薄层色谱法分离胆木中的生物碱.docx
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薄层色谱法分离胆木中的生物碱
2013年度本科生毕业论文
薄层色谱法分离胆木中的生物碱
学院:
理工学院
专业:
化学
年级:
2009级
学生姓名:
xxxxxx
学号:
xxxxxxxxx
导师及职称:
xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
2013年5月
2013AnnualGraduationThesis(Project)oftheCollegeUndergraduate
Thin-layerchromatographyseparationofalkaloidsinDanmu
Department:
SchoolofScienceandTechnology
Major:
Chemistry
Grade:
2009
Student’sName:
StudentNo.:
Tutor:
FinishedbyMay,2013
毕业论文(设计)原创性声明
本人所呈交的毕业论文(设计)是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
据我所知,除文中已经注明引用的内容外,本论文(设计)不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。
对本论文(设计)的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中作了明确说明并表示谢意。
作者签名:
日期:
毕业论文(设计)授权使用说明
本论文(设计)作者完全了解琼州学院有关保留、使用毕业论文(设计)的规定,学校有权保留论文(设计)并向相关部门送交论文(设计)的电子版和纸质版。
有权将论文(设计)用于非赢利目的的少量复制并允许论文(设计)进入学校图书馆被查阅。
学校可以公布论文(设计)的全部或部分内容。
保密的论文(设计)在解密后适用本规定。
作者签名:
指导教师签名:
日期:
日期:
毕业论文答辩小组成员名单
姓名
职称
单位
备注
摘要
采用常规化学方法对胆木茎生物碱进行提取、过滤与蒸馏,通过三中方法萃取胆木水相(氯仿萃取、乙酸乙酯萃取、正丁醇萃取)。
然后,采用柱层析的方法对胆木中的水溶性生物碱进行分离纯化,得到的样品使用薄层色谱法逐个点板,使用ZF7紫外分析仪,选取了样品g3、g7、g11、g15、g18、g20、g25的薄层色谱板进行分析,观察到薄层色谱板都至少有两个斑点,说明样品都至少含有两种以上的组分。
为胆木的进一步深入研究提供了可靠的资料。
关键词:
胆木;生物碱;柱层析
ABSTRACT
Byconventionalchemicalmethodsforextraction,filtrationanddistillationofNaucleastemalkaloids,throughthethirdmethodextractionDanmuaqueous(chloroformextraction,ethylacetateextraction,n-butanolextraction).Then,byusingthemethodofcolumnchromatographytoseparateandpurifybiliarytreesinthewatersolublealkaloids,samplesobtainedbyusingthin-layerchromatographyplate,usingZF7UVanalyzer,selectthethin-layerchromatographyplatesamplesG3,G7,G11,G15,G18,G20,G30analysis,observedthethin-layerchromatographyplatehasatleasttwospots,samplesthatcontainatleasttwoormorecomponents.Toprovidereliabledataforfurtherstudyofgallwood.
Keywords:
Danmu;Alkaloids;columnchromatography
目录
第一章前言1
1.1研究背景1
1.2研究现状1
1.3主要研究工作及意义2
第二章实验材料与方法2
2.1实验用品2
2.1.1材料和试剂2
2.1.2仪器设备2
2.2实验方法3
2.2.1胆木中生物碱的提取方法3
2.2.2胆木中生物碱的分离方法3
2.2.3实验流程4
2.2.4操作要点5
2.2.4.1胆木中化学成分的提取5
2.2.4.2过滤与蒸馏5
2.2.4.3氯仿萃取胆木醇提物5
2.2.4.4乙酸乙酯萃取胆木醇提物5
2.2.4.5正丁醇萃取胆木醇提物6
2.2.4.6柱层析6
2.2.4.7薄层点板7
第三章实验结果分析及讨论8
第四章结论11
参考文献12
致谢13
第一章前言
1.1研究背景
乌檀是一种珍稀野生树种。
别名胆木、山熊胆。
是一种重要的药用植物、枝、树皮均能入药。
性味苦、寒、入药有清热解毒、消肿止痛之效,常用于感冒发热、咽喉肿痛、外耳道疖肿、急性结膜炎、皮肤疖肿、急性扁桃体炎、支气管炎、肺炎、泌尿系统感染、肠炎、痢疾、胆囊炎等症的治疗。
【1】
图1.乌檀图2.胆木茎块
茜草科植物胆木的枝、树皮。
植物形态乔木,高可达5米以上。
树皮外面灰黄色,内皮与木质部剥后由浅黄色逐渐变为棕黄色,味极苦;枝条有白色皮孔。
叶对生,长圆形,近革质,长8~l4厘米,宽4~7厘米。
先端急尖,基部楔形.全缘,侧脉8对,两面都明显,叶柄长2~3厘米;托叶大,卵圆形,早落。
花白色,密集成一顶生的圆头状花序,有叶状苞片;萼管连成肉质体,花5数;子房下位。
果肉质,球形。
种子无翅。
花期8~9月。
生于高山近顶或半腰荫蔽潮湿地带。
分布我国南部。
采集全年可采。
洗净切片,晒干。
化学成分茎含黄酮甙、酚类。
1.2研究现状
以前的研究发现乌檀有较强的抗菌作用,但是抗菌物质不十分明确,国内外对乌檀属植物的化学成分研究主要集中于生物碱,先后从皮、枝干、花、果实中分离得到了40余种生物碱;【2】而对胆木的其他化学成分研究相对较少,但为进一步阐明胆木的有效成分,本实验对胆木进行了进一步的化学研究,国内曾经对乌檀中的化学成分进行过研究,主要成分是生物碱类【3】、三萜类【4】甾醇类【5】等化合物。
1.3目的及意义
胆木当中有效的药用成分是相当多的,利用薄层色谱法方法分离提纯的到不同的化学成分,目前胆木中的化学成分虽然有很多被分离鉴定出来了,但是仍然有许多的化学成分并未分离鉴定出来,仍有很大的研究空间。
生物碱是自然界中广泛存在的一大类碱性含氮化合物,具有广泛的生理功能,是许多药用植物的有效成分,目前运用于临床的生物碱药品已达80种之多,相当多的生物碱具有抗肿瘤活性、低毒性和成本低之特性,因而引起了人们的广泛关注【6】。
第二章实验材料与方法
2.1实验用品
2.1.1材料和试剂
胆木茎(海南制药厂购买)
95%乙醇AR(化学纯)
乙酸乙酯AR
石油醚AR
正丁醇AR
氯仿AR
异丙醇AR
2.1.2仪器设备
(1)DHG-92435型电热恒温鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械制药有限公司);
(2)DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司);
(3)BC—R206旋转蒸发器(上海贝凯生物化工设备有限公司);
(4)SHB—Ⅲ循环水式多用真空泵(广州市星烁仪器有限公司);
(5)DLSB—540低温冷却液循环泵(巩义市予华仪器有限责任公司);
(6)ZF7三用紫外分析仪(巩义市予华仪器有限责任公司);
(7)BT300—2T精密蠕动泵(常州市科健蠕动泵厂)
(8)TD—50微型提取浓缩机组(浙江瑞安天众医药化工机械有限公司)
(9)YRT—3熔点仪(天太天发有限公司)
(10)电子分析天平(精密度0.001g);
(11)酒精计
(12)玻璃仪器
2.2实验方法
2.2.1胆木中生物碱的提取方法
游离生物碱及其盐一般都能溶于甲醇或乙醇,因此用它们作为生物碱的提取溶剂,应用较为普遍,甲醇的沸点比乙醇更低,但甲醇对视神经的毒性很大,所以除了实验室有时用甲醇为生物碱提取溶剂外,一般用乙醇为溶剂。
醇提法对根及根茎类药材的提取适用,含淀粉较多的块根类药材水煎时易使淀粉糊化,影响成分浸出,故选醇提法为宜。
但乙醇的防火等级高,一般采用稀乙醇(60%~70%)或酸性乙醇为提取溶剂。
醇提法的提取液中除含有生物碱及其盐外,还含有大量的其它脂溶性杂质,还有一些水溶性杂质,需进一步处理。
用乙醇提取(渗漉、浸渍、加热回流等),减压回收溶剂,得总生物碱。
2.2.2胆木中生物碱的分离方法
随着新技术如分子印迹、高速逆流色谱的发展和应用,大大简化了过程、提高了纯化效率。
众所周知生物碱的分离方法的确很多,既有经典的分离方法,如溶剂萃取法、蒸馏法、沉淀法、盐析法、结晶法、膜渗透升华法等【7】,也有较为现代、先进的分离方法,如色谱分离法。
主要是利用二氧化硅作为填料,是较为常用的柱色谱分离方法。
硅胶是中性无色颗粒,其性能稳定。
硅胶层析柱适用范围广,既能用于非极性生物碱也能用于极性生物碱,且成本低,操作方便,是常见的生物碱的分离方法。
2.2.3实验流程图
2.2.4实验步骤
2.2.4.1胆木中化学成分的提取
将4kg的胆木茎粉碎,装入微型提取浓缩机组的提取罐中,然后加入20kg60%的乙醇混合,在70~75℃煮约2h,将提取液流入浓缩罐中浓缩至浓缩液3L;再加20kg60%的乙醇,在70~75℃煮约2h,将提取液流入浓缩罐中浓缩至浓缩液3L;再加20kg60%的乙醇,在70~75℃煮约2h,将提取液流入浓缩罐中浓缩至3L,浓缩液装入瓶中,加入3L的65%的乙醇浸泡2天。
2.2.4.2过滤与蒸馏
(1)将6L的胆木醇提物,使用SHB—Ⅲ循环水真空泵进行抽滤;首先使用单层的纱布粗过滤一遍,另用双层滤纸过滤一遍,再用一张滤纸过滤两遍,将滤液装入8L的三角瓶中。
(2)将6L的滤液在BC—R206旋转蒸发器上进行多次浓缩,温度设在70℃,最终得到1L的浓缩液,即为1L的水。
2.2.4.3氯仿萃取胆木醇提物
向1L的醇提物中加入1.2L的氯仿混合,充分震荡,静置6min等溶液分层,使用1L的分液漏斗将醇提物与氯仿分液;将分离出来的氯仿使用旋转蒸发器进行蒸馏,直至几乎蒸干;重复步骤,将回收的氯仿再次倒入分液后的醇提物中进行萃取,充分震荡,静置,然后分离,再次使用旋转蒸发器进行蒸馏,直至蒸干;再次重复步骤,将回收的氯仿再次倒入分液后的醇提物中进行萃取,充分震荡,静置,然后分离,再次使用旋转蒸发器进行蒸馏,直至蒸干,将氯仿回收。
3次蒸馏之后,在旋转蒸发瓶中所得的固体有机物,使用约40ml的有机溶剂(含有乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、甲醇、石油醚),将旋转蒸发瓶中的固体有机物清洗出来置于烧杯中,待用。
2.2.4.4乙酸乙酯萃取胆木醇提物
向将氯仿萃取过的胆木水提醇提物中加入1.2L的乙酸乙酯,充分震荡,静置6min等溶液分层,使用1L的分液漏斗将醇提物与乙酸乙酯分液,然后将分离出来的有机溶剂乙酸乙酯使用旋转蒸发器进行蒸馏,直至几乎蒸干;重复步骤,将回收的乙酸乙酯再次倒入分液后的醇提物中进行萃取,充分震荡,静置,然后分液,再次使用旋转蒸发器进行蒸馏,直至蒸干;再次重复步骤,将再次回收的乙酸乙酯再次倒入分液后的醇提物中进行萃取,充分震荡,静置,然后分离,再次使用旋转蒸发器进行蒸馏,直至蒸干,将乙酸乙酯回收。
3次蒸馏之后,在旋转蒸发瓶中所得的固体有机物,使用约20ml的有机溶剂将旋转蒸发瓶中的固体有机物清洗出来置于烧杯中,待用。
2.2.4.5正丁醇萃取胆木醇提物
向将氯仿、乙酸乙酯萃取过的胆木水提醇提物中加入1.2L的正丁醇,充分震荡,静置6min等溶液分层,使用1L的分液漏斗将醇提物与正丁醇分液,然后将分离出来的有机溶剂正丁醇使用旋转蒸发器进行蒸馏,直至几乎蒸干;重复步骤,将回收的正丁醇再次倒入分液后的醇提物中进行萃取,充分震荡,静置,然后分液,再次使用旋转蒸发器进行蒸馏,直至蒸干;再次重复步骤,将再次回收的正丁醇再次倒入分液后的醇提物中进行萃取,充分震荡,静置,然后分离,再次使用旋转蒸发器进行蒸馏,直至蒸干,将正丁醇回收。
3次蒸馏之后,在在旋转蒸发瓶中会有一些固体有机相,使用约60ml的有机溶剂将旋转蒸发瓶中的固体有机物清洗出来置于烧杯中,待用。
2.2.4.6柱层析
(1)将由氯仿萃取后的到的有机相加入适量的硅胶G进行拌样,用玻璃棒搅拌15min,待过柱子用。
(2)将层析柱固定好,先向里加入石油醚与硅胶G混合搅拌的混合物,使硅胶G均匀的分布在层析柱中,直至加入的硅胶G达到约2/3的体积,石油醚的液面要高于硅胶G的表面。
(3)向层析柱中缓慢的加入拌好的样品,使样品均匀的平整的覆盖在硅胶G上,然后用一层硅胶G在均匀的覆盖在样品上,厚度约1-2厘米。
在在上面覆盖一层棉花,目的是为了防止加入流动相的时候对样品有较大的冲击,因而影响到了实验的成功。
(4)向层析柱中依次加入的流动相的极性将要依次增大,首先向层析柱中加入石油醚(极性为0.01)500ml,层析柱底部流出的流动相流入旋转瓶中约200ml为一次,在旋转蒸发器上蒸馏,把石油醚回收用于继续过柱子使用,旋转瓶中的液体剩余量约为10-20ml,然后倒入三角瓶中,把旋转瓶用石油醚洗干净也倒入同一个三角瓶中,编上序号a1……a30。
按照同样的方法依次向层析柱中加入以下流动相:
石油醚3:
1乙酸乙酯(极性为:
0.01*75%+4.3*25%=1.075)共500ml,
石油醚1:
1乙酸乙酯(极性为:
0.01*50%+4.3*50%=2.15)共500ml,
石油醚1:
3乙酸乙酯(极性为:
0.01*25%+4.3*75%=3.23)共500ml,
乙酸乙酯(极性为:
4.3)500ml,
甲醇(极性为:
6.6)500ml,
加入回收后的石油醚,乙酸乙酯,甲醇的混合有机溶剂作为流动相。
最终得到35瓶的分离物品,编号为b1……b35,待测纯度。
2.2.4.7薄层点板
(1)将之前过柱子得到的样品a1……a30,按顺序逐个点板,做好实验记录,把相同的样品合并起来。
(2)过程方法:
将F1样品用有机溶剂溶解,多数采用乙酸乙酯,待样品完全溶解之后,用移液枪移取50微升到PC管中,然后稀释10倍,待用。
(3)点样:
使用直径为1mm的毛细管稍稍沾取少量的稀释样品在薄层板上进行点样,点样原点应小而圆,距离板的边缘2cm。
一般可以在板上点2-3个点,需要可多次点样(每次挥干后),防止边缘效应,点样量勿超载,防止拖尾,点样也勿伤及薄层表面。
(4)展开:
:
首先尝试自配展开剂,采用二元展开剂,即首先尝试石油醚1:
1乙酸乙酯(极性为:
0.01*50%+4.3*50%=2.15),根据具体的情况增加或减小展开剂的极性。
然后将步骤(3)点好样品的薄层板一端放入展开剂中进行展开,直至展开剂距离顶部还有0.5cm-1cm处取出。
(5)定位:
将展开后的的薄层板放在ZF7三用紫外分析仪上进行观察,会观察到1个或多个斑点,观察到的斑点的Rf值落入0.3-0.7为最佳,若Rf>0.7,则应该减小极性剂的比例,若Rf<0.3,则应该增加极性的比例。
将观察到最佳的效果记录下来。
将在ZF7三用紫外分析仪观察后的薄层板,用碘缸来显色。
即将薄层板放入碘缸中,盖好瓶盖,尽量避免光线,约5min后取出观察,并记录下来,进一步确定,并与ZF7三用紫外分析仪观察的结果进行对比。
(6)将编号a1……a30所有点的板都记录下来,若观察到的只有一个斑点的板就初步判断为一种物质或说是纯的,等待进一步进行检测;若观察到有多个斑点的或是有同样斑点的就进行合并,用于继续过柱子分离。
第三章实验结果与分析
通过点板,在ZF7三用紫外分析仪观察下,得到了样品图像。
(1)以3石油醚+1乙酸乙酯为展开剂,极性为0.01*75%+4.3*25%=1.075,a3~a6得到的薄层板的图像:
(2)以3石油醚+1乙酸乙酯为展开剂,极性为0.01*75%+4.3*25%=1.075,a7~a10得到的薄层板的图像:
(3)以3石油醚+1乙酸乙酯为展开剂,极性为0.01*75%+4.3*25%=1.075,a11~a14得到的薄层板的图像:
(4)以1石油醚+1乙酸乙酯为展开剂,极性为:
0.01*50%+4.3*50%=2.15得到a15~a17的薄层板的图像:
(5)以1石油醚+1乙酸乙酯为展开剂,极性为:
0.01*50%+4.3*50%=2.15得到a18~a19的薄层板的图像:
(6)以1石油醚+1乙酸乙酯为展开剂,极性为:
0.01*25%+4.3*75%=3.23得到a20~a24的薄层板的图像:
(7)以1石油醚+1乙酸乙酯为展开剂,极性为:
0.01*25%+4.3*75%=3.23得到a25~a30的薄层板的图像:
第四章结论
根据所得点板的样品,a3~a6的薄层板显示的斑点有3个,初步确定a3~a6的纯净化合物有三种。
a7~a10的薄层板显示的斑点有3个,确定a7~a10的纯净化合物有三种。
a11~a14的薄层板显示的斑点有4个,确定a11~a14的纯净化合物有四种。
而且,从斑点之间的距离来看,体现出该混合物容易和展开剂分离。
a15~a17的薄层板显示的斑点有4个,确定a15~a17的纯净化合物有四种。
a18~a19的薄层板显示的斑点有4个,确定a18~a19的纯净化合物有四种。
a20~a24的薄层板显示的斑点有5个,确定a20~a24的纯净化合物有五种。
a25~a30的薄层板显示的斑点有5个,确定a25~a30的纯净化合物有五种。
经过柱层析之后,得到的样品配制合适的展开剂,初步分离出来纯净的化合物。
根据生物碱提取分离的特点,综合上述提取方法可以看出薄层色谱法对胆木的提取经济实惠,但存有不足。
伴随着科学技术的不断进步和发展,人们将发现更多新的生物碱,生物碱独特效能也将不断发掘并得到广泛应用。
为了最大限度的发挥生物碱的临床应用,优化生物碱的提取工艺,使中药走向现代化将成为人们努力的目标。
生物碱提取与分离的方法将得到更加深入地研究和开发。
参考文献
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致 谢
感谢琼州学院,培养塑造了我,提供给我成长的良好环境。
感谢我的导师,本论文是在导师的悉心指导下完成的。
导师渊博的专业知识,严谨的治学态度,精益求精的工作作风,诲人不倦的高尚师德,严以律己、宽以待人的崇高风范,朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。
不仅使我树立了远大的学术目标、掌握了基本的研究方法,还使我明白了许多待人接物与为人处世的道理。
本论文从选题到完成,每一步都是在导师的指导下完成的,倾注了导师大量的心血。
在此,谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢!
最后,感谢同组实验同学对我的大力支持和帮助。
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