研究生笔记锁阳的研究进展.docx
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研究生笔记锁阳的研究进展
中药锁阳指纹图谱和原花青素的提取及提取物抗氧化的研究
高乃群S0*******8
一.前言
在新世纪,具有我国传统文化和独特优势的中药正面着前所未有的挑战和发展机遇.
一方面,随着社会的发展,人类疾病谱已悄然发生改变,医疗模式已由单纯的疾病治疗变为预防.保健.治疗.康复相结合的模式.传统医学发挥着越来越大的作用.生存环境的不断恶化,使人类回归自然的忽视越来越高,因而传统医药备受青睐.[2]
另一方面,我国传统中药在国际市场正面临诸如日本.韩国.印度泰国等传统医药国家和德国.法国等欧洲国家植物药的巨大冲击.由于我国传统中药生产的众多产品不能符合国际标准和要求,目前只有百分之几的国际市场销售份额也可能进一步萎缩.[3]所以建立一套完整的符合国际标准的中药检测质量体系很重要.HPLC和EC是面前最常用的两种中药的检测标准.中药指纹图谱库的国家标准的建立也势在必行.中药有效成分提取量化也迫在眉睫.
中药有效成分的提取的目的是拿到能够实现该药理功能的有效成分,而非本中药的主要成分。
通过定向提取的成分集合,可以用HPLC测得有效成分的含量,根据含量和工艺收得率及原处方的生药用量,计算出该提取物的配伍剂量。
从而使复方的成分得以量化,质量得以稳定。
确保了医生开什么药,患者用什么药;医生开多少,患者用多少;医生怎么开,患者怎么用。
确保了医和药的统一,处方和药品的统一,药性和疗效的统一,医生和患者的统一。
[4][5]
二.锁阳中原花青素的研究
[原植物〕多年生寄生革伞.无叶绿素.高10一100cm。
茎圆柱状.暗紫红色.有散生鳞片,基部膨大。
穗状花序生于茎顶,棒状、长圆形或狭椭圆形.生密集的花和鳞片状色片,花杂性.暗紫色。
坚果球形。
药材性状〕个品呈扁圆柱形.微弯曲.[1]
[药材性状]
本品为扁圆柱型,长5—15cm。
直径1.5---5cm表面棕色或棕褐色,组糙.具明显纵沟及不规则凹陷,有的残存三角形的黑棕色鳞片。
体重.质硬.难折断.断面浅棕色或棕褐色.有黄色三角状维管束。
中药锁阳为锁阳的干燥肉质茎,性甘具有补肾阳,益精血,润肠通便的功能,用于腰膝痿软,阳痿滑精及肠燥便秘,是中医临床上兴阳益精,抗衰老的重要药物。
1.锁阳的主要化学成分
1.1 有机酸
没食子酸、原儿茶酸、琥珀酸.
1.2黄酮类
(+)-儿茶素、柑桔素4′-o-吡喃葡萄糖苷、柑桔素为苷元的配糖体、-儿茶素.
1.3三萜类
熊果酸、乙酰熊果酸、乌苏烷-12-烯-28β-酸-3、熊果酸丙二酸半酯、-丙二酸单酯齐墩果酸丙二酸半酯、三萜类皂苷.
1.4甾体类
β-β-谷甾醇、胡萝卜苷、β-谷甾醇-D-葡萄糖苷、β-谷甾醇谷甾醇棕榈酸酯、5α-豆甾-9(11)-烯-3β-醇、5-豆甾-9(11)-烯-3β-醇-二十四碳三烯酸酯
1.5 挥发性成分
锁阳挥发性成分中含大量脂肪酸及酯类化合物,萜烃类成分极少.挥发性成分中棕榈酸和油酸含量很高,分别占总挥发性成分的22.69%和19.24%
1.6氨基酸类
含有天门冬氨酸、脯氨酸为主的15种氨基酸.
1.7糖和糖苷类
含有葡萄糖、蔗糖、多糖、酸性杂多α糖SYP-A和SYP-B、n-丁基--D呋喃果糖苷、n-丁基--D呋喃果糖苷、n-butyl-l--D-fructopyranoside、姜油酮葡萄糖苷、三萜皂苷.
1.8鞣质类
为单纯缩合型的儿茶素类鞣质.
1.9元素、无机离子
含有K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe、Al、Cl、Co、Cr、Mn、Mo、Rb、V等15种元素,SO、PO、F、Cl、NO等4种负离子.
1.10 其他成分
锁阳还含有花色苷、淀粉、蛋白质、多种维生素、还原糖等.
锁阳中的活性物质很多,黄酮类及鞣质就是其中的活性物质.原花青素就是这类物质的代表.
2.原花青素
原花青素(procyanidins,简称pC,曾用名proanthoeyanidins,pyenogenol),是一大类多酚类化合物的总称,含类黄酮基本结构,为黄酮醇的烷化物,可水溶,热酸处理有花色素反应。
原花青素单体的结构通式(图1),不同原花青素的R基可不同,其中,Rl可为H或OH基,RZ、R3、R4可为H,OH或甲氧基,RS为H。
天然分离的原花色索多以聚合形式存在,二聚、三聚和四聚体较常见,聚合发生在相邻分子C4一CS和C4一C6之间(图2)。
[11]
按聚合度大小,二至四聚体称为低聚原花青素(01igomerieproanthocyanidins,简称OpCs),五聚体以上称为高聚原花青素(polymersproanidins,简称ppCs)
近年来,通过对原花青素的单聚体、二聚体、三聚体、四聚体和高聚体进行生化、药理活性的研究,发现其具有抗氧化、抗致突变、抗心血管疾病等活性,其中二聚体和三聚体活性最强.所以OpCs含量高低就成为评价产品质量的最关键指标。
目前研究最多的是葡萄籽和葡萄皮中的原花青素,而锁阳中原花青素含量也颇丰富.
3.锁阳中原花青素的提取
提取多用有机溶剂萃取法,常用水、丙醇、甲醇、乙醇及其水溶液作为提
取剂,其提取纯度及提取率往往受锁阳粉碎度及提取溶剂的影响,100目处理时,不同溶剂提取率相近,大小顺序为水、甲醇、乙醇、丙酮;但提取纯度相差较大,从大至小依序为乙醇>甲醇>水>丙酮。
由此,以乙醇为溶剂提取为好.
方法:
乙醇浓度控制在50%~70%之间,浓度60%时为宜.精确称取2.0g锁阳粉末.温度控制在30℃为宜.提取时间40min为宜.进行两部提取,先用60%乙醇30ml浸泡30分钟,超声5min,过滤,滤渣再用15ml60%乙醇浸泡20分钟,超声过滤.合并滤液,置于50ml容量瓶中用60%乙醇定容.[8]
4.毛细管电泳技术测锁阳
取上述滤液用0.45m的滤头过滤,浓缩定容于5ml容量瓶中,超声备用。
高效毛细管电泳仪,熔融石英毛细管50cm×75μm.运行缓冲液为0.2mol/L硼酸(用0.05mol/L硼砂调节到PH8.5)于25℃,20kV恒压下进行电泳分离,可用电化学方法检测,也可考虑用UV在254nm波长处检测.类黄酮物质在此波长范围会有较好的紫外吸收.试样中加入适量磷酸能使相似组分有较好的峰形和分离度.
考虑当加入离子液体N,N-二烷基咪唑离子液体[RR,IM]+,效果如何有待实验检验.
毛细管柱使用前用0.10mol/L的NaOH、水和电泳缓冲液分别冲洗3min,2min和2min。
每次电泳后,用电泳缓冲液冲洗毛细管柱2min。
[6][7]
5.近红外检测
近来报道近红外检测原花青素
MPA(MultiPurposeAnalvzer)型傅立叶变换近红外光谱仪:
MPA(MultiPur-poseAnalyzer)型傅立叶变换近红外光谱仪上扫描锁阳样品,取得样品的近红外光谱。
扫描条件为:
扫描谱区4000~12000cm-1;扫描次数:
64次扫描;分辨率:
8cm-1
每个样品重复装样扫描3次,计算平均光谱,建立红外模型.
采用OPUS/quant5.5定量分析软件对平均光谱进行预处理和回归统计分析。
回归统计分析方法采用偏最小二乘法(Partialleastsquares,PLS)。
取92份样品作为校正集,采用内部交叉检验建立模型,取23份样品作为验证集,评价模型的效果。
[9]
6.HPLC测锁阳中原花青素的含量及指纹图谱
Waters1525高效液相色谱仪,waters2996DAD检测器、waters2420蒸发光散射检测器,色谱柱为NucleodurC18(250×3.9mmI.D,5μm)柱,1100化学工作站(美国),超声波提取器(上海).旋转蒸发仪.
试药
原花青素对照品,水为重蒸馏水,流动相:
甲醇(色谱纯)三氟乙酸(分析纯),
洗脱条件:
0min,90%A,10%B;10min,90%A,10%B;12min88%A,12%B;15min,85%A,15%B;45min,70%A,30%B;100min55%A,45%B,120min,0A,100%.A=水+三氟乙酸;B=甲醇
流速=0.6ml/min
检测波长:
254nm.二极管阵列:
210~400nm.
蒸发光散射检测器:
氮气压力16psi,自动增益,加热比75%,漂移管温度90.0℃
样品处理和毛细管电泳相同.
DAD检测器的优点.
灵敏度高,重现性好,可以得到三维光谱.[12]
下学期开始认真试验!
参考资料:
1.中华人民共和国药典中药彩色图集.451-452
2.陈冲.中药研发中的新思路2002.
3.石上梅,孙婕,杜庆鹏.天麻药材HPLC指纹图谱的研究.待中国药学杂志,200540(10)739一741
4.肖培根.21世纪中药研究发展方向2005.6<<中药研究与信息>>
5.肖培根,王永炎.迎接中医药的又一个春天.2008.2
6.王万慧,王忠东,曹玉华,胡 骥,吴海燕不同气候对丹参基础组合成分影响的研究
7.孔令瑶, 汪云, 曹玉华, 龚文君, 曹蕊, 李楠黑米色素的组成与结构分析
8.龚立冬, 曹玉华, 侯建霞高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定肉苁蓉中的甜菜碱
9.Hua-TaoFeng,SamF.Y.LiJournalofChromatographyA,973(2002)243¨C24
10.ZHOUYu-biYERun-rong,LUXue-feng,LIUYang,PENGMinAgriculturalScience&Technology,2007,83-4:
64–67
11.JeevanK.Prasain,NingPeng,YanyingDai,RayMoore,AlirezaArabshahi,LandonWilson,StephenBarnes,J.MichaelWyss,HelenKim,RayL.WattsLiquidchromatographytandemmassspectrometryidenticationofproanthocyanidinsinratplasmaafteroraladministrationofgrapeseedextractPhytomedicine(2008),doi:
10.1016/j.phymed.2008.08.006
12.RosanaChirinos,IndiraBetalleluz-Pallardel,AnabelHuam,CarlosArbizu,RominaPedreschi,DavidCamposHPLC-DADcharacterizationofphenoliccompoundsfromAndeanoca(OxalistuberosaMol.)tubersandtheircontributiontotheantioxidantcapacitydoi:
10.1016/j.foodchem.2008.08.015
附.原花青素色谱图
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