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高效液相色谱法同时测定甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草素含量
【编者按】:
医药论文是科技论文的一种是用来进行医药科学研究和描述研究成果
的论说性文章。
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高效液相色谱法同时测定甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草素含量
作者:
陈云华,赵晓霞,王文全,段天璇
【摘要】目的建立同时测定甘草中甘草酸、甘草苷和异甘草素含量的方法。
方法
采用高效液相色谱法对甘草粉末的67%甲醇提取物进行分析。
用C18反相色谱柱,1%
磷酸水-乙腈梯度洗脱,对不同色谱峰分别采用248、276、360、370nm紫外波长检测。
结果甘草酸的回归方程为Y=1106X+16220,r2=1;甘草苷的回归方程为Y=2106X+49
444,r2=0.9995;异甘草素的回归方程为Y=1107X+4.4667,r2=1。
甘草酸、甘草苷和异甘
草素的加样回收率分别为98.01%、102.63%、98.18%。
结论本方法准确、稳定、可靠,
可用于甘草中甘草酸、甘草苷和异甘草素3种成分的同时测定。
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【关键词】甘草;甘草酸;甘草苷;异甘草素;高效液相色谱法;含量测定
Abstract:
ObjectiveTodevelopaHPLCquantitativelytestmethodofglycyrrhizin,
liquiritinandisoliquritigeninsimultaneouslyforlicorice.MethodsThe67%methanolextracts
oflicoricepowderwereanalyzedbyreverse-phaseHPLConanODScolumn,usinga
gradientelutionwithamixtureof1%H3PO4andacetonitrile.Theeluatewasmonitoredby
UVabsorptionat248,276,360and370nm.ResultsThelinearequationofglycyrrhizinwas
Y=1106X+16220,r2=1.ThelinearequationofliquiritinwasY=2106X+49444,r2=0.999
5.ThelinearequationofisoliquritigeninwasY=1107X+4.4667,r2=1.Therecoveryrateof
glycyrrhizin,liquiritinandisoliquritigeninwas98.01%,102.63%and98.18%respectively.
ConclusionThemethodisaccurate,stableamdreliable,andcanbeusedtodeterminethe
threemainchemicalcontentssimultaneously.
Keywords:
Licorice;glycyrrhizin;liquiritin;isoliquritigenin;HPLC;contentdetermination
在甘草质量研究中,建立稳定可靠的甘草多种成分含量测定非常必要。
甘草酸、甘草
苷、异甘草素是甘草中代表性成分,甘草酸是皂苷类代表,甘草苷是黄酮类代表,而异甘草
素是一种异黄酮类成分。
我们此次在以往工作的基础上[1],完善了甘草含量测定方法,使
其同时可以对甘草酸、甘草苷、异甘草素进行含量测定。
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1仪器与试药
Agilent1100型高效液相色谱仪(配有G1314A紫外检测器、1315BDAD检测器、
G1311A四元梯度泵、G1322A在线脱气装置、G1316A柱温箱);Agilent1100化学工作
站;SartoriusBS110S1/万、BP211D1/(10万)电子分析天平;KL3120D超声清洗机。
甘草GlycyrrhizauralensisFisch.3年生采自甘肃总寨,1~5年生采自内蒙古杭锦旗,由
北京中医药大学王文全教
授鉴定。
60℃干燥过夜并粉碎。
甘草酸、甘草苷、异甘草素对照品(批号分别为
060520、061009、060801)由上海康九化工公司提供(供含量测定用)。
乙腈为色谱纯;水
为市售娃哈哈纯净水;甲醇、甲酸、磷酸、冰醋酸为分析纯。
2方法与结果
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中药新药药理毒理研究用样品的质量控制浅谈
【关键词】中药新药;样品质量;质量控制;药理毒理
中药新药研究具有系统性、阶段性和复杂性的特点,其研究涉及药学、药效毒理、临
床等多方面的内容。
每一方面的研究内容都包含大量的试验,通过这些研究获得科学的
试验证据,以了解和确认药品的安全性、有效性和质量可控性。
对研究用样品进行良好
的质量控制,用质量均一的样品进行研究是正确认识药品安全性、有效性、质量可控性
的前提,也有利于对试验过程中出现的问题进行分析。
笔者拟对目前中药新药药理毒理
研究用样品在质量控制方面的注意事项进行初步分析和讨论,供同行参考。
1中药新药研究用样品进行质量控制的必要性
中药新药研究的系统性要求对研究用样品进行良好的质量控制。
新药研究需要多学
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科协同,运用不同方法,从不同角度对相同的对象进行研究。
如果中药新药的药效、毒理
等研究中使用了不同批次的样品,则可能因样品的质量差异较大,而难以准确判断药品的
安全性和有效性。
特别是当新药研究的不同试验分别由不同单位承担时,尤其需要关注
研究用样品质量的均一性,并进行严格的质量控制。
中药新药研究的阶段性要求对研究用样品进行良好的质量控制。
在新药研究的不同
阶段,药材、工艺及稳定性等研究的成熟程度不同,样品的质量也有一定的差异。
故需要
将研究用样品的质量波动控制在一定的范围内,才能保证不同阶段研究结果之间的衔
接。
一般而言,药理毒理研究用样品、临床试验用样品,以及大生产样品的质量应基本一
致,这样才能使临床前研究结果为临床试验提供可靠的参考,使临床试验准确反映上市后
产品的有效性及基本的安全性信息。
尤其当新药研究的时间跨度较大时,需要关注不同
研究阶段所用样品质量的均一性。
中药新药成分的复杂性要求对研究用样品进行良好的质量控制。
由于中药新药所含
成分相对复杂,大多数中药复方制剂的有效成分、毒性成分都不十分明确,且影响中药质
量的因素较多,需要从原辅料、制备工艺、质量检验、贮存条件、包装等多方面进行全
过程的控制,才能保证中药新药研究用不同批次产品质量的相对一致,保证研究结果准
确、可靠,并经得起重复。
2药效毒理研究用样品的质量控制
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中药药效毒理研究用样品的形式一般有药材粉末、浸膏(包括经调节pH或渗透压、
除鞣质、加表面活性剂、增稠剂等处理后的浸膏)、有效成分及有效部位、制剂、含药
血清等,应根据研究需要制备符合相应要求的样品。
2.1样品的制备
一般应在处方、工艺等基本确定后,在中试以上规模制备样品。
以浸膏等中间体的形
式给药时,可采用中试规模的中间体为样品。
2.1.1药材粉末
往往需要加一定量的水,将药粉混匀后以混悬液的形式给药。
此时需关注药粉混悬的
均匀度,特别是当处方中含矿物药或不同药材粉末的相对密度相差较大时,需避免不同相
对密度药材粉末分布不均匀的现象,每次吸取混悬液时应充分混匀;必要时可添加助悬剂,
并充分搅拌,但需说明其种类、用量及加入方式等。
2.1.2浸膏
在进行药效毒理研究时,往往需要设立多个不同给药剂量组,一般可通过改变浸膏中所
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含生药量(浓度)或给药容量来解决。
应说明样品的完整制备过程,避免不同批次样品在
制备过程中可能的质量差异。
如提取物浓缩或干燥的方法或条件(温度、压力、受热时
间等)不同,对样品中所含成分可能产生不同的影响。
研究过程中,如给予试验动物染菌
的样品,可能引起动物的炎性反应等,影响试验结果。
可根据情况对浸膏进行必要的灭菌
处理,以保证卫生学符合要求,应详细说明灭菌的方法和条件,并尽量与制剂的灭菌方法和
条件相近,避免灭菌条件过于剧烈而破坏药物的成分。
2.1.2.1整体试验用浸膏
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2.1检测波长的确定
分别称取甘草酸、甘草苷、异甘草素对照品适量,分别加甲醇配制成每1mL约含0.1
mg的对照品溶液。
以甲醇为空白,在波长190~400nm范围内扫描,结果甘草酸的最大
吸收波长为248nm和360nm,甘草苷的最大吸收波长为276nm,而异甘草素的最大吸收
波长为370nm。
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2.2色谱条件
色谱柱:
AgilentZorbaxExtend分析柱(4.6mm250mm,
5柱温:
25℃;进行梯度洗脱,流动相A为1%磷酸水溶液,流动相B为乙腈;梯度程
序、流速及检测波长变化见表1。
进样量为10L。
表1流动相梯度条件及检测波长(略)
2.3供试品溶液的制备
精密称取甘草粉末(过60目筛,60℃干燥12h)0.1g,置25mL容量瓶中,加入20mL
67%甲醇冷浸24h,超声30min,放至室温,加67%甲醇至刻度,摇匀,以0.45m微孔滤膜滤
过,取续滤液即得。
2.4工作曲线
称取甘草苷对照品6.28mg、甘草酸对照品5.99mg,分别用甲醇定容于25mL容量瓶
中,作为甘草苷和甘草酸对照品储备液。
另取异甘草素对照品4.35mg,置25mL容量瓶
中,以甲醇溶解并稀释至刻度,再精密吸取0.4mL置10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,即
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得异甘草素储备液。
分别精密吸取甘草苷储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL,甘草
酸储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL,异甘草素储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、
0.6mL,置6个10mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,作为系列混合标准溶液。
分别进样
20L,记录甘草苷、甘草酸和异甘草素的峰面积。
以峰面积对进样量(g)进行回归,得回归
方程。
甘草酸:
Y=1106X+16220,r2=1;甘草苷:
Y=2106X+49444,r2=0.9995;异甘草
素:
Y=1107X+4.4667,r2=1。
色谱图见图1。
甘草苷、甘草酸、异甘草素色谱峰理论塔
板数分别为4万、14万和21万。
2.5精密度试验
取上述混合标准溶液,连续进样6次,结果甘草酸、甘草苷、异甘草素的峰面积RSD
分别为0.65%、0.35%、0.40%,表明精密度符合要求。
2.6稳定性试验
取甘肃总寨甘草样品1份,按2.3项下方法制备供试品溶液,室温放置并于0、2、4、
6、8、10h进样,记录色谱图,代表性色谱图如图2。
故以甘草酸、甘草苷和异甘草素三
者的峰面积计算10h的稳定性。
结果甘草酸、甘草苷、异甘草素峰面积RSD分别为
0.29%、0.49%、0.85%,表明甘草供试品在10h内稳定。
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2.7重复性试验
取甘肃总寨甘草样品6份,每份0.1g,精密称定,按2.3项下方法制备供试品溶液,依法
测定,结果甘草酸、甘草苷和异甘草素的峰面积RSD分别为2.15%、2.10%、2.63%,表
明本法重复性好。
2.8加样回收率试验
称取甘草苷对照品适量,加甲醇制备成每1mL含0.663mg的对照品溶液;称取甘草酸
对照品适量,加甲醇制备成每1mL含0.6115mg的对照品溶液;取甘肃总寨甘草样品6
份,每份0.05g,精密称定,分别置6个25mL容量瓶内,分别加入上述甘草苷对照品溶液2
mL、甘草酸对照品溶液4mL、2.3项中的异甘草素储备液1mL,再分别按照2.3项
下方法制备得供试品溶液,依法试验,记录甘草苷、甘草酸和异甘草素的峰面积,并计算加
样回收率,结果加样回收率符合规定。
结果见表2。
表2甘草酸、甘草苷、异甘草素的
加样回收率试验结果(略)
2.9样品测定
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