赤芍中赤芍总苷的提取与纯化.docx

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赤芍中赤芍总苷的提取与纯化

赤芍中赤芍总苷的提取与纯化

一、项目概述：

赤芍为毛莨科植物芍药（PaeonialactifloraPall．）或川赤芍（PaeoniaveitchiiLynch）的干燥根，赤芍总苷（totalpaeonyglycoside，TPG）是其主要活性成分，主要包括芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷等单萜类化合物，其中芍药苷、芍药内酯苷含量较高。

现代药理研究表明，赤芍总苷具有广泛的药理作用，主要表现在抑制血小板聚集、抗凝血、抗血栓、抗动脉粥样硬化等作用。

本实验采用高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography，HPLC）法对工艺过程中芍药苷、芍药内酯苷的含量同时进行测定，对赤芍的提取纯化工艺进行考察，进而为进一步控制赤芍总苷的质量提供实验依据。

二、实验目的：

1.掌握赤芍总苷的提取分离工艺；

2.掌握高效液相色谱仪的使用原理及操作方法；

3.掌握大孔吸附树脂分离的原理及操作方法。

三、实验器材

（一）仪器

高效液相色谱仪，玻璃柱，旋转蒸发仪，真空干燥器、电子分析天平，高效液相色谱仪，旋转蒸发仪，超声仪1000ml圆底烧瓶，冷凝管，烧杯、铁架台，橡胶软管、HPLC、容量瓶

（二）试剂

大孔吸附树脂D10l,AB-8；分析纯；95％乙醇、70％乙醇、30％乙醇、芍药苷对照品、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、甲酸、5％香草醛硫酸溶液、0.05mol/L磷酸二氢钾溶液、硅胶G；赤芍药材粉末（川芍），柱层析硅胶，正丁醇，2%乙酸铅，盐酸，淀粉，碘滴定液，蒸馏水

四、实验内容：

（一）赤芍药材的质量检查

根据《中华人民共和国药典》2015年版一部赤芍项下的项目对赤芍药材进行质量检查。

1.性状

本品呈圆柱形，稍弯曲，长5—40cm，直径0.5—3cm。

表面棕褐色，粗糙，有纵沟和皱纹，并有须根痕和横长的皮孔样突起，有的外皮易脱落。

质硬而脆，易折断，断面粉白色或粉红色，皮部窄，木部放射线纹理明显，有的有裂隙，气微香，味微苦，酸涩。

2.鉴别

1）本品横切面：

木栓层为数列棕色细胞。

栓内层薄壁细胞切向延长。

韧皮部较窄，形成层成环，木质部射线较宽，导管群作放射状排列，导管旁有木纤维。

薄壁细胞含草酸钙簇晶，并含淀粉粒。

2）取本品粉末0.5g，加乙醇10ml，振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。

另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各4µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40：

5：

10：

0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。

3.检查

1）水分：

按《中国药典》2015年版项下操作,取本品粉末约1g,平铺于恒重的扁形称量瓶中,厚度<5mm,精密称定,打开瓶盖100~105℃烘5小时,盖好,移至干燥器中冷却30分钟,精密称定,同样温度下在烘1小时移至干燥器中冷却30分钟,精密称定。

直至连续两次称定重量之差<5mg为止。

按减失重量和称样量计算供试样品中水分含量（%）。

2）总灰分：

取本品粉末约1g,置已炽灼至恒重的坩埚中,精密称定,缓缓炽灼至完全炭化,放冷至室温;加硫酸0.5ml使湿润,低温加热至硫酸蒸汽除尽后,在500-600℃炽灼使完全灰化,移置干燥器内,放冷至室温,精密称定后,再在500~600℃炽灼至恒重。

3）重金属检查：

取本品1.0g，按《中国药典》2015年版重金属检查法二法炽灼破坏,检查10批样品,并同时做空白试验,标准管含Pb10ppm。

4）砷盐检查：

取本品1g,精密称定,置坩埚内,按炽灼残渣法操作,使样品完全灰化,加盐酸5ml与水21ml,溶解残渣,收集溶解液,按砷盐检查法第一法（《中国药典》2015年版）检查,标准管含砷2μg。

4.含量测定：

照高效液相色谱法（通则0512）测定。

色谱条件与系统适用性试验：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（40：

65）为流动相；检测波长为230nm。

理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：

取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：

取本品粗粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，浸泡4小时，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定，即得。

本品含芍药苷（C23H28O11）不得少于1.8%。

（二）赤芍总苷的提取

赤芍粗粉100g

加入8倍量70﹪乙醇，三次，

每次浸取1h

药渣滤液

回收乙醇

减压浓缩

浸膏

1.提取方法：

赤芍中所含丰富的苷类成分总称赤芍总苷，为赤芍的主要活性部位，其中以芍药苷的含量最高，选择芍药苷作为含量测定的指标成分。

因此通常采用正交试验设计法。

分别取药材若干（通常800g），以不同的提取液（水、乙醇）分别按正交试验设计表试验，滤过，合并滤液，量取体积，即得正交试验各试验的提取液。

本实验以乙醇为提取液提取赤芍总苷。

2.影响因素筛选：

1）溶媒的选择

赤芍中所含苷类成分极性较大，在水、乙醇等亲水性溶剂中溶解度较好。

本实验以芍药苷的含量为评价指标，考察水和不同浓度的乙醇对芍药苷的提取效率，筛选赤芍药材的最佳提取溶媒，见表1

表1 不同提取溶媒芍药苷含量

实验结果显示，以70％乙醇作为提取溶媒时，提取液中芍药苷含量最高，故确定70％乙醇为提取川赤芍药材的溶媒，并进一步以正交试验考察提取工艺条件。

2）正交试验设计优化提取工艺 

中药有效成分的提取是中药生产的关键工艺之一。

提取工艺首先要考虑有效成分的收率，并缩短操作周期，保证产品质量和经济使实用。

因此合理设计提取工艺条件至关重要。

在选择了适当的提取溶媒的基础上，以影响活性成分提取率的因素，如溶媒用量、提取时间及提取次数等进行正交设计试验。

a）因素-水平设置 

溶剂法提取中影响提取效率的因素主要有溶媒用量、提取时间及提取次数等。

根据实际情况，设置醇用量、提取时间及提取次数为3个考察因素，因素-水平设置见表2。

表2 因素-水平表

b）评价指标：

以芍药苷含量（芍药苷含量=提取液中芍药苷质量/称取的药材量*100%）为评价指标。

色谱柱的选择:

考察Hypersil ODS（150mm*4.6mm,5μm）和Hypersil BDS（200mm*4.6mm,5μm

流动相选择：

流动相考察甲醇-水系统、甲醇-0.05%磷酸溶液系统、乙腈-水及乙腈-0.05%磷酸溶液系统。

流速选择：

流速考察0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min 

对照品溶液的制备 

精密称取芍药苷对照品10.63mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液（每lml含芍药苷对照品425.2μg）。

标准曲线的制备

分别精密量取对照品贮备液溶液（425.2μg/ml）0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

精密量取上述不同浓度对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按前述色谱条件分别测定其峰面积。

以对照品浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。

计算，得直线回归方程：

Y=20040X-97396，相关系数r=0.9997。

以上结果表明芍药苷浓度在21.26μg~212.6μg范围内与峰面积积分值有良好的线性关系。

测定数据见表1，标准曲线图见图1。

表1标准曲线的制备

 供试品溶液的制备及测定

取提取液，稀释至一定体积，滤过，即得供试品溶液。

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，由外标一点法计算即得芍药苷含量。

3.赤芍的提取工艺优化

1）样品溶液的制备

称取赤芍粗粉100g，加一定生药量（ml/g）的溶剂提取，过滤，合并提取液，减压真空浓缩成浸膏，60℃以下蒸成干膏。

精密称取干膏0．2g，加甲醇定容至25mL，用HPLC法测定赤芍总苷的含量。

2）提取溶剂和方法的选择

根据指标成分的理化性质和预实验结果，称取赤芍粗粉100g，分别按照10（ml/g）加入70％乙醇和水提取2次，每次1．5h。

3）乙醇提取工艺的优化

设计3个试验冈素，即A乙醇体积分数，B提取时间、C提取次数。

每个因素设3个水平，按L9（34）正交表进行试验，正交实验因素水平见表1。

4）乙醇用量的考察

精密称取赤芍细粉100g，分别加不同量的70％乙醇，提取3次，每次2h。

4.赤芍提取液的纯化工艺优化

1）树脂上样液的制备

取赤芍细粉200g，置2000mL圆底烧瓶内，用1600mL70％乙醇回流提取3次，每次2h，过滤，合并3次提取液，滤液减压真空浓缩至无醇味，约100mL。

适量水加热溶解，离心。

将离心液转移至1000mL量瓶中，离心加蒸馏水定容至刻度，作为供试液（生药量0．2g/ml），用HPLC法测定芍药苷和芍药内酯苷的含量。

2）大孔吸附树脂的预处理

取AB-8大孔吸附树脂适量，以95％乙醇浸泡24h，除去悬浮物及杂质，湿法装柱，用95％乙醇洗至洗脱液与水（1：

5）混合不产生浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味，备用。

3）大孔吸附树脂型号的筛选

取已处理好的D101、HPD722、AB．8、DM-130、HPD．6005种型号树脂各10mL置于干净的100mL锥形瓶中，加入100mL供试液，静置24h使之充分吸附（每隔8h超声振动1次），滤过，用HPLC法测定吸附后的上样溶液中芍药苷和芍药内酯苷的含量，计算5种树脂的静态吸附率。

将5种树脂饱和吸附后滤出，精密加入95％乙醇150mL使之解吸，每隔8h超声振动1次，过滤，用HPLC法测定滤液中芍药苷和芍药内酯苷的含量，计算各树脂的静态解吸率。

4）泄漏曲线的考察

向1根层析柱中加入已经处理好的AB．8犁大孔吸附树脂100mL，取400mL供试液卜样，流速为1.5BV/h，分段收集泄漏液，每40mL收集l份，测定每个流份的芍药苷和芍药内酯苷的含量，根据每个流份的体积分数绘制泄露曲线。

5）径高比的考察

取3种不同粗细的柱子，加入100mL已经处理好的AB-8型大孔吸附树脂使其径高比分别为1：

4、1：

8、1：

12，依次标为1、2、3。

以1．5BV／h的流速，上样4.4BV供试液，然后分别用2BV水和5BV95％乙醇洗脱，收集醇洗液，测定芍药苷和芍药内酯苷的含量，计算其解吸率。

6）水洗脱条件的考察

取1根层析柱，湿法上柱100mLAB-8型大孔树脂，径高比为1：

8。

将4．4BV上样液以1．5BV/h的流速通过树脂柱，吸附30rain后，以蒸馏水洗脱，分段收集，以苯酚．硫酸法检测洗脱终点，并以TLC检测各流出液中芍药苷和芍药内酯苷是否泄漏。

7）乙醇洗脱体积分数的考察

取5根相同型号的层析柱，分别湿法上柱100mLAB-8型大孔树脂，径高比均为1：

8。

将4．4BV上样液以1．5BV/h的流速分别通过树脂柱。

3BV蒸馏水洗脱树脂，再分别用3BV不同体积分数的乙醇洗脱，收集醇洗液，测定芍药苷和芍药内酯苷的含量，计算其解吸率。

8）洗脱流速的考察

取3根相同型号的层析柱，分别湿法上柱100mLAB-8型大孔树脂，径高比均为1：

8。

将4．4BV上样液分别通过树脂柱，用3BV蒸馏水洗树脂，然后用3BV40％乙醇洗脱，3根树脂柱的流速分别为0．9、1．5、2．1BV/h，收集醇洗液，测定芍药苷和芍药内酯苷的含量，计算其解吸率。

9）洗脱曲线的考察

湿法上柱100mLAB．8型大孔吸附树脂，径高比为1：

8，上样4．4BV上样液以1．5BV/h的流速通过树脂柱，用3BV蒸馏水洗树脂，然后用8BV40％乙醇洗脱，分段收集洗脱液，每份50mL，共收集16份，测定总苷的含量，以总体积分数和份数绘制洗脱曲线。

（三）赤芍总苷的纯化干燥

纯化干燥方法的选择：

1）大孔树脂吸附法：

实验原理：

赤芍苷具受热不稳定，易水解的特点，故用乙醇提取，使温度在60℃。

且D101型大孔吸附树脂对赤芍总苷有良好吸附分离性能。

吸附分离赤芍总苷的条件：

上样液浓度：

0．25g／mL，最大上样量：

1．5g／g树脂，洗脱剂：

30％乙醇，洗脱流速：

3mL／min，洗脱剂用量为3倍量树脂柱体积。

总过程：

大孔树脂的预处理、树脂上柱、提取液上柱、大孔吸附树脂的解析、大孔吸附树脂的清洗，再生。

大孔树脂的处理：

D101和AB-8大孔吸附树脂各85g（175ml），经95％乙醇浸泡12h，充分溶胀后装柱，蒸馏水洗至无醇味，备用。

具体操作步骤：

a）将提取所得浸膏加蒸馏水至药材4倍量，得到待纯化样品液；

b）取该液200ml，上树脂柱（树脂85g）；

c）先用3倍蒸馏水洗（600ml），流速3ml/min;再用3倍量（600ml）的30%乙醇洗脱,洗脱速度3ml/min

d）收集洗脱组分

e）减压回流乙醇，余下浸膏于真空干燥器中干燥，即得。

2）正丁醇萃取法：

取浸膏，补充蒸馏水至药材的2倍量，作为待纯化样品溶液。

取上述待纯化样品溶液200ml，取等量石油醚萃取3次，除去石油醚层，然后用水饱和后的正丁醇萃取3次，收集正丁醇层，再用200ml蒸馏水洗1次，弃去水层，减压回收正丁醇，所得浸膏于真空干燥器中干燥。

3）干燥工艺

减压干燥的特点是温度较低，产品质松易粉碎，同时减少空气对产品的不良影响，对保证产品质量有一定意义。

减压干燥的干燥效果主要取决于真空度的高低与被干燥物堆积的厚度。

物料堆积越薄，干燥面积越大，则干燥速率越快。

（四）赤芍总苷的质量标准鉴定

1）高效液相色谱

指标成分选择的依据：

赤芍总苷中以芍药苷含量最高，且该成分为主要活性成分，选择芍药苷作为含量测定的指标成分能较好地控制总苷的质量。

色谱条件：

色谱柱:

HypersilBDSC18（200mm×4.6mm，5μm，大连依利特分析仪器有限公司）;流动相:

乙腈-0.05%磷酸溶液（15:

85）;检测波长:

230nm;流速:

0.8mL/min;柱温:

30℃。

对照品溶液的制备：

精密称取芍药苷对照品14.78mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液（每1mL含芍药苷对照品591.2μg）。

标准曲线的制备：

分别精密量取对照品贮备液溶液（591.2μg/mL）0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

精密量取上述不同浓度对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，按前述色谱条件分别测定其峰面积。

以对照品浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。

供试品溶液的制备：

取赤芍总苷约20mg，精密称定，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻摇匀:

精密吸取1mL该溶液置5mL量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得.

（2）高效液相色谱的方法学验证

精密度试验：

取同一份对照品溶液，精密吸取10μL，重复进样5次，测定峰面积，计算其RSD。

稳定性试验：

取本品1份照供试品溶液的制备方法制备供试液，在0、4h、5h、12h、24h时进样，共5次，测定其峰面积积分值，计算RSD。

重复性试验：

按供试品溶液的制备方法，取同一批样品5份，制备样品溶液，分别进样10μL，测峰面积RSD。

加样回收率试验：

取已知芍药苷含量的本品6份，每份各约10mg，精密称定，分别按样品中芍药苷含量精密加入芍药苷对照品溶液，按供试品溶液制备方法制得供试品溶液，精密量取续滤液10μL，HPLC分析，测定芍药苷含量，计算回收率。

五、人员分工安排

任瑶：

人员安排、进度安排、最后汇总、整理

石云珂：

项目概述（赤芍、赤芍总苷概述）、实验目的（参考实验书）

陈华芳：

实验内容【药材质量检查（原药材、质量、鉴定）、提取工艺】

陈雨漫：

实验内容【纯化工艺研究、干燥工艺制备】

尹倩：

实验内容【质量标准鉴定（15药典）】

蒋敏桃：

研究采取方法【检验项目、药品标准（提取方法、因素、评价指标）】

曹钰镁：

研究采取方法【纯化工艺（项目、因素、评价指标）、干燥工艺（项目、因素、评价指标）】附一个各自的影响因素表

张明杰：

研究采取方法【提取工艺（项目、因素、评价指标）】附一个各自的影响因素表

胡敏：

研究采取方法【质量标准（15药典，提取物相关标准）

六、实验进度安排表

预算时间

实验安排

参与人员

实施情况

第一周

赤芍药材的质量检查

全组人员

（任瑶、张明杰、陈华芳主要负责）

第二周

赤芍总苷的提取及纯化

全组人员

（尹倩、石云珂、陈雨蔓主要负责）

第三周

赤芍总苷的含量测定

全组人员

（曹玉镁、胡敏、蒋敏桃主要负责）

七、实验流程

（一）赤芍药材的质量检查

粉末0.5g，加乙醇10

ml，振摇5min，滤过

滤液蒸干

残渣加乙醇2ml使溶解

分别点于同一硅胶G薄层板上，

以三氣甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40:

5:

10:

0.2）展开剂，展开

（二）赤芍总苷提取工艺

（三）含量测定

高效液相

流动相:

乙睛-0.05%磷酸溶液（15:

85）

检测波长:

230nm;流速:

0.8ml/min;柱温:

30℃

以氯仿-乙酸乙醋-甲醇-甲酸（40:

5:

10:

0.2）为展开剂，

显色剂为5%香草醛浓硫酸溶液,在105℃加热至斑点显清晰

八、参考文献:

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