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分子遗传学复习总结
第二章基因的结构和功能
一基因一酶学说:
该学说具体体现了基因和酶之间的关系,表明每个基因控制单个酶的合成或激活其活性。
转化:
通过裸露的外源DNA传递遗传信息。
转染:
是转化的一种特殊形式。
用于原核细胞时,其外源DNA特指离体的phageDNA来感染感受态的细菌,并在其中表达;用于真核细胞时对任何裸露DNA的吸收都成为转染。
接合:
通过细胞与细胞之间的直接接触。
遗传信息单向传递到受体的过程。
转导:
一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。
自主发育:
不受周围细胞的影响,按照自身基因型发育的现象。
非自主发育:
受周围细胞的影响,不按自身基因型发育的现象。
1902[英]Garrod.A首先研究了四种遗传病:
黑酸尿病白化病胱氨酸尿病戊糖尿病;1952年发现糖原贮积症(VonGierke氏病)病人缺乏葡萄糖-6-磷酸酶芽盘移植实验
第二节人类酶缺陷的遗传基础
一、半乳糖血症二、白化病三、苯丙酮尿症四.莱-尼二氏症
第三节遗传咨询和产前诊断
一、遗传咨询(Geneticcounseling):
询问先征者的完整病史,家族史;查阅McKusick,V.A:
《MendlianInheritanceinMan》是否为遗传病,遗传类型,发病风险?
通过产前诊断,决定是否终止妊娠。
二、产前诊断(prenataldiagnosis):
指征是:
(1)亲体为携带者;
(2)母亲曾生育过先天性异常的婴儿;(4)35-40岁以上的高龄孕妇;(5)曾有多次流产,早产和死胎的孕妇;(6)亲体曾多次接触过放射线或在妊娠早期服过一些胎儿致畸药物。
采集标本的方法:
羊膜穿刺抽取羊水,收集胎儿脱落细胞;从宫颈粘液中获取绒毛膜细胞;直接从子宫控中吸取绒毛膜细胞;超声波可用于产前诊断神经管缺陷,如无脑儿,脊椎裂和水脑儿。
胎儿镜(fetoscope)又称羊膜镜或宫腔镜。
产前诊断的方法:
细胞学,生物化学,分子生物学
三、携带者的检出:
方法:
(1)染色体核型分析
(2)酶活性的检测(3)分子生物的方法。
实例:
神经节苷酯贮积病GM2-I型[Tay-Sachs症,家族性黑蒙性痴呆,氨基已糖苷酶A)缺乏症
四、分子病(moleculardiease):
分子病是指由于基因的突变引起了蛋白质分子结构的改变而导致的疾病,如镰形细胞贫血(sicklecellanenia)。
第四节基因的精细结构和顺反测验
(应为XX文库的原因,此处删除了)
当顺式有功能,而反式没有功能时,突变位点在同一顺反子内;当顺式有功能,而反式也有功能时,突变位点在不同顺反子内。
第三章遗传物质的分子结构和性质
第一节核酸是遗传物质
遗传物质必须具备哪些特点?
:
在体细胞中含量稳定;在生殖细胞中含量减半;能携带遗传信息;能精确地自我复制;能发生变异;
(DNARNA是遗传物质的证明)一、遗传物质的发现:
1928年FrederickGriffith转化实验;1944年,Avery在离体条件下完成转化。
1952年,Hershey和Chase噬菌体感染实验二、RNA也是遗传物质:
1956年A.Gierer和G.Schraman发现烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,TMV),其遗传物质是RNA。
1957年美国的HeinzFraenkel-Conrat和B.Singre用重建实验证实了这一结论。
第二节DNA和RNA的化学组成及双螺旋模型
一、DNA和RNA的化学组成
二、DNA双螺旋模型的诞生:
Watson&Crick建立双螺旋模型主要是受到4个方面的影响:
(1)1938年W.T.Astbury&Bell用x衍射技术研究DNA。
1947年拍摄了第一张DNA的衍射照片,并推断DNA分子的结构是:
①柱状;②多核苷酸是一叠扁平的核苷酸;③核酸残基取向和分子长轴垂直,间距为3.4。
(2)1951年Pauling和Corey运用化学的定律来推理,而不做具体的实验,建立了蛋白质的α-螺旋模型;(3)晶体学者[美]J.Donoh&Chargaff的指点。
(4)R.Franklin&Wilkins在1952年底拍得了DNA结晶X衍射照片。
三、双螺旋模型(doublehelixmodel)
双螺旋模型有以下特点:
(1)DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链组成,形成右手双螺旋。
(2)双螺旋的直径为2nm;螺距为3.4nm,上下相邻碱基的垂直距离为0.34nm,交角为36°。
(3)两条链反向平行,即两条链的方向相反;(4)糖一磷酸键是在双螺旋的外侧,碱基对与轴线垂直。
(5)糖与附着在糖上的碱基近于垂直。
(6)碱基配对时,必须一个是嘌呤,另一个是嘧啶。
(7)DNA双螺旋有大沟(majororwidegroove)和小沟(minorornarrowgroove)的存在。
第三节DNA的结构和性质
一、DNA二级结构的稳定因素
(1)碱基对之间的氢键。
(2)碱基的堆集力。
它包括:
①疏水作用;②范德华力;③磷酸基的负电荷斥力
模型中的碱基配对有何重要性?
①A-T,G-C配对可形成很好的线性氢键;②A-T对和G-C对的几何形状一样,使双链距离相近,使双螺旋保持均一;③碱基对处在同一平面内。
不论核苷酸的顺序如何,都不影响双螺旋的结构;④为DNA半保留复制奠定了基础。
二、双螺旋结构的构象变异
DNA的构象现已知有A,B,C,D,E,T,Z7种。
生理条件下:
B三种主要构象:
B A Z引起DNA双链构象改变有以下因素:
(1)核苷酸顺序;
(2)碱基组成;(3)盐的种类;(4)相对湿度。
立体异构:
分子中原子互相连接的方式和次序相同(构造相同),但在空间的排列方式不同而出现的异构现象。
平面偏振光和旋光性
光是一种电磁波,它的电场或磁场振动的方向与光前进的方向垂直。
在普通光线里,光波可以在垂直于前进方向平面上的任何方向振动。
(一)左旋DNA
Z-DNA的结构特点
(1)糖磷骨架呈“之”字形(Zigzag)走向。
(2)左旋。
(3)G的糖苷键呈顺式(Syn),使G残基位于分子表面。
(4)分子外形呈波形。
(5)大沟消失,小沟窄而深。
(6)每个螺旋有12bp。
Z-DNA存在的条件
(1)高盐:
NaCl>2Mol/L,MgCl2>0.7Mol/L
(2)Pu,Py相间排列:
(3)在活细胞中如果m5C,则无需嘌呤-嘧啶相间排列,在生理盐水的浓度下可产生Z型。
(4)在体内多胺化合物,如精胺和亚胺及亚精胺和阳离子一样,可和磷酸基因结合,使B-DNA转变成Z-DNA。
(5)某些蛋白质如Z-DNA结合蛋白带有正电荷,可使DNA周围形成局部的高盐浓度和微环境。
(6)负超螺旋的存在
生物学意义:
(1)可能提供某些调节蛋白的识别。
啮齿类动物病毒的复制起始部位有d(GC)有交替顺序的存在;
(2)在SV40的增强子中有三段8bp的Z-DNA存在。
(3)原生动物纤毛虫,它有大、小两个核,大核有转录活性,小核和繁殖有关。
Z-DNA抗体以萤光标记后,显示仅和大核DNA结合,而不和小核的DNA结合,说明大核DNA有Z-DNA的存在,可能和转录有关。
(二)右旋DNA:
目前已知DNA双螺旋结构可分为A、B、C、D及Z型等数种,除Z型为左手双螺旋外,其余均为右手双螺旋。
三、DNA的三级结构
所谓DNA的三级结构,是指在一二结构基础上的多聚核苷酸链上的卷曲。
在一定意义上,是指双螺旋基础上的卷曲
三级结构包括链的扭结和超螺旋或者是单链形成的环或是环状DNA中的连环体超螺旋:
(Supercoied)松驰型DNA(relaxform)。
超螺旋(Supercoied)DNA,负超螺旋正超螺旋
检测DNA三级结构的方法:
密度梯度离心凝胶电泳电镜观察
原核生物DNA的三级结构:
绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋。
如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋三级结构。
超螺旋的定量描叙:
White方程:
L=T+W
L(Linkingnnmber):
链环数或称拓扑环绕数,指cccDNA中一条链绕另一条链的总次数。
其特点是
(1)L是整数;
(2)在cccDNA中任何拓扑学状态中其值保持不变;(3)右手螺旋对L取正值。
W(Writhingnumber):
扭曲数,即超数旋数。
其特点是:
(1)可以是非整数;
(2)是变量;(3)右手螺旋时,W取负值。
T(Twistingnumber):
缠绕数,即双螺旋的圈数。
其特点是:
(1)可以是非整数;
(2)是变量;(3)右手螺旋时T为正值。
超螺旋的量度可以用超螺旋密度λ来表示:
λ=(L-T)/T在天然DNA中,λ约为-0.05
第四节DNA的变性与复性
变性或解链:
对DNA双链进行缓慢地加温,使氢键断裂,双链解开,产生单链的DNA分子的过程
成核作用:
复性过程中互补的两条链首先是中心部分互补碱基对之间形成氢键,接着像拉拉链一样,其余部分随之形成双链。
又称为拉拉链作用。
复性或退火:
核酸分子在变性后分开的互补链缓慢冷却,重新形成互补双链的过程。
DNA的复性对片段有两个要求:
(1)互补顺序的碰撞和排列;
(2)碱基的正确配对和氢键的形成。
一、DNA变性
物理性质发生变化:
(1)流体力学的性质发生改变:
粘度下降,而沉降速度增加;
(2)提高了对紫外线的吸收能力,此称为增色效应(hyperchromiceffect)。
双链DNA的A260=1.00(浓度为50μg/ml时,对波长260nm紫外线的吸收能力);单链DNA的A260=1.37;游离碱基或核苷酸的A260=1.60。
解链温度(meltingtemperature,Tm)或熔点,Tm是A260的升高达到极大值一半时的温度。
即是变性温度范围的中点。
影响变性的因素:
高温、酸、碱、尿素、甲酰胺
影响Tm值的因素:
外部条件:
如温度和正离子的浓度:
浓度低于0.4mol/L,单价阳离子增高10倍,Tm增加16.6°内部条件:
GC含量及分子类型当GC的含量上升1%,则Tm上升0.4℃马默多蒂(Marmur-Doty)关系式:
Tm=69.3+0.41(G+C)%,或GC%=(Tm-69.3)×2.44
二、DNA复性
复性动力学公式
根据复性动力学公式我们可以知到些什么?
(1)单链浓度随着时间的增大而减小;
(2)反应速率取决于初始的单链浓度Co;(3)以反应浓度和COt1/2为座标可绘复性曲线;(4)通过C0t1/2值可测原核生物基因组的大小;已知大肠杆菌的基因组为4.2x106bp,COt1/2=9M.SecCOt1/2(大肠杆菌基因组DNA)/9M.sec=任何基因组大小/4.2X106bp(5)原核生物基因组大小不同,复性曲线不同;(6)可用以区分真核生物和原核生物基因组。
单一顺序和重复顺序复性动力学曲线的区别真核生物DNA有重复顺序,原核物多为单一顺序。
(1)单一顺序的复性曲线常只有一个拐点,而重复顺序常有多个拐点。
(2)COt比值变化范围不同:
原核生物的COt比值小于100,真核生物的COt比值大于100。
影响复性反应的因素
(1)DNA片段的大小;
(2)DNA的浓度;(3)DNA复杂性;(4)温度。
最佳复性温度一般比Tm低25_C。
(5)盐的浓度:
复性时要求盐的浓度达到足够高,为什么?
复性反应中如何知道单链已结合成双链?
可以通过哪些法来检测?
(1)减色效应:
测定光密度,即OD值,DNA从单链变成双链,OD260减少30%
(2)羟基磷灰石柱层析羟基磷灰石对双链DNA吸附较牢,不易吸附单链。
(2)羟基磷灰石柱层析
第五节核酸分子杂交技术
分子杂交:
具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下,按碱基配对原则形成双链的过程。
杂交的共同特点
(1)都是应用复性动力学原理;
(2)都必须有探针(probe)的存在。
探针就是用同位素或非同位素如荧光染料,生物素等标记的短片段特异DNA或RNA顺序。
一、核酸分子杂交的基本原理
DNA变性方法热变性:
90-100℃酸碱变性:
常采用碱变性化学试剂变性:
尿素、甲酰胺、甲醛等特点:
粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度(meltingtemperature,Tm)
DNA复性或杂交(hybridization)DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
影响杂交的因素:
核酸分子的浓度和长度浓度大,复性快;分子量大,复性慢温度离子强度杂交液中的甲酰胺核酸分子的复杂性非特异性杂交反应
预杂交:
鲑鱼精子DNA封闭非特异性杂交位点
分子杂交的基本方法:
Southern印迹法Northern印迹法斑点印迹杂交原位杂交Western印迹法液相杂交
Southern杂交:
DNA/DNA杂交,即将DNA电泳、转印到固相支持物上,用探针进行检测的方法。
Southern杂交的主要步骤:
待测DNA样品的制备、酶切待测DNA样品的电泳分离:
琼脂糖凝胶电泳凝胶中DNA的变性:
碱变性Southern转膜:
硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法探针的制备Southern杂交杂交结果的检测:
基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测酶切后DNA片段琼脂糖凝胶电泳检测
Northern印迹杂交:
检测RNA(主要是mRNA)的方法与Southern杂交的不同:
靶核酸:
RNA。
RNA电泳。
转膜:
不需变性
斑点印迹杂交:
将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上。
优点:
简单、快速、可同时检测多个样品
原位杂交:
将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交,称为原位杂交。
在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究。
不需从组织或细胞中提取核酸,对含量极低的靶序列灵敏度高。
准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。
核酸原位杂交的基本步骤:
玻片原位杂交:
细胞或组织的固定载玻片;组织细胞杂交前的预处理;去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白;膜上分子杂交;探针的选择和标记;杂交结果检测。
探针的标记 探针的种类:
cDNA探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针。
标记物:
核素标记物(同位素标记):
32P、35S、3H等;非核素标记物(非同位素标记):
生物素、地高辛、荧光素等
Western杂交印迹法(Westernbloting)检测蛋白质,即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上,用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法。
主要步骤:
蛋白质样品的制备;SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳;蛋白质的电转移:
NC膜;靶蛋白的免疫学检测:
靶蛋白于第一抗体(一抗)反应;与标记的第二抗体(酶标二抗)反应;显色反应:
酶促反应
第四章基因组和染色体
基因组:
是指一个单倍体的染色体数目(遗传物质的总量)。
原核基因组含有大量单一顺序,仅有少量的重复顺序。
真核基因组含少量单一顺序和大量重复顺序。
原核生物的细胞中除了主染色体以外,还含有各种质粒和转座因子。
真核生物除了核染色体以外,还存在细胞器DNA。
第一节 原核生物基因组的结构特点
一、类核的结构E.coli2.4×109Da,42000Kb(1300微米),闭合环状,约编码2000个基因。
类核(nucleoid):
原核生物的DNA位于细胞中央支架(scafford):
100个DNA环组成,每个环长40Kb,13微米。
每200bp就有一个负超螺旋(_=-0.05),即基因组中含5%的负超螺旋。
超螺旋以两种状态存在:
(1)自由状态的超螺旋,可在环内传递张力。
(2)蛋白结合超螺旋受到束缚,不能传递张力。
二、重叠基因(overlappinggene)
三、质粒(plasmid)特点:
双链环状DNA分子;带有一些特殊基因(抗生素抗性基因);具有复制起始区;可经整合到宿主的染色体中,和细菌染色体同步复制;
质粒类型1.抗性质粒:
带有抗性基因,可使宿主细菌对某些抗生素产生抗性2.致育因子:
可以通过接合在供体和受体之间传递遗传物质,其基因组具有转移区,重组区和复制区3.Col质粒:
含编码大肠杆菌素基因。
4.降解质粒:
这种质粒编码一种特殊蛋白,可使宿主菌代谢特殊的分子,如甲苯或水杨酸。
5.侵入性质粒。
如根癌农杆菌中的Ti质粒。
第二节真核基因组的复杂性
分子量约为3×1012道尔顿长度为2×106Kb,形态为线状,约编码100万个以上的基因。
人类细胞在二倍体的核中DNA长约30亿个碱基对估计编码3万个基因,每条染色体含碱基8千万至3亿不等。
现已有5千个基因被编目,1900个基因已进行了染色体定位,600个已被克隆分离出来。
若将一个细胞中每条染色体的DNA首尾彼此相接,全长约200cm。
染色质(chromatin):
从细胞中获取的DNA和蛋白质的复合物.
常染色质异染色质
在染色质中和DNA结合的有两类蛋白:
组蛋白 非组蛋白
三、染色体的高级结构
10nm的核丝;30nm螺旋管;放射环模型;螺旋环模;放射、螺旋环共存模型;袢环模型;螺旋折叠U.K.1988)等模型;侧环模型
第三节着丝粒和端粒
一.着丝粒:
由三个功能区组成;中部的元件(II)由80~90bp组成,A+T含量高,>90%;左侧的元件(I)含有PuTCACPuTG顺序(Pu是嘌呤);右侧的元件(III)是由26bp组成的保守区,此区也是A-T丰富区;所有真核生物的着丝粒功能都相同,但其DNA却具有种的特异性。
二:
端粒:
共同特点:
每一个端粒都含有一系列的短的正向重复顺序。
Cn(A/T)m,其中n>1,而m=1~4。
在端粒区域中有一种特殊的不连续排列,产生单链断裂的形式,这种结构并不能被连接酶将缺口封闭起来,而在正常情况下连接酶是可以作用DNA链上的缺刻(nick)。
提纯的天然的端粒区可直接用E.ColiDNA多聚酶I进行缺口平移(nicktranslation)。
在端粒区的最末端可能带有3`_-OH的单链末端回折成了发夹(hairpin)结构。
端粒的双链部分中含有T2G4的顺序在3`末端,排列方向是朝向染色体的中心部位。
细胞中,端粒是和一些非组蛋白相结合,形成复合体,常表现为异染色质或构成染色体的末端结节。
端粒的功能:
保持染色体的稳定;使线形DNA顺利复制;影响染色体的行为;可能控制细胞的寿命;和核骨架的组成有关
第四节 染色体的核型和分带
1核型(Karyotype):
在一个细胞中全套的中期染色体称为核型
2染色体带型G带:
Giemsa染色;最常用先用加热或蛋白水解酶进行预处理,然后用giemsa染料染色,结果呈现清晰特异的G带。
反映了染色体DNA上AT的丰富区。
用电镜扫描可在带区见到收缩的痕迹,但不可长期保存。
C带;Q带:
芥子奎吖因(guinacrinemustard)染色;直接将未染色的中期染色体染色,在与G带相同的区域产生另外的荧光带在荧光显微镜下清晰可见。
其whhat?
?
感性较强。
T带;N带;R带:
Reverse;是和G带相反的带,即G带的深染区正是R带的浅染区。
反之亦然。
用常规颜料染色。
第五节 单一顺序和重复顺序
一、单一顺序(Uniquesequence)在基因组中有一个或几个拷贝。
不编码真核基因(40~70%)原核基因(大多)编码
二、短片段重复顺序
(1)正向重复又叫顺向重复;
(2)反向重复;(3)回文顺序:
是一种旋转对称。
特点是正读反读意思都一样。
存在于各种蛋白质的结合位点。
三、长片段重复顺序
轻度重复顺序:
在基因组中含有2-10拷贝,酵母tRNA基因、人和小鼠的珠蛋白基因等。
中度重复顺序:
长约300bp基因组中约有10-几千个拷贝的顺序。
如rRNA和tRNA基因。
tRNA基因一般都分布于基因组中,而rRNA常集中分布于核仁形成区。
基因家族(genefamily):
在真核生物基因组中,来源相同、结构相似、功能相关的基因。
基因簇(genefamily):
相同或相关的基因排列在一起。
分散的基因家族其成员不在同一基因簇(genecluster)内,串联基因家族的成员都集中串联在一起。
有的基因家族成员不仅结构和功能不同,表达的时间也不同。
孤散子(orphons):
由串联重复顺序中派生出的单个基因,远离其家族,表达会发生改变。
假基因:
基因家族中因突变而失去功能的基因不能产生具有生物活性的蛋白质。
加工假基因(processedpseudogenes)。
有以下的特点:
⑴缺少正常的内含子;⑵3’末端有多聚腺苷酸;⑶5’端的结构和mRNA的5’端十分相似;⑷两侧有顺向重复顺序的存在。
对以上特点作何推论?
因此人们推测它似乎和mRNA一样经过了转录后加工,因此也称其为加工假基因;
四、Alu家族:
长约300bp;Alu顺序也称为短的分散因子;由RNA多聚酶III转录的。
在基因组中30万个拷贝;在170bp处有一AluI的酶切位点;由两个130bp的串联重复顺序组成;在二聚体的右半部有31bp插入序列,此插入顺序来自7SLRNA。
Alu顺序有何应用价值?
短的分散因子(shortinterspersedelements,SINEs):
由RNA多聚酶Ⅲ转录的.
长的分散因子(longinterspersedelements,LINEs):
在哺乳动物中,由RNA多聚酶Ⅱ转录的.
L1家族:
长6500bp左右称为长的分散因子;在基因组中约6万个拷贝;由RNA多聚酶II转录的。
属于一种转座因子
五.高度重复顺序:
卫星DNA(satelliteDNA):
卫星DNA(satelliteDNA)是一类高度重复序列DNA在介质氯化铯中作密度梯度离心,离心速度可以高达每分钟几万转;此时DNA分子将按其大小分布在离心管内不同密度的氯化铯介质中,小的分子处于上层,大的分子处于下层;从离心管外看,不同层面的DNA形成了不同的条带。
根据荧光强度的分析,可以看到在一条主带以外还有一个或多个小的卫星带。
这些在卫星带中的DNA即被称为卫星DNA,这种DNA的GC含量一般少于主带中的DNA,浮力密度也低。
隐蔽卫星DNA(crypticsatellite)自私DNA(selfishDNA)伊甸园DNA(GardenofEdenDNA;小卫星(minisatellite)重复序列可变数DNA指纹(DNAfingerprints)
第六节C-值矛盾
C值矛盾(C-valueparadox):
C值和生物结构或组成的复杂性不一致的的现象。
可能产生的原因是什麽?
断裂基因
间隔顺序(spacer):
基因间不编码的部分(有转录间隔区和不转录间隔区)
间插顺序(interveningsequence):
基因内部不编码的区域,即内含子(intron)
可编码的内含子:
成熟酶,内切酶
一、内含子的发现
二、内含子的结构特点
(一)内含子和外显子的分布
(二)内含子的相对性
三、内含子的生物学意义:
①有利于储存较多的遗传信息;②有的内含子可编码内切酶。
③成熟酶归巢④调控⑤提高进化速率
第五章DNA的复制
第一节半保留复制的验证
半保留模型(semioconservetivemodel)全保留复制模型(conservetivemodel)分散模型(Dispersivemodel)。
验证半保留复制的实验一、Meselson-Stahl实验二、Taylar实验三、姐妹染色单体差别染色方法(sister-chromatiddifferentialstaining)5溴脱氧尿嘧啶(5-Bromodeoxyuridine,简称BUdR)斑色染色体(Harlequinchromosome)
四、Cairns复制模型
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