酶促反应动力学实验教案.docx

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酶促反应动力学实验教案

生物化学实验（上）

实验一酶促反应动力学实验

·底物浓度对酶活性的影响

·pH对酶活性的影响

·温度对酶活性的影响

华中科技大学生命科学与技术学院

2014级生物化学小老师第一组

酶促反应动力学综合实验

实验

（一）——碱性磷酸酶Km值的测定

【实验目的】

1.了解底物浓度对酶促反应速率的影响

2.掌握米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km的方法。

【实验原理】

1.米氏方程：

（1）

式中：

v表示酶促反应速率，

表示酶促反应最大速率，

[S]表示底物浓度，

Km表示米氏常数。

v=Vmax×[S]/（Km+[S]），这个方程称为Michaelis-Menten方程，是在假定存在一个稳态反应条件下推导出来的，其中Km值称为米氏常数，Vmax是酶被底物饱和时的反应速度，[S]为底物浓度。

由此可见Km值的物理意义为反应速度v达到1/2Vmax时的底物浓度（即Km=[S]），单位一般为mol/L，只由酶的性质决定，而与酶的浓度无关。

可用Km的值鉴别不同的酶。

当底物浓度非常大时，反应速度接近于一个恒定值。

在曲线的这个区域，酶几乎被底物饱和，反应相对于底物S是个零级反应。

就是说再增加底物对反应速度没有什么影响。

反应速度逐渐趋近的恒定值称为最大反应速度Vmax。

米氏常数Km是酶促反应速度v为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。

这可通过用[S]取代米氏方程中的Km证明，通过计算可得v=Vmax/2。

2.Km值的测定主要采用图解法，有四种：

①双曲线作图法（图a）

根据公式

（1），以v对[s]作图，此时1/2

时的底物浓度[s]值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。

这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。

实测

一个近似值，因而1/2

不精确。

此外由于v对[S]的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。

②Lineweaver-Burk作图法—双倒数作图法（图b）

实际工作中，常将米氏方程（式

（1））作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、精确得多。

其中之一即取

（1）式的倒数，变换为Lineweaver-Burk方程式：

（2）

以

对

作图，即为y=ax+b形式。

此时斜率为

，纵截距为

。

把直线外推与横轴相交，其截距即为—

。

③Hofstee作图法（图略,不要求）

把

（2）式等号两边乘以Vmax，得：

（3）

以v对

作图，这时斜率为

，纵截距为

，横截距为

。

④Hanas作图法（图略，不要求）

把

（2）式等号两边乘以[S],得：

（4）

以v对

作图，这时斜率为

，纵截距为

。

（a）（b）

本实验主要以双倒数法，即Lineweaver-Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。

具体原理如下：

本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下，准确反应15分钟。

在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长660nm比色。

在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。

反应式如下：

然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度（思考分析这样处理的原理及合理性），即以光密度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。

【仪器与试剂】

仪器：

1.恒温水浴锅；

2.721型分光光度计；

3.试管；

4.吸量管；

5.移液枪；

6.烧杯。

试剂：

1.酚试剂

2.2.5mM磷酸苯二钠基质液

3.碱性缓冲液（pH10.0）

4.碱性磷酸酶

【注意事项】

1.加入碱性磷酸酶的量要准确，并且提前进行预热。

2.保温时间要准确，不同试管加热时间须保持一致，注意计时方法。

3、磷酸苯二钠为2.5mmol/L，注意与后两个试验区分。

4、使用分光光度计和移液枪时注意操作步骤。

【实验步骤】

取6支试管按下表加入试剂：

0号管切勿加酶！

0

1

2

3

4

5

2.5mM磷酸苯二钠（mL）

1.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

蒸馏水（mL）

0.2

0.8

0.6

0.4

0.2

------

碱性缓冲液（pH10.0）（mL）

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

混匀后，37℃预温5分钟。

注意：

碱性磷酸酶溶液应先放于水浴锅中预热达到37℃，再滴加到试管中参与反应

碱性磷酸酶液（mL）

------

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

混匀后，37℃水浴15分钟（准确计时）。

注意：

1）加入碱性磷酸酶液要快速、准确。

（用移液枪加）

2）酶促反应溶液总体积2.2mL。

3）第0管不加酶，基本无反应。

酚试剂（mL）

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

10%Na2CO3（mL）

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

混匀后，37℃水浴15分钟（准确计时）。

注意：

1）酚试剂为显色剂，同时为酶的变性剂，故加入酚试

剂后酶促反应停止。

2）Na2CO3提供碱性环境，加入Na2CO3后试剂才显

色，37℃水浴使显色充分。

以0号管调零，在660nm波长处比色。

【结果处理】

1．将各管光密度和底物浓度记入下表:

管号

1

2

3

4

5

O.D1

O.D2

O.D3

O.D（均值）

1/O.D

[S]请自行计算

1/[S]

2．以1/O.D为纵坐标，1/[s]为横坐标，按Lineweaver-Burk作图，求出碱性磷酸酶的Km值,并分析实验结果。

实验

（二）——PH对酶活性的影响

【实验目的】

了解PH对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。

【实验原理】

大部分酶活力受其环境pH的影响。

在一定的pH下，酶反应具有最大速度，高于或低于此值，反应速度下降，通常称此pH值为酶反应的最适pH。

不同的酶具有不同的最适pH。

【仪器与试剂】

仪器：

1.恒温水浴锅；

2.试管和试管架；

3.移液枪及枪头；

4.721型分光光度计；

5.移液管。

试剂：

1、0.01M磷酸苯二钠。

2、碱性磷酸酶液（pH=10）。

3、不同pH缓冲液。

4、酚试剂和10%Na2CO3溶液。

【注意事项】

1、碱性磷酸酶溶液应先放于水浴锅中预热达到37℃，再滴加到试管中参与反应

2、注意磷酸苯二钠为0.01mmol/L，与实验一不同

【实验步骤】

取六支洁净试管，编号后按表操作：

管号

0

1

2

3

4

5

0.01M磷酸苯二钠（mL）

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

缓冲溶液

蒸馏水

1.2mL

pH9

1.0mL

pH10

1.0mL

pH11

1.0mL

pH12

1.0mL

pH>12

1.0mL

混匀，置于37℃水浴5min。

注意：

碱性磷酸酶溶液应先置于水浴锅中预热到37℃，再滴加到试管中参与反应

碱性磷酸酶液（mL）

-----

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

混匀，再置于37℃水浴15min。

酚试剂（mL）

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

10%Na2CO3（mL）

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

混匀后，置于37℃水浴中再次保温15min，然后以第0管调零点，用660nm波长比色。

以各管pH为横坐标，光密度为纵坐标绘制曲线，从曲线上可大致得出碱性磷酸酶的最适pH。

【结果处理】

记录现象（或比较吸光度值），以pH为横坐标、吸光度为纵坐标制图，根据图象做出合理分析。

实验（三）——温度对酶活性的影响

【实验目的】

了解温度对酶活性及酶促反应速率的影响，加深对酶特性的认识。

【实验原理】

每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低。

一般而言，若酶处于过高的温度环境中，会使酶活性永久丧失；而若处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶又会全部或部分的恢复其活性。

【仪器与试剂】

仪器：

1.恒温水浴锅；

2.试管和试管架；

3.移液枪及枪头；

4.721型分光光度计；

5.移液管。

试剂：

1．碱性缓冲液：

同实验一中碱性缓冲液配制（pH=10）；

2．0.01M磷酸苯二钠；

3．酚试剂；

4．碱性磷酸酶液；

5．10%Na2CO3溶液；

【注意事项】

1.加入碱性磷酸酶的量要准确。

2.保温时间要准确，注意计时方法。

3.将试管从水浴锅中拿出后再加入酚试剂和碳酸钠溶液，立即摇匀之后在室温下放置15min。

【注意事项】

1.加入碱性磷酸酶的量要准确，并且提前放入不同温度水浴锅中进行预热。

2.对反应温度的控制要严格，不同温度下反应的时间必须保证一样，建议每隔一分钟向装有底物的试管中加入酶液，便于用秒表计时。

3.将试管从水浴锅中拿出后再加入酚试剂和碳酸钠溶液，立即摇匀之后在室温下放置15min。

4、注意磷酸苯二钠为0.01mmol/L，与实验一不同

【实验步骤】

取6支洁净试管，参照下表加入试剂：

0

1

2

3

4

5

0.01M磷酸苯二钠（mL）

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

碱性缓冲液（mL）

1.2

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

混匀后，将0~5管分别置于室温、37℃、50℃、60℃、70℃和80℃中水浴5min；

注意：

碱性磷酸酶溶液应先放于不同水浴锅中预热，再滴加到试管中参与反应

碱性磷酸酶液（mL）

------

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

混匀后，继续原温度水浴加热15min（准确计时）。

酚试剂（mL）

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

10%Na2CO3（mL）

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

混匀后，室温放置15min后，以第0管调零，用660nm波长比色。

再以温度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制曲线。

从曲线上可得出此实验条件下碱性磷酸酶的最适温度。

【结果处理】

记录现象（或比较吸光度值），以温度为横坐标、吸光度为纵坐标制图，根据图象做出合理分析

【思考题】

1.反应时间15min是经过实验得出的较好结果，试分析时间长了或短了会有何影响?

2.回答实验原理中括号中的思考题

3.第二个实验中两次水浴的目的分别是什么，去掉其中一个行不行，为何？

附录仪器操作规范与注意事项

移液枪使用注意事项：

1.不使用时，请竖直放置；

2.枪头为一次性，可多次吸取同一种液体，不可吸取不同液体；

3.吸液时，拇指向下压到有阻力，然后轻轻释放（一定不能松开拇指），防止液体因惯性冲入移液管；

4.吸液时，枪头内不能有气泡。

规范操作：

取移液枪调至所需加液用量，套上枪头，大拇指摁下按钮到刚有阻力时将枪头伸入液体中，轻轻吸上液体，放出液体时按钮按到底即可。

移液管使用注意事项：

1.使用前必须清洗干净，用吸水纸将尖端内外的水除去，然后用待吸溶液洗三次，洗的时候，吸取液体约占管身的三分之一，将移液管润洗即可。

洗过的溶液应从流液口放出弃之。

2.吸收溶液时，管尖应深入液面10-20mm,并随液面下降而下降，用洗耳球在移液管另一侧将液体吸入管中，（切忌用嘴吸）吸液时，手应慢慢放松洗耳球，避免让移液管内液体上升太快导致液体冲入洗耳球中；另外不要让液面升得太高，使管壁沾附过多的液体，以免在调定液面和排液时流下来，影响容量的准确度。

3.调定液面或放液时吸管均应垂直放置，其流液口与容器内壁相接触，接受容器须倾斜30°，移液管者始终保持垂直。

为保证液体完全流出，要等待约3秒钟，方可拿开。

4.吸管内的溶液按规定方法排出后，移液管尖嘴的残留液，如果移液管上没有标明“吹”的字样，不能排到接受容器中，若有，则用洗耳球将剩余液体吹入。

注：

当吸取有毒或腐蚀性液体，可选用有安全泡的吸管，并使用吸具（如洗耳球等）操作

移液管规范操作：

使用移液管前，先看移液管上的标记，刻度线位置，检查管头是否损坏。

润洗时，先慢慢吸入移液管长度的1/3左右，将移液管横置，并转动移液管使溶液接触到刻度线以上的部分，进行润洗。

随后将溶液由管下口弃去，并用洗耳球吹去残余液体。

反复润洗三次。

分光光度计使用步骤

一.预热

使用前插上插头。

打开开关，预热20min。

二.选定波长

三．调零：

1.将黑色比色皿和参比液放入培养皿内，并将黑色培养皿拉入光路，按模式键调至T，按0%键将透光率调为0。

2.拉动伸缩杆，将参比液拉入光路，按100%键，将透光率调为100。

3.再按模式键调至A模式，显示屏显示0.00即可。

四．样品测定

将待测样品拉入光路，显示屏上的示数即为光密度值。

保持光路中的样品不变，打开盖子，再将盖子盖上，则再次读出光密度值，重复测量三次，取其平均值，即为该样品的光密度值。

五．实验完毕

清理仪器，将比色皿洗干净，用滤纸吸干，再用擦镜纸顺一个方向擦干，放入盒子内。

最后关闭电源，拔掉插头。

注意事项：

1.预热和不测定时应将暗箱盖打开，以延长光电管寿命

2.测定系列溶液时，应从稀到浓的顺序

3.读数应在0.1-1.0间.

4.注意调零校准。

5.注意若分光计示数不稳定，立即检查比色皿是否干净，波长是否为660nm。

使用比色皿注意事项：

1.比色皿应轻拿轻放，以免打碎，拿比色皿时，应拿比色皿的毛玻璃面；

2.使用同一规格的两个比色皿；

3.装样时，要润洗2-3次，测定时样品装液高度在比色皿3/4处，比色皿外液体要用吸水纸吸干并用檫镜纸顺一个方向擦拭干净；

4.润洗前先用蒸馏水灌洗3次，润洗（注意润洗时节约使用样品）；

5.润洗后加液，加液后用擦镜纸的光滑面擦干光学面，毛玻璃面也不要有液体，最后对着光观察，光学面污渍无纸纤维，毛玻璃面无水渍即合格；

6.清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。

每次做完实验时，应立即洗净比色皿；

7.清洗完毕后用擦镜纸沿一个方向将其擦干净，光学面朝上放于比色皿盒中