Wnt信号通路在骨关节炎发病机制中作用的实验研究.docx
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Wnt信号通路在骨关节炎发病机制中作用的实验研究
Wnt信号通路在骨关节炎发病
机制中作用的实验研究
摘要
目的:
探讨兔骨关节炎软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路的表达情况及其在骨关节炎中的作用。
方法:
采用关节制动法来制作兔骨关节炎模型,将各组都进行酶消化法分离正常组的软骨细胞和实验组的骨关节炎软骨细胞。
使用蛋白质印迹(Westernblot)来检测软骨细胞中滑膜细胞的β-catenin的表达情况,使用ELISA法对蛋白(β-catenin、OPN和MMPs等)的表达水平的检测,IL-1β、IL-18和IL-33的水平。
结果:
与正常对照组比较,骨关节炎组β-catenin、MMPs和OPN的蛋白水平均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。
与正常对照组比较,骨关节炎组IL-1β、IL-18和IL-33蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。
结论:
兔骨关节炎中Wnt/β-catenin信号通路明显激活,介导软骨细胞外基质分解代谢、促进软骨破坏,而炎性因子IL-1β、IL-18和IL-33可能在此过程中并未起到关键作用。
关键词:
骨关节炎;Wnt/β-catenin信号通路;基质金属蛋白酶;白细胞介素
AStudyonWnt/β-cateninSignalPathwayinRabbitModels
withOsteoarthritis
Abstract
Objective:
ToinvestigatetheexpressionofWnt/β-cateninsignalingpathwayinchondrocytesofrabbitosteoarthritisanditsroleinosteoarthritis.
Methods:
Therabbitosteoarthritismodelwasmadebyjointbrakingmethod.Thechondrocytesinthenormalgroupandtheosteoarthritischondrocytesintheexperimentalgroupwereseparatedbyenzymedigestion.Westernblot(Westernblot)wasusedtodetecttheexpressionofβ-catenininsynovialcellsofchondrocytes.Theexpressionlevelofprotein(β-catenin,OPNandMMPs,etc.)andthelevelsofIL-1β,IL-18andIL-33weredetectedbyELISA.
Results:
Theproteinlevelsofβ-catenin,MMPsandOPNinosteoarthritisgroupweresignificantlyhigherthanthoseinnormalcontrolgroup(P<0.05).TherewasnosignificantdifferenceinIL-1β,IL-18andIL-33proteinlevelsbetweenosteoarthritisgroupandnormalcontrolgroup(P>0.05).
Conclusion:
TheactivationofWnt/β-cateninsignalingpathwayinrabbitosteoarthritismediatesextracellularmatrixcatabolismandcartilagedestruction,butinflammatoryfactorsIL-1β,IL-18andIL-33maynotplayakeyroleinthisprocess.
words:
Osteoarthritis;Wnt/β-cateninsignalingpathway;Matrixmetalloproteinases;Interleukin
Ke1绪论
骨关节炎(osteoarthritis,OA)是非常普遍的骨关节疾病。
如果从宏观的学科角度将会是物理学的力学和生物学两者相联系来解释其因。
在骨关节组织中是其细胞、细胞外液和其下骨三者之间失去了平衡点引起的滑膜炎。
临床表现为关节软骨变性和软骨下骨硬化,因此OA患者行动会受到阻碍,尤其在上、下楼梯中的困难,极大程度上极大上影响了人们生活质量。
OA被认为影响健康的杀手[1]。
为了引起重视,将每年的10月12日定为“国际关节炎日”。
随着目前社会老龄化逐渐严重它更将成为中、老年人骨骼疼痛和活动障碍的最主要原因之一[2]。
从数据的总体上我们可以发现随着年龄的增长患OA比率在逐渐升高,然而本病的致残率将高达到53%多[3]。
因此对OA的治疗已经是迫在眉睫,但对其最关键的发病机制并不清楚。
传统骨关节炎治疗方法:
用针扎穴位的方式进行治疗,通过医生对患者部位进行手术方式进行治疗,对患者生活进行细心的照料进而对其进行治疗和在患者穴位中注入某种物质使其功能得到恢复。
一开始人们主观上认为OA的发病与某些蛋白酶类产生有关联[4]。
这类蛋白有白介素、肿瘤坏死因子等细胞因子和基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)等蛋白酶。
然而通过临床上研究如果使用抗炎药物或蛋白酶抑制剂对OA患者进行治疗的结果显示。
这些药并没有取得很好的治疗效果。
OA发病机制任然需要更深层次的研究。
因此从分子角度深入研究骨关节炎的发病机制以及它的产生和发展过程。
软骨破坏在OA发病中占有比较重的因素,然而导致软骨破坏的主要环节是软骨细胞参与了介导。
随着细胞的增多,基质蛋白和生长因子、细胞因子以及其他炎性介质的产生等。
至此,在治疗方法中以信号通路对其进行治疗同时该方法在实际的治疗操作中占据着比较大的比重。
传统骨关节炎治疗方法中针灸治疗效果最为显著。
周景辉等[5]发现,针灸治疗是通过降低某些因子的水平,使其破坏时间加长,使该组织自备的能力走向好道路,并且治疗的有效率高达已经90%以上。
随着飞一般的科技发展对该疾病的治疗途径也有了质的跨越。
在不知道明确方法中,对其进行慢慢的摸索探究,我们要选择合适的方法去治疗疾病,这对治疗效果有着很大影响。
有关骨关节炎的治疗,主要从骨关节炎发病的病因对其进行治疗同时也要考虑患者的身体因素、
外在的活动范围和他自己内在丰富的心里活动等好多因素联系在一块,对其进行全方位的的治疗。
现代的骨关节炎主要的治疗方式是在从之前的传统方式上增加一些现代已经研究出来,可以达到治疗效果的药物。
简称:
药物与非药物联合。
随着科技的发展和对该疾病治疗方式深层次的研究有了一些重大的突破。
信号通路在骨关节炎治疗中扮演着重要角色,包括:
转录生长因子-β(TGF-β)的信号通路、TLRs和NF-κB蛋白、蛋白激酶(AMP—activatedproteinkinase,AMPK)和Wnt-β-catenin信号通路等。
在与这个疾病有关系的那么多条的通路中,Wnt/β-catenin这通路被研究的时间最长,结果最多。
这个通路在OA中担任着很重的单子[6],它在组织中其他物质有着千丝万缕的联系。
这是它能够引起这么多科学家注意的原因以至于呢,该通路也是被研究最多的。
这个通路在于骨组织上有着紧密的联系,人们慢慢的发现它在骨头成长中和与骨头有关系的一系列的组织系统中都扮演着不能替代的角色,这些联系把它推向骨组织的研究热点。
这些也使得它对OA的治疗也有着很重要的意义。
本次的实验设计也是对Wnt/β-catenin信号通路为中心进行,去挖掘其有关的作用。
实验过程中对动物处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》[7],并且在动物模型的选择上应该遵循的3个原则。
2实验方法
2.1研究对象与试剂
2.1.1研究对象
实验动物8月龄左右健康普通级雄性的新西兰大耳兔40只,体重2~2.5kg,用复合饲料喂养(饲料由安徽医科大学实验动物中心提供),饲养温度20-25℃,湿度65%。
实验动物是由安徽医科大学动物实验中心提供。
将其分为实验组和对照组。
实验动物也可以选择SPF级健康清洁级2月龄雌性SD大鼠68只,体质量450-455g,实验动物是由安徽医科大学动物实验中心提供,并提供大鼠适宜的生存环境,将其分为实验组和对照组。
动物模型的选择上应该遵循的3个原则:
相关性、适当性和实用性。
相关性指所选动物能够比较好地呈现出人类在生这类病时的病理现象及特征;适当性的要求是应用的动物便于调查研究,其次是该动物更加适合实验目的和要求;实用性是指该动物来源充分、易于控制、饲养动物的成本和条件要求不高等,再综合实验的需要本次实验选择兔子。
2.1.2实验试剂
质量分数为20%FBS的DMEM-F12(购自美国Hyclone公司);体积分数为5%的CO2;ELISA试剂盒(购自江苏绿叶生物科技有限公司);10%中性福尔马林溶液(购自南京化学试剂股份有限公司);HE染料(购自青岛科创质量检测有限公司);番红O染料(购自天津百伦斯生物技术有限公司);Westernblot检测器(购自南京晓晓仪器设备有限公司);石膏;及兔子Wnt/β-catenin信号通路相关因子,例如:
β-catenin和MMPs(购自杭州华安生物技术有限公司)
2.2造模
为了研究骨关节炎发病的最根本原因和治疗的方法,因此需要我们去构建可靠的小动物模型。
模型的制作和我们人生道路选择一样有多种,在这么多的选择当中可以在大体上分成两大类:
一类是我们去刻意的引导一些小动物形成。
简称:
人工诱发模型。
还有一类是小动物自己生某类疾病,在这个自发过程不能参有我们主观的意向,要让它自然的,自由的形成。
简称:
自发某型。
人工诱发模型也就是诱导模型,人为进行诱导的模型可以再一次的进行细分为:
有进行手术的方法制得和不进行手术方法制得。
根据手术的位置不同将其再一次细分为关节内在的手术和在关节外手术。
关节内在进行手术的主要与半月板有关,可以将其根部、部分和全部移除;将Hulth进行改良后的方法;可以把小动物的韧带进行切断出去,该类韧带有前交叉韧带和内侧副韧带。
还有一种是在关节外进行手术操作:
软骨损伤;关节周围肌肉破坏;关节血液循环破坏;关节撞击。
而非手术法包括:
关节制动和腔内药物注射,关节制动是用石膏固定于伸直位、屈曲位;还有一种比较简单的操作:
往关节腔中注射一些药物,这些药大部分是可以让蛋白进行水解,蛋白酶的药物有经常使用的木瓜蛋白酶和尿素酶等。
将这些药物慢慢注射后,它们能够分解细胞基质的蛋白多糖。
这个多糖对细胞起到比较好的保护作用。
如果这类多糖被破坏将会导致软骨细胞破坏以至于使得软骨降解,因此成为软骨的弹性、退变和硬度重要指标[8]。
不同的造模方法有其各自的特点,例如:
关节内手术诱导的骨关节炎模型快速、稳定、可重复但会导致早期的炎性递质的释放。
关节外手术诱导不会导致关节内结构的破坏和关节内出血,但造模的时间比较长。
非手术诱导,如关节制动的有点比较其他造模方法有点较多,不足之处仅仅在于外用固定器的脱落。
结合不同的造模方式优点和不足以及本实验自身要求,将选择关节制动法进行造模。
第一我们需要对实验的大耳兔进行喂养一周,这一周的时间内对小动物生长环境进行有序的调整到实验所要求的环境下。
在这之后,将其进行随机的划分为实验组和正常组,每组各20个。
对于正常情况下不对对照组不进行处理,对于OA组使用关节制动法,制动法是通过改变应力诱导或加剧关节软骨退变进而建立骨关节炎,制动的时间越长,关节软骨的退变将逐渐加重[9]。
具体操作如下:
将兔子的毛减至0.6厘米左右,将兔子的左后肢膝关节固定于屈曲40°-45°位,利用高分子的石膏绷带将其固定于过屈位,石膏距髋关节3厘米,距踝关节2厘米,并在石膏绷带外面用细铁丝进行缠绕和等待石膏变硬后,将兔子置于笼子中。
在造模过程中不定期的驱赶兔子和观察兔子的状态。
若发现咬损严重、石膏脱落和关节变的肿胀等一系列的现象,因该立即重新固定兔子的肢膝关节。
在造模后第3周后我们不难发现骨关节炎病变程度随着时间成正比,在第8周时就出现了严重的骨关节炎外观形状。
造模第8周后实验人员通过对实验组进行X线摄影对该组的影像进行鉴定。
确定造模完成后用空气栓塞法[10]处死各组兔并在无菌条件下取造模膝关节软骨组织。
2.3病理学评分
取下实验组和对照组的关节软骨组织,用酶对软骨组织进行分离得到软骨细胞。
将两组的软骨细胞用质量分数为20%FBS的DMEM-F12、温度与兔子的体温一致、体积分数为5%的CO2、饱和湿度的细胞培养箱中常规的原代培养和传代培养。
用10%中性福尔马林溶液固定后,再用30%甲酸加上10%中性福尔马林再加60%双蒸水组成的30%甲酸混合溶液进行脱钙15d,随后脱水、透明、浸蜡以及包埋制成标准石蜡标本后切成4μm厚度的石蜡片样本,之后将石蜡标本进行常规的HE染色和番红O染色来进行病理学成模鉴定。
等软骨细胞传代培养的正常组和实验组48后提取该细胞培养液经过离心处理得到该细胞的上清液,然后再用ELISA法检测Wnt/β-catenin信号通路相关因子(β-catenin、ADAMTS-4、MMPs)、炎性介质和软骨的机制成分等一系列的蛋白水平。
对于染色之后的样本放在普通的光学显微镜下进行观察被染料侵染的细胞质的颜色、软骨细胞的各成分分布情况、细胞的形态和分布等各种情况并进行改良的Mankin评分[11]。
评分和分组标准为:
正常对照组通过影像观察,关节间隙和软骨的四层结构清晰可见,细胞基质均匀、形态正常,排列整齐以至于潮线完整,被番红O正常染色,此时改良Mankin评分将其评为0~1分;实验组中骨关节轻度退变的通过影像观察可见表面模糊,开始有骨赘形成和关节间隙消失,软骨表面有部分细胞固缩且结构紊乱,衬里细胞开始增生偏于一侧导致软骨表面凹凸不平、炎性细胞浸润和开始显现多个潮线,被番红O轻度的染色,此时改良Mankin评分将其评为2-5分;实验组中骨关节中度退变的比轻度骨关节稍微更严重点:
软骨表面已经凹凸不平和已经有很多的潮线,软骨细胞逐渐退化导致软骨层变薄,被番红O染色的程度比轻度组更加深,此时改良Mankin评分将其评为6-9分;实验组中骨关节重度退变的比中度骨关节稍微更加严重点:
关节软骨细胞基本退化以至于骨关节正常结构被完全破坏,细胞的排列杂乱无章,形态也不一致,细胞基质分布也不均匀,潮线几乎完全消失,被番红O染色的程度比中度组更加深,此时改良Mankin评分将其评为10-14分。
2.4细胞因子检测
我们将会使用ELISA法对血清中的炎性因子:
IL-1β、IL-18和IL-33进行检测。
实验组和对照组进行骨关节处进行取血,将其静置半小时左右后进行一刻钟的离心操作后,才将实验组和对照组的血清进行收集等待下一步的实验。
简言之:
取样、静置、离心和收集血清。
(1)建立可以与实验组进行对照的标准曲线,其步奏:
在做实验之前的15分钟,根据标准的实验指示将该实验的标准溶液配置好,大概实验时需要至少3个。
(2)往检测器中加入待测的溶液、溶剂和标准的溶液。
将标准品加到有被酶包裹板的那个容器,轻轻的振动是两者混合均匀。
为了使待测品稀释五倍:
先加入五分之四的样品稀释液,再加待测品五分之一。
简称:
加样。
(3)将配套的膜盖上并将其放到与体温相近的保温箱中,放置的时间将近1小时20分钟。
简称:
温育。
(4)将浓缩的洗涤液用蒸馏水稀释一定倍数后等待使用。
简称:
配液。
(5)待检测完成,首先将检测器中的溶液移除后将其放到专门清洗该容器的机器上并加入已经配置好的洗涤液进行清洗,清洗操作至少三次,并且最后一次应该用滤纸把容器上的液体吸干。
简称:
洗板。
(6)除了空白对照组外,实验组和标准组每个孔都应该加入酶的标准试剂。
简称:
加酶。
(7)将配套的膜盖上并将其放到与体温相近的保温箱中将近1小时30分钟。
简称:
温育。
(8)待检测完成,首先将检测器中的溶液移除后将其放到专门清洗该容器的机器上并加入已经配置好的洗涤液进行清洗,清洗操作至少三次,并且最后一次应该用滤纸把容器上的液体吸干。
简称:
洗板。
(9)将每个孔都加入A和B这两种显色剂,轻轻的摇晃几下使两个显色剂混合均匀后,为了实验更准,要将这两种显色剂放在没有光线的环境中的保温箱内,并且该保温箱的温度设置为与体温相近。
简称:
显色。
(10)每个孔中都加入终止液,是该反应终止。
简称:
终止。
(11)在终止试剂加入后,在15分钟内将要完成以下操作,用空白组来调零,再用450nm波长的去测定每个孔的吸光度。
将其操作完成后再多做几组这样的实验,来保证实验结果的准确性和可靠性。
2.5β-catenin、OPN和MMPs蛋白的检测
我们将使用蛋白质印迹(Westernblot)来检测软骨细胞中滑膜细胞的β-catenin、OPN和MMPs的表达情况,其步骤如下:
(1)提取细胞浆中的蛋白和该细胞核的蛋白;
(2)对第一步获取的胞浆蛋白和细胞核蛋白进行定量的蛋白测定,简称:
蛋白定量;
(3)电泳;
(4)转膜;
(5)用5%的driedskimmedmilk(脱脂奶粉)进行封闭;
(6)为了使一抗浓度得到我们需要的浓度,我们会使用5%的脱脂奶粉充当稀释液,再使用膜倒贴的方法对该浓度的抗体进行孵育,孵育时的温度为室温时间为1-3小时,简称:
一抗孵育;
(7)用TBST的方法对第六步所得的成品进行洗涤,每次洗涤时间10min,共4-5次;
(8)进行第二次孵育并加入一定量的HRP对二抗进行标记,孵育时的温度为室温时间为1-1.5小时之后操作与第八步中的洗涤一致;
(9)使用检测器在暗室中对其进行观察。
2.6统计分析
采用SPSS17.0进行统计分析。
计量资料以均数±标准差表示,采用t进行两组间比较的检验。
P<0.05为差异有统计学意义。
3预测实验结果
3.1病理检测的预期结果
通过石蜡标本影像观察和染色剂染色的评分结果,将实验组的评分由高到低依次分成:
轻度骨关节炎、中度骨关节炎和重度骨关节炎。
3.2细胞因子检测的预期结果
实验结果的预计,经过使用ELISA法对血清中的炎性因子IL-1β显示。
我们可以看出患者的IL-1β炎性因子比正常组要高出与多。
出数据我们不难发现,IL-1β表达最高是在轻度的患者中。
对于中度和重度而言,虽然它们的表达没有轻度患者的高,但它们会比正常组的高处于多。
因此该基因在刚刚患有骨关节炎时更加的活跃。
而对于IL-18和IL-33基因表达是随着骨关节炎患者程度加深逐渐增多。
细胞培养液的上清液中炎性因子的表达可以看出:
正常组中几乎没有炎性因子表达的产物而实验组中炎性因子更加的活跃,表达产物也比正常组要多很多,并随着骨关节炎程度的加深炎性因子表达产物增多,这种表达产物也将逐渐使得骨关节的组织细胞遭到某种程度的破坏。
3.3β-catenin、OPN和MMPs检测的预期结果
通过Westernblot检测发现正常组和实验组在滑膜细胞的胞浆中β-catenin都进行了表达,但实验组比对照组中的β-catenin更高并且两者的差异具有统计学的意义。
正常组的细胞核中没有发现β-catenin的表达,但对于实验组的细胞核内有β-catenin表达。
由此可以简单的推测:
正常的滑膜细胞的细胞浆会表达β-catenin蛋白且细胞核不会,但被损坏的软骨组织中β-catenin蛋白会过表达,在细胞浆中积累等积累到一定值时,会顺着浓度差向着细胞核转移,这样一来Wnt/β-catenin信号通路被激活。
而对于OPN,在正常的组织中OPN表达没有β-catenin在正常组织中表达活跃。
然而在患者中该基因的表达更加的活跃,这种活跃程度随着骨关节炎患者患病的程度的加深在逐步的加重。
使用该方法对MMPs检测显示。
在正常的组织中MMPs表达也没有β-catenin在正常组织中表达活跃。
然而在患者中该基因的表达更加的活跃,这种活跃程度随着骨关节炎患者患病的程度的加深在逐步的加重。
通过进一步的研究这两者的表达可能是随着β-catenin增多也在不断的增多。
4结论
OA是很普遍的骨关节疾病,被认为健康的三大杀手之一。
因此,人类高度重视更好的骨关节炎治疗方法的寻找。
随着科学技术高度发展,人们将技术与治疗骨关节炎的方式相结合。
因此,骨关节炎的治疗方法也得到了快速的发展。
在这之前,传统骨关节炎治疗方法中针灸治疗效果最为显著。
对于现代的骨关节炎治疗方式主要是以药物与非药物相结合,在治疗的过程中也要考虑患者的自身因素。
非药物治疗主要是以物理方式为主。
常用的非药物方法主要包括关节镜下清理术、关节置换术、降低氧分压、针刀疗法和减肥等。
对于严重骨关节炎最有效的治疗方式是关节置换手术。
然而氧分压和骨关节炎患病情况呈现一个恰恰反相关系,其中的内在联系如下:
萝卜硫素激Nrf2(nuclearfactor(erythroid-derived2)-like2)基因减少血红素氧化酶的表达[12],降低氧分压控制骨关节炎[13],从而达到治疗目的。
而针刀疗法是古代的针灸和现代微创手术结合形成的一种介于手术方法和非手术疗法之间的治疗方法。
其作用机制可能与抑制关节液中TNF-α、MMP-9的释放有关,进而恢复软组织动态平衡和生物力学平衡,具有治疗方式便捷和安全性高等优点,因此对各时期的骨关节炎治疗都取得满意疗效。
研究人员一致认为肥胖是引发骨关节炎重要的因素,适当的陆地上运动是非药物治疗最主要之一,同时Meta分析锻炼效果与非类固醇抗炎药类似[14],而药物治疗是以非甾体类消炎药为主。
非类固醇类抗炎药作为膝骨性关节炎的一线治疗药物,而非甾体类消炎药(nonsteroidalantiinflammatorydrugs,NSAIDs)被认为是治疗OA的首选的一线药物。
经常将两者制成外用制剂是为了在保证其可以缓解轻中度的关节疼痛同时将不良反应降低到最小。
如果将两者可以治疗的种类进行比较,非甾体抗炎药种类比较多。
这类药物参与治疗时,目的是抑制环氧化酶(COX)的表达,通过这个方式来降低下丘脑的敏感度,减少前列腺素(PG)的合成,来达到一定程度的治疗效果。
如果长期使用会增加胃肠道和肾功等损伤的风险[15]。
虽然此类治疗方式取得较好的疗效但出现的不良反应也比较多有时也比较严重。
因为软骨自身生理条件导致药物很难通过血液循环进入软骨中。
只能通过基质的渗透,因此骨关节炎很难被治疗。
为减少等待治疗的时间,直接将药物注入关节腔内,此方法被认为最有效的方法之一,在使用此方法的同时必须遵循小计量和长间隔原则。
注射药物有玻璃酸钠、对氨基葡萄糖(Glucosamine,GL)、糖皮质激素、透明质酸(Hyaluronicacid,HA)、帕米膦酸二钠和臭氧等。
其中玻璃酸钠是组成关节滑液重要成分之一,它被称为关节面间的润滑剂并能修复关节软骨,从而改善症状,保护关节,但GL虽作为软骨保护剂但并不比安慰剂组有效。
对于骨关节腔内注入糖皮质激素进行OA治疗,其疗效具有双重作用[16]:
一方面,能够减轻OA患者症状缓解疼痛,但病变没有进一步的改善。
另一方面,可能会引起糖尿病和骨质疏松等不良反应[17]。
HA为了临床应用的广泛将其制作成钠盐。
透明质酸钠可以进行软骨下骨的修复,改善软骨内的密度和厚度进而增加了关节的顺应性,疗效及安全性得到肯定并且且无明显不良反应[18]。
将药物制成钠盐并取得较好的疗效的还有帕米膦酸二钠。
短期使用可以完全抑制骨关节炎的产生,长期使用甚至能进一步的改
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