上的化学成分，其中一种的极性较大（挥发性较小），另一种极性较小（挥发性较大），根据2个不同性质的化学指标的稳定性实验结果综合评价挥发油整体的稳定性情况。

同理，在制剂工艺考察，成药制剂质量控制等方面，也应该考虑选用2种或2种以上的极性差异较大的化学成分，使评价结果更客观真实。

三实验方案初定

（一）菊花中挥发油的提取

1.提取方法

1）2005版药典中的提取方法

取一定碎度的菊花100g，精密称定（准确至0.01g），置2000mL圆底烧瓶中，参照2005版《中国药典》I部附录XD，加水800mL与玻璃珠数粒，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止，置电热套中加热至沸，调温并保持微沸5h，停止加热，放置片刻，开启测定器下端活塞将水缓缓放出，收集挥发油，无水硫酸钠脱水，得到淡黄色挥发油，精密称重，计算提取率。

2）超声波提取法

将100g菊花磨碎后置于烧杯中，加入7倍量的水，用超声波振荡处理，超声频率40Hz、超声处理时间25min、冷却至室温，用45℃加热提取完毕后，过滤收集挥发油并称重，挥发油为蓝色，具有特殊香味，收率为0.32mL／100g.

3）索氏提取法

取杭白菊20克，剪碎，置索氏提取器中，加乙醚300mL，55℃水浴加热5h，回收乙醚，得到浸膏。

浸膏用乙醇热提取，放冷过滤，回收乙醇，出净油量较少。

2.菊花挥发油提取的单因素实验

前期预实验研究发现，菊花挥发油得率与其粉碎度、加水量、浸泡时间、蒸馏时间有关系，因此首先通过单因素实验考察提取菊花挥发油的工艺条件。

1）粉碎度对菊花挥发油提取率的影响

设菊花粉碎度为整棵、剪段、20～40目、40～6o目、60～80目、80～100目、100目以上，10倍加水量，2h浸泡时间，5h蒸馏时间下进行水蒸气蒸馏提取，称量并计算提取率。

根据扩散定律：

药材粉碎度愈细，浸出效果愈好，成分得率愈高。

2）加水量对菊花挥发油提取率的影响

设加水量为8，10，12，14，16，18，20倍，粉碎度为粉碎的混合颗粒，浸泡2h，蒸馏5h下进行水蒸气蒸馏，称重并计算提取率。

3）浸泡时间对菊花挥发油提取率的影响

设浸泡时间为0，2，4，6，8，10，12h，粉碎度为粉碎的混合颗粒，10倍加水量，蒸馏5h下进行水蒸气蒸馏，称重并计算提取率。

4）蒸馏时间对菊花挥发油提取率的影响

设蒸馏时间为3．5，5，7，9，10，11，13，15h，粉碎度为粉碎的混合颗粒，10倍加水量，2h浸泡时间下进行水蒸气蒸馏，称重并计算提取率。

3.提取工艺参数的优化一正交实验

正交实验设计根据单因素结果，以挥发油提取率为评定指标，选择菊花粉碎度（A）、浸泡时间（B）、加水量（C）和蒸馏时间（D）为考察因素，每个因素3个水平，选用L9（34）正交表，实验安排见表。

水平

A

B

C

D

粉碎度/目

浸泡时间t/h

加水量/倍

蒸馏时间t/h

1

20～40

2

10

7

2

40～80

6

12

10

3

80～100

10

14

13

（二）菊花挥发油中樟脑、龙脑、β一榄香烯等的气相测定

1.色谱条件

方案一:

DB-1毛细管柱（30m×0.32mm×0.25µm）;程序升温从70℃以4℃/min升至100℃,再以10℃/min升至150℃,最后以30℃/min升至250℃;无分流进样时间1min;分流比10∶1;氢火焰离子化检测器（FID）;进样口温度为220℃;载气为氮气,体积流量:

2.0mL/min,空气的体积流量为500mL/min,氢气的体积流量为50mL/min;进样量:

1µL.

方案二：

AgilentHP-5毛细管色谱柱（30m×0.32mm×0.25µm）。

程序升温从70℃以2.5℃/min升至140℃，再以10℃/min升至260℃，气化室温度280℃，检测器FID温度300℃，分流比20：

1，氮气流速1mL/min，空气350mL/min，氢气70mL/min.

2.内标物

选用正辛醇为樟脑、龙脑内标，正十四烷作为β-榄香烯的内标。

3.内标溶液的制备

精密称取正辛醇26．2mg、正十四烷267．8mg，用正己烷溶解并定容至10mL，作为内标储备液，该储备液再以正己烷稀释成0．655mg/mL正辛醇和6．695mg/mL正十四烷的内标溶液。

4.对照品储备液的制备

分别精密称取樟脑11．9mg、龙脑13．3mg、β-榄香烯80．0mg，以正己烷溶解并定容至一定体积，分别制成5．950mg/mL、1．662mg/mL及l6．O0mg/mL的对照品储备液，摇匀，备用。

5.供试品溶液的制备

按药典法提取所得挥发油，用正己烷溶解并定容至2mL，精密量取0．8mL置1mL量瓶中，精密加入内标溶液0．1mL，用正己烷定容至刻度，摇匀。

6.标准曲线的制备

从对照品储备液中分别精密移取樟脑溶液120µL、龙脑溶液220µL、β-榄香烯溶液1250µL，加入内标溶液200µL，以正己烷定容于2mL量瓶中。

再依次稀释2，4，8，16倍，并添加内标保持内标浓度恒定。

取1µL进样，以上述色谱条件测定。

以对照品浓度（C）为纵坐标，对照品峰面积与相应内标物峰面积之比（X）为横坐标进行线性回归。

7.仪器精密度实验

取6.项下稀释4倍的溶液测定，按上述色谱条件进样1µL测定峰面积，计算对照品峰面积与相应内标峰面积之比。

8.重复性实验

取同一样品5份，平行提取，测定。

9.稳定性实验

取同一份供试品溶液，于0，1，3，7，24h分别进样，计算待测成分峰面积与相应内标峰面积之比。

10.回收率实验

采用加样回收率实验，精密称取已测知含量的菊花样品（杭白菊）9份，每3份一组，按高、中、低3个水平分别精密加入一定量对照品，按5.供试品溶液制备项下操作，进样，计算回收率。

11.样品的含量测定

按药典法提取挥发油，按5.制备样品溶液，精密量取1L进样，内标法计算样品中各成分含量。

四时间安排

周次

设计（论文）任务及要求

１～３周

收集实验相关资料,制定实验方案

４周

购买药材、试剂准备实验

５～１７周

进行实验

１８周

撰写论文

１９周

进行答辩

五需要的仪器与试剂

1.仪器

仪器

型号/规格

数量

挥发油测定器（油比水轻型）

1ml

2个

气相色谱仪

1台

超声仪

1台

万能粉碎机

1台

电子分析天平

1台

标准筛

若干

电热套

2台

水浴锅

1台

球形冷凝管

2个

锥形瓶

50ml、100ml、250ml

若干

烧杯

若干

索氏提取器

1个

圆底烧瓶

2000ml

2个

2.药材

名称

产地

杭白菊

亳菊

怀菊

贡菊

3.试剂

对照品

樟脑、龙脑、β一榄香烯

试剂

正辛醇、正十四烷、正己烷、乙醚、无水硫酸钠

参考文献

[1]药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:

化学工业出版社.2005.

[2]段崇霞,张正竹.四大药用菊花功能成分的比较研究[J].安徽农业大学学报,2008,35

（1）:

992105.

[3]张菲菲,马永建,孙桂菊等.菊花挥发油提取工艺研究[J].时珍国医国药,2008,19（4）:

834.

[4]蒋惠娣,李福高,曾苏.毛细管气相色谱法测定菊花中樟脑、龙脑及β-榄香烯的含量[J].药物分析杂志ChinJPharmAnal2005,25（5）:

508.

[5]张晓媛,段立华,赵丁.菊花化学成分及药理作用的研究[J].时珍国医国药,2008,19（7）:

1702.

[6]郑琦,方悦.气相色谱技术在中药指纹图谱中的应用[J].浙江中西医结合杂志,2008,18（11）:

713.