识别和鉴定稻瘟病菌在植物中表达的诱发水稻细胞死亡的分泌效应蛋白.docx
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识别和鉴定稻瘟病菌在植物中表达的诱发水稻细胞死亡的分泌效应蛋白
识别和鉴定稻瘟菌在植物中表达的诱发水稻细胞死亡的分泌效应蛋白
SongbiaoChen,1,2,3PattaviphaSongkumarn,2R.C.Venu,2MalaliGowda,2MariaBellizzi,2JinnanHu,2WendeLiu,1DanielEbbole,4BlakeMeyers,5ThomasMitchell,2andGuo-LiangWang1,2
1.中国农业科学院,植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100193;
2.美国俄亥俄州立大学,植物病理学系,哥伦布,OH43210
3.中国福建省农业科学院研究院,生物技术研究所,福州,350003
4.美国德州农工大学,植物病理学和微生物学系,学院站,TX79016
5.美国特拉华大学,特拉华生物技术研究所,新泽西州纽瓦克市,DE
摘要水稻和稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)之间的互作涉及到识别细胞的组成成分及两者之间复杂的分子信号交流。
这些相互作用在水稻细胞中是怎样发生仍然十分难懂。
我们采用基因表达的高通量序列分析技术,进行大规模平行信号测序,并通过合成测序来检查受感染的水稻叶片的转录组概况。
总共有6413个在植物中表达的真菌基因,其中包括851个基因编码的预测效应蛋白,被确定。
我们使用了原生质体的瞬时表达系统来评估42个预测效应蛋白的诱导植物细胞死亡的能力。
异位表达测定确认存在五个新型的效应子,当它们拥有用于分泌到胞外空间的信号肽时可引起宿主细胞的死亡。
其中四个在本塞姆氏烟草(Nicotianabenthamiana)中能诱导细胞死亡。
尽管五个效应都在其序列中表现出高度多样化,但是诱导每个细胞死亡的生理基础是相似的。
这项研究表明,我们的综合基因组方法能够有效的识别在稻瘟病菌在植物中表达的细胞死亡诱导效应,这种效应可能起着重要的作用,促进感染过程中定植与真菌生长。
关键词
分类号
IdentificationandCharacterizationofInplanta–ExpressedSecretedEffectorProteins
fromMagnaportheoryzaeThatInduceCellDeathinRice.SongbiaoChen,1,2,3PattaviphaSongkumarn,2R.C.Venu,2MalaliGowda,2MariaBellizzi,2JinnanHu,2WendeLiu,1DanielEbbole,4BlakeMeyers,5ThomasMitchell,2andGuo-LiangWang1,2
(1.StateLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China;
2.DepartmentofPlantPathology,TheOhioStateUniversity,Columbus,OH43210,U.S.A.;3.BiotechnologyResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,
Fujian350003,China;
4.DepartmentofPlantPathologyandMicrobiology,TexasA&MUniversity,CollegeStation,
TX79016,U.S.A.;
5.DelawareBiotechnologyInstitute,UniversityofDelaware,Newark,DE,U.S.A.)
InteractionsbetweenriceandMagnaportheoryzaeinvolvetherecognitionofcellularcomponentsandtheexchangeofcomplexmolecularsignalsfrombothpartners.Howtheseinteractionsoccurinricecellsisstillelusive.Weemployedrobust-longserialanalysisofgeneexpression,massivelyparallelsignaturesequencing,andsequencingbysynthesistoexaminetranscriptomeprofilesofinfectedriceleaves.Atotalof6,413inplanta–expressedfungalgenes,including851genesencodingpredictedeffectorproteins,wereidentified.Weusedaprotoplasttransientexpressionsystemtoassess42ofthepredictedeffectorproteinsfortheabilitytoinduceplantcelldeath.Ectopicexpressionassaysidentifiedfivenoveleffectorsthatinducedhostcelldeathonlywhentheycontainedthesignalpeptideforsecretiontotheextracellularspace.FouroftheminducedcelldeathinNicotianabenthamiana.Althoughthefiveeffectorsarehighlydiverseintheirsequences,thephysiologicalbasisofcelldeathinducedbyeachwassimilar.Thisstudydemonstratesthatourintegrativegenomicapproachiseffectivefortheidentificationofinplanta–expressedcelldeath–inducingeffectorsfromM.oryzaethatmayplayanimportantrolefacilitatingcolonizationandfungalgrowthduringinfection.
在自然界中,植物与其病原的协同进化导致双方都演变出一组策略用来攻击和防御。
植物病原体可首先使用细胞壁降解酶以消化细胞壁的表面层,以便于侵入。
成功的致病菌能够分泌多种细胞外分子以破坏宿主的防御机制。
这些细胞外分子包括质外体效应物,如毒力因子,毒素和充当关键毒力因子抑制宿主防御的降解酶(Hogenhout等,2009年)。
另一方面,植物进化出独特的机制来保卫自己,例如使用物理屏障,抗微生物化合物,和先天免疫系统。
植物免疫系统包含两重(Chisholm等.2006;Jones和Dangl2006)。
植物的第一重免疫的发起是通过宿主与膜相关的构型识别受体(PRR)来感知病原体或微生物相关的分子模式(PAMPs或MAMPs),这会引起植物的基础防御反应,称为PAMP触发免疫(Zhang和Zhou2010)。
第二重免疫的发起是通过同源抗性蛋白识别出所述无毒效应物,并快速激活超敏反应(HR),这会导致强烈的小种专化抗病性称为效应子触发的免疫。
在过去十年中,大量的研究都指向许多PAMP及其无毒效应物在植物病原菌和PRR和R蛋白在植物中的识别(Dodds等.2009)。
其中大部分良好表征的效应分子是来自于采用的III型分泌系统,直接递送效应物引入宿主细胞的原核细菌中。
与细菌不同,真菌和卵菌纲致病菌往往通过真核生物分泌途径(Panstruga和Dodds2009)向细胞外环境分泌效应蛋白。
在基因组测序技术的最新发展使得卵菌纲致病菌中众多的效应物迅速被发现,并在他们的结构和功能方面提供了丰富的信息。
例如,大豆疫霉根腐病和P.ramorum基因组的分析导致保守结构域RXLR和dEER的发现(Tyler等.2006),这对于将卵菌纲效应物的易位到植物细胞中是必要的(Dou等.2008a;Whisson等.2007)。
RXLR蛋白大家族的预测,这为卵菌纲效应的活动功能研究提供了丰富备选。
然而,由真菌导出的分泌蛋白似乎缺乏这种保守结构域,并我们对于其功能知之甚少。
这种半活体寄生真菌稻瘟病菌是水稻稻瘟病的病原,是最具破坏性的疾病,影响全世界水稻的生产(Dean等.2005;Ebbole2007;Talbot2003)。
在稻瘟病菌中,有更多的基因(多达1,306),这种鉴定的分泌蛋白的编码序列已经从一个实验室菌株的基因组中被预测,70-15(Dean等.2005;Yoshida等.2009)。
七个分泌性蛋白即PWL1,PWL2(Kang等.1995;Sweigard等.1995),AvrPita(Orbach等2000),Avr-Pia,Avr-Pii,Avr-Pik/km/kp(Yoshida等.2009),andAvrPiz-t(Li等.2009)已被确认为无毒(AVR)的蛋白质,由相应的抗性基因产物推测认可。
此外,一些分泌性蛋白对于致病性来说是必需的,即MPG1(Talbot等1993),EMP1(Ahn等.2004),MHP1(Kim等.2005),MSP1(Jeong等.2007),MC69(Saitoh等.2012),andSlp1(Mentlak等.2012),和四个活体营养相关的分泌性蛋白BAS1到BAS4(Mosquera等.2009)也被鉴定。
然而,大多数稻瘟病菌的分泌性蛋白在致病性的功能没有相关的实验进行测试。
为了识别稻瘟病菌的基因编码预测重度感病的叶片组织中分泌蛋白的表达,我们开发了一个综合的基因组表达图谱方法,包括高通量基因分析技术(RL-SAGE)(Gowda等.2004),大规模平行信号测序(MPSS)(Brenner等.2000;以及合成法测序(SBS)(German等l.2008;Venu等.2011a)。
受感染的组织是从6个时间点收集,以便在后期感染阶段真菌转录在植物中的表达可以包含在库中。
我们使用了原生质体瞬时表达分析,以确定稻瘟菌在植物中表达的分泌的蛋白诱导水稻的细胞死亡。
在42个蛋白质测试之中,5个诱导细胞死亡的蛋白是功能特性蛋白。
这里所描述的综合方法提供了用于真菌细胞死亡诱导蛋白功能鉴定的一种有效的策略,这涉及植物和真菌的相互作用。
1结果
1.1重度感病的水稻叶片基因表达谱分析。
为获得稻瘟菌与水稻亲和与不亲和的相互作用的过程中更为全面的基因表达谱,我们构建1个RL-SAGE,11个MPSS,和7个SBS库进行深度测序。
RL-SAGE库是在水稻叶片接种亲和的隔离种群Che86061,在接种后96个小时(hpi)产生的(图.1A)。
一共从库中获得了18154个显著特征。
其中,有3105(17.1%)个显著特征和12263(67.5%)个显著特征分别匹配于稻瘟病菌和稻的基因组。
不匹配的特征可能是由于测序错误或分布在两个基因组测序的间隙。
只有14个特征与稻瘟病菌和稻的基因组都匹配,这表示大部分特征都是基因组专用的。
我们确定了3091个特征明确地匹配稻瘟病菌的基因组,它们与3000个之前注明的稻瘟病菌的基因相对应。
11个MPSS库从野生型日本晴水稻或转基因日本晴水稻携带的抗稻瘟病基因Pi9(Qu等.2006)的叶片中产生的,其接种稻瘟菌在亲和(3,6,12,24,48,和96hpi)或不亲和(3,6,12,24,和48hpi)的相互作用中找出KJ201(图1A)。
正如预期的那样,在不亲和的相互作用相比,更多个特征码匹配到稻瘟病基因组中的亲和相互作用。
从五个不亲和的相互作用MPSS库中共获得了57671个显著特征。
其中,有724(1.2%)个显著特征和38024(65.9%)个显著特征分别唯一地匹配于稻瘟病菌和稻的基因组。
从六个亲和的相互作用库,总共获得了63132个显著特征。
其中,有2545(4%)个显著特征和41784(66.1%)个显著特征分别唯一地匹配于稻瘟病菌和稻的基因组。
总共有3216个注明的稻瘟病菌基因被同时从亲和和不亲和的MPSS库中鉴定。
相同的叶片组织用于产生MPSS库(亲和相互作用在6,12,24,和96hpi,并在不亲和的相互作用6,12,和24hpi)和七个SBS库的构建(图1A)。
从三个不亲和的相互作用的SBS库中一共获得了65299个显著特征码。
其中,3492(5.3%)个显著特征和49706(76.1%)个显著特征分别专门匹配于稻瘟病菌的基因组和水稻基因组。
从四个亲和相互作用SBS库中一共获得了68825个显著特征。
特征相匹配的的稻瘟病菌基因组有5283(7.7%)个,且那些匹配水稻基因组共有50756(73.7%)个。
来自亲和和不亲和的相互作用的SBS特征一起确定了4,781个已注明的稻瘟病菌的基因。
总而言之,在三种表达谱技术的作用下,一共有6413个稻瘟病菌在感染过程表达的已注明的基因被确定(图1A)。
1.2鉴定基因编码
1.2.1假定分泌蛋白在感染过程中的表达
众所周知分泌性蛋白在真菌与植物的相互作用中发挥着重要的作用(Rep2005;ZhangandZhou2010)。
因此,我们重点放在在上述转录库中确定的分泌蛋白基因的分析。
为了从在植物中表达的基因集合中获得最确切的分泌蛋白基因序列,我们用了两个稻瘟病菌分泌蛋白的数据集,一个是Dean和同事(2005)(简称数据集I),另一个由Choi和同事(2010)(简称为数据集Ⅱ),参考为人工标注。
共有851个截然不同的分泌蛋白基因从两个数据集中被确定(图1A,补充表S1)。
在大约有85.7%(264/308)个在数据集I发现的分泌蛋白基因也存在于数据集II中(图1E)。
在RL-SAGE,MPSS,和SBS这三个库中,用在相同的时间点从稻叶接种亲和分离菌为材料(96hpi)(RL-SAGE-96h,MPSS-96h,SBS-96h),与两个数据集I和II以及其他两个库相比,超过两倍以上分泌蛋白基因从SBS-96h库中被确定(图1C和D)。
图.1稻瘟病菌与水稻互作过程中的基因表达分析。
A,通过高通量基因分析技术(RL-SAGE),大规模平行信号测序(MPSS)以及合成法测序(SBS)进行基因表达谱的汇总统计,并确定在植物中表达的稻瘟病菌的基因编码的推定分泌蛋白。
B,分别从RL-SAGE-96小时,MPSS-96小时,和SBS-96小时库中鉴定出的所有稻瘟病菌基因的聚类分析。
C,从数据集I(Dean等.2005)中回收的假定的稻瘟菌分泌蛋白基因的聚类分析。
分别在RL-SAGE-96小时,MPSS-96小时,和SBS-96小时。
D,从数据集II(Dean等.2005)中回收的假定的稻瘟菌分泌蛋白基因的聚类分析。
分别在RL-SAGE-96小时,MPSS-96小时,和SBS-96小时。
E,分别从数据集I和数据集II中回收的所有时间点库中的假定稻瘟菌分泌蛋白基因的聚类分析。
为了对在植物中表达的分泌蛋白在水稻和稻瘟菌相互作用中的功能进行更深入的了解,我们进行了以基因本体(GO)为基础的分类。
以这种分类方法分析显示,大多数在植物中表达的分泌蛋白与代谢过程有关,接着是发育过程,细胞代谢过程,和多细胞有机体处理(图2A)。
对于分子功能,大多数在植物中表达的分泌蛋白与催化活性和结合相关(图2B)。
图2.基因本体论(GO)标注在植物中表达的稻瘟病菌的假定分泌蛋白。
A,基于生物学过程分类。
B,基于分子功能分类。
1.3瞬时表达分析确定了五个稻瘟菌的质外体效应能水稻细胞中诱导细胞死亡。
宿主细胞死亡是在植物-病原体相互作用中的一种普遍存在的特征。
为了确定稻瘟菌分泌的蛋白质参与了宿主细胞死亡,我们使用我们建立的方法,进行了对稻瘟菌分泌的蛋白质在水稻原生质瞬时表达(Chen等,2006)。
在试验中,细胞的死亡被监控通过感染β-葡萄糖醛酸酶基因在水稻原生质中减少的表达水平来表示(图.3A)(Dou等.2008b;Jia等.2000;Mindrinos等.1994;Yoshida等.2009).。
为了瞬时表达检测,共有42个分泌蛋白基因被克隆(补充表S2)。
对于每一个选择的基因,都构建了两种版本基因转染的质粒,一种含全长的开放读码框(ORF)(称为FL),另一个则包含截断的编码区,没有信号肽的序列,但具有工程改造ATG起始密码子(称为NS)。
瞬时测定法显示,在FL版本的42个分泌蛋白基因中有5个能够在水稻原生质表达时,引起的一个显著降低GUS活性(图3B),这表明这些5种蛋白在水稻细胞中可诱导水稻细胞的死亡。
另一方面,NS版本的42个检测基因瞬时表达没有导致细胞活力的任何降低。
因此,我们所指的5个分泌蛋白,,MGG_03356,MGG_05531,MGG_07986,MGG_08409和,MGG_10234,分别像MoCDIP1到MoCDIP5(稻瘟病菌的细胞死亡诱导蛋白)。
我们进一步用含有5个MoCDIP基因的双元载体进行水稻愈伤组织的农杆菌介导转化,看它是否能够获得稳定的的转基因株系并对这些基因的表达进行功能分析。
大约有600个愈伤组织用于每个结构的改造。
作为预期,无抗性的转基因愈伤组织在用FL-MoCDIP1,FL-MoCDIP2,FLMoCDIP3,orFL-MoCDIP4改造后逐一被获得,(数据未显示)。
与此相反,约有50至80个转基因愈伤组织在用NS-MoCDIP1,NS-MoCDIP2,NS-MoCDIP3,或NS-MoCDIP4转化后被获得,在我们的实验室,具有类似于正常转化效率的效率(约8%至15%为其它结构)。
有趣的是,在第一次用FLMoCDIP5转化时产生了约40个正常效率的转基因愈伤组织,无细胞死亡的表现型。
然而,当它们在选择培养基上培养2周后或更长的时间,所述转基因愈伤组织表现FL-MoCDIP5开始显示出细胞死亡的表现型(图3C)。
于其他NSMoCDIP类似,在无细胞死亡中观察到转基因愈伤组织表达NS-MoCDIP5(图3C)。
这些结果,与在水稻原生质体瞬时表达测定一致,证实了5个MoCDIP诱导的细胞死亡时,全长蛋白在水稻细胞中表达。
为了在功能上研究五个已鉴定的MoCDI的分泌功能,我们从先前公开的方法中选择酵母分泌测定法(Lee等l.2006)。
FL-MoCDIP和NS-MoCDIP的序列都被融合到缺少其自己的信号肽序列的酵母转化酶基因(SUC2)的N-末端的框架中。
该融合构建体被转化到酵母菌株DBYα2445中(Lee等.2006),一个缺少蔗糖转化酶的突变体,并将转化的酵母直接用蔗糖培养基培养,测定了分泌。
正如我们所预料的,用构建体,包括NS-MoCDIP-SUC2融合的酵母菌株在蔗糖培养基(补充图.S1)上不生长,原因是缺乏用来催化蔗糖分解为果糖和葡萄糖作为碳源的转化酶的分泌。
与此相反,所有五个含有FL-MoCDIP-SUC2融合的构建体使酵母突变株能够生长蔗糖培养基上,确认了5个MoCDIP的预测的信号肽的功能在于引导转化酶融合体的分泌途径。
这些结果,再加上其产物表明该信号肽需要MoCDIP在水稻细胞中表达以诱导稻的细胞死亡,显示这些蛋白最有可能作用于植物质外体空间。
然而,这些蛋白质在植物细胞中的确切的目标部位还有待进一步研究。
图3.鉴定五个在水稻细胞中诱导细胞死亡的植物中表达的假定分泌蛋白。
A,水稻原生质体瞬时表达分析的方法鉴定稻瘟病菌的分泌蛋白能诱导水稻细胞死亡的示意图。
稻原生质进行共转染用-葡糖醛酸酶(GUS)构建体(Promoter-GUS-Tnos)和其他携带稻瘟病菌分泌蛋白的基因的构建体(Promoter-M.ogene-Tnos)报道。
水稻细胞活力检测基于监视降低的GUS表达水平。
MoCDIP=稻瘟病菌细胞死亡诱导蛋白。
B,五个全长的MoCDIP在水稻原生质异位表达导致细胞活力降低。
CK=用GUS标记转染的原生质体样品和一个空载体对照;1to5=原生质体样品的转染用GUS标记,而另一个构建体分别携带MoCDIP1到MoCDIP5。
数据条显示出的平均值来自在一个实验中的三个一式三份的样品。
每个实验至少重复3次,具有相似的结果。
C,一个完整的而不是截断非–信号肽的MoCDIP5的异位表达导致转基因水稻愈伤组织细胞的死亡。
CK=空载体转化的水稻愈伤组织;NS-MoCDIP5=用携带截断非–信号肽构建的MoCDIP5转化的水稻愈伤组织;FL-MoCDIP5=携带切去顶端的全长MoCDIP5转化的水稻愈伤组织。
照片拍摄在约20天的时候,此时新获得的转基因愈伤组织保持在选择培养基上。
转化实验重复两次,观察到类似结果。
D,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对NS-MoCDIP5或FL-MoCDIP5在转基因水稻愈伤组织中表达的分析。
CK=与空载体转化的水稻愈伤组织对照的RT-PCR结果;1to3=来自三个独立的转基因愈伤组织系的RT-PCR结果。
1.4MoCDIP基因在受感染的叶子和附着胞中表达。
通过实验证实MoCDIP基因在感染的叶子上表达,并确定了它在附着胞和菌丝体上的表达模式,我们从接种分离出来的烈性敏感菌KJ201的日本晴水稻叶片中提取的RNA以及从稻瘟病菌附着胞和菌丝体中提取RNA,进行了逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)。
由于在早期感染阶段,真菌团在被感染的叶子中的比例很低,72hpi以前未检测到Mo28S转录。
于Mo28S转录相似,MoCDIP2和MoCDIP4转录物在72hpi时从被感染的水稻叶片中检测出来,在96hpi之前从感染水稻叶子中未检测到MoCDIP1,MoCDIP3,和MoCDIP5的转录(图4)。
这一结果证实了这5个MoCDIP在感染阶段表达。
我们对在MoCDIP1和MoCDIP2的转录物在附着胞和菌丝体的表达情况进行检测,结果显示与之前相比拥有相对较高的表达,MoCDIP3,MoCDIP4,和MoCDIP5的转录物只在附着胞中被检测到(图4)。
图4.五个稻瘟菌的细胞死亡诱导蛋白基因(MoCDIP)在植物中的表达模式。
总RNA样品是从接种后0,24,48,72,96,或120小时的感染的水稻叶片中提取的,使用特异性引物从外生稻瘟病菌附着胞(A)和菌丝体(M)进行反转录-聚合酶链式反应。
1.5MoCDIP在非寄主植物细胞中诱导细胞死亡。
许多病原菌的效应分子在非寄主植物细胞中能够诱导细胞死亡(Rep2005)。
为了确定的5个MoCDIP在非寄主植物细胞中是否影响细胞的死亡,我们在玉米(玉蜀黍),拟南芥和本塞母氏烟
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