第四章蛋白质.docx

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第四章蛋白质

第四章蛋白质

提要

一.概念

简单蛋白、结合蛋白、基本氨基酸、等电点、甲醛滴定法、Edman降解、一级结构、肽键、构型与构象、二面角、二级结构、超二级结构、结构域、三级结构、四级结构、亚基、别构蛋白、分子病、水化层、双电层、蛋白质的变性与复性、盐析与盐溶

二.氨基酸

分类、基本氨基酸的结构、分类、名称、符号、化学反应、鉴定、蛋白质的水解

三.蛋白质的结构

一级结构结构特点、测定步骤、常用方法、酶

二级结构四种结构特点、数据、超二级结构

三级结构主要靠疏水键维持

四级结构变构现象

结构与功能的适应、结构变化对功能的影响、典型蛋白质

四.蛋白质的性质

分子量的测定方法、酸碱性、溶解性、变性、颜色反应

第一节蛋白质通论

一、蛋白质的功能多样性

蛋白质是原生质的主要成分，任何生物都含有蛋白质。

自然界中最小、最简单的生物是病毒，它是由蛋白质和核酸组成的。

没有蛋白质也就没有生命。

自然界的生物多种多样，因而蛋白质的种类和功能也十分繁多。

概括起来，蛋白质主要有以下功能：

1.催化功能生物体内的酶都是由蛋白质构成的，它们有机体新陈代谢的催化剂。

没有酶，生物体内的各种化学反应就无法正常进行。

例如，没有淀粉酶，淀粉就不能被分解利用。

2.结构功能蛋白质可以作为生物体的结构成分。

在高等动物里，胶原是主要的细胞外结构蛋白，参与结缔组织和骨骼作为身体的支架，占蛋白总量的1/4。

细胞里的片层结构，如细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等都是由不溶性蛋白与脂类组成的。

动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。

3.运输功能脊椎动物红细胞中的血红蛋白和无脊椎动物体内的血蓝蛋白在呼吸过程中起着运输氧气的作用。

血液中的载脂蛋白可运输脂肪，转铁蛋白可转运铁。

一些脂溶性激素的运输也需要蛋白，如甲状腺素要与甲状腺素结合球蛋白结合才能在血液中运输。

4.贮存功能某些蛋白质的作用是贮存氨基酸作为生物体的养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。

此类蛋白质包括蛋类中的卵清蛋白、奶类中的酪蛋白和小麦种子中的麦醇溶蛋白等。

肝脏中的铁蛋白可将血液中多余的铁储存起来，供缺铁时使用。

5.运动功能肌肉中的肌球蛋白和肌动蛋白是运动系统的必要成分，它们构象的改变引起肌肉的收缩，带动机体运动。

细菌中的鞭毛蛋白有类似的作用，它的收缩引起鞭毛的摆动，从而使细菌在水中游动。

6.防御功能高等动物的免疫反应是机体的一种防御机能，它主要也是通过蛋白质（抗体）来实现的。

凝血与纤溶系统的蛋白因子、溶菌酶、干扰素等，也担负着防御和保护功能。

7.调节功能某些激素、一切激素受体和许多其他调节因子都是蛋白质。

8.信息传递功能生物体内的信息传递过程也离不开蛋白质。

例如，视觉信息的传递要有视紫红质参与，感受味道需要味觉蛋白。

视杆细胞中的视紫红质，只需1个光子即可被激发，产生视觉。

9.遗传调控功能遗传信息的储存和表达都与蛋白质有关。

DNA在储存时是缠绕在蛋白质（组蛋白）上的。

有些蛋白质，如阻遏蛋白，与特定基因的表达有关。

β－半乳糖苷酶基因的表达受到一种阻遏蛋白的抑制，当需要合成β－半乳糖苷酶时经过去阻遏作用才能表达。

10.其他功能某些生物能合成有毒的蛋白质，用以攻击或自卫。

如某些植物在被昆虫咬过以后会产生一种毒蛋白。

白喉毒素可抑制生物蛋白质合成。

二、蛋白质的分类

（一）按分子形状分类

1.球状蛋白外形近似球体，多溶于水，大都具有活性，如酶、转运蛋白、蛋白激素、抗体等。

球状蛋白的长度与直径之比一般小于10。

2.纤维状蛋白外形细长，分子量大，大都是结构蛋白，如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等。

纤维蛋白按溶解性可分为可溶性纤维蛋白与不溶性纤维蛋白。

前者如血液中的纤维蛋白原、肌肉中的肌球蛋白等，后者如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等结构蛋白。

（二）按分子组成分类

1.简单蛋白完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分。

如血清清蛋白等。

根据溶解性的不同，可将简单蛋白分为以下7类：

清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和硬蛋白。

2.结合蛋白由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基。

根据辅基的不同，可将结合蛋白分为以下7类：

核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白和金属蛋白。

三、蛋白质的元素组成与分子量

1.元素组成所有的蛋白质都含有碳氢氧氮四种元素，有些蛋白质还含有硫、磷和一些金属元素。

蛋白质平均含碳50％，氢7％，氧23％，氮16％。

其中氮的含量较为恒定，而且在糖和脂类中不含氮，所以常通过测量样品中氮的含量来测定蛋白质含量。

如常用的凯氏定氮：

蛋白质含量＝蛋白氮×6.25

其中6.25是16％的倒数。

2.蛋白质的分子量蛋白质的分子量变化范围很大，从6000到100万或更大。

这个范围是人为规定的。

一般将分子量小于6000的称为肽。

不过这个界限不是绝对的，如牛胰岛素分子量为5700，一般仍认为是蛋白质。

蛋白质煮沸凝固，而肽不凝固。

较大的蛋白质如烟草花叶病毒，分子量达4000万。

四、蛋白质的水解

氨基酸是蛋白质的基本结构单位，这个发现是从蛋白质的水解得到的。

蛋白质的水解主要有三种方法：

1.酸水解用6MHCl或4MH2SO4，105℃回流20小时即可完全水解。

酸水解不引起氨基酸的消旋，但色氨酸完全被破坏，丝氨酸和苏氨酸部分破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解。

如样品含有杂质，在酸水解过程中常产生腐黑质，使水解液变黑。

用3mol/L对甲苯磺酸代替盐酸，得到色氨酸较多，可像丝氨酸和苏氨酸一样用外推法求其含量。

2.碱水解用5MNaOH，水解10－20小时可水解完全。

碱水解使氨基酸消旋，许多氨基酸被破坏，但色氨酸不被破坏。

常用于测定色氨酸含量。

可加入淀粉以防止氧化。

3.酶水解酶水解既不破坏氨基酸，也不引起消旋。

但酶水解时间长，反应不完全。

一般用于部分水解，若要完全水解，需要用多种酶协同作用。

第二节氨基酸

一、氨基酸的结构与分类

（一）基本氨基酸

组成蛋白质的20种氨基酸称为基本氨基酸。

它们中除脯氨酸外都是α-氨基酸，即在α-碳原子上有一个氨基。

基本氨基酸都符合通式，都有单字母和三字母缩写符号。

按照氨基酸的侧链结构，可分为三类：

脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和杂环氨基酸。

1.脂肪族氨基酸共15种。

侧链只是烃链：

Gly,Ala,Val,Leu,Ile后三种带有支链，人体不能合成，是必需氨基酸。

侧链含有羟基：

Ser,Thr许多蛋白酶的活性中心含有丝氨酸，它还在蛋白质与糖类及磷酸的结合中起重要作用。

侧链含硫原子：

Cys,Met两个半胱氨酸可通过形成二硫键结合成一个胱氨酸。

二硫键对维持蛋白质的高级结构有重要意义。

半胱氨酸也经常出现在蛋白质的活性中心里。

甲硫氨酸的硫原子有时参与形成配位键。

甲硫氨酸可作为通用甲基供体，参与多种分子的甲基化反应。

侧链含有羧基：

Asp（D）,Glu（E）

侧链含酰胺基：

Asn（N）,Gln（Q）

侧链显碱性：

Arg（R）,Lys（K）

2.芳香族氨基酸包括苯丙氨酸（Phe,F）和酪氨酸（Tyr,Y）两种。

酪氨酸是合成甲状腺素的原料。

3.杂环氨基酸包括色氨酸（Trp,W）、组氨酸（His）和脯氨酸（Pro）三种。

其中的色氨酸与芳香族氨基酸都含苯环，都有紫外吸收（280nm）。

所以可通过测量蛋白质的紫外吸收来测定蛋白质的含量。

组氨酸也是碱性氨基酸，但碱性较弱，在生理条件下是否带电与周围内环境有关。

它在活性中心常起传递电荷的作用。

组氨酸能与铁等金属离子配位。

脯氨酸是唯一的仲氨基酸，是α-螺旋的破坏者。

B是指Asx，即Asp或Asn；Z是指Glx，即Glu或Gln。

基本氨基酸也可按侧链极性分类：

非极性氨基酸：

Ala,Val,Leu,Ile,Met,Phe,Trp,Pro共八种

极性不带电荷：

Gly,Ser,Thr,Cys,Asn,Gln,Tyr共七种

带正电荷：

Arg,Lys,His

带负电荷：

Asp,Glu

（二）不常见的蛋白质氨基酸

某些蛋白质中含有一些不常见的氨基酸，它们是基本氨基酸在蛋白质合成以后经羟化、羧化、甲基化等修饰衍生而来的。

也叫稀有氨基酸或特殊氨基酸。

如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、锁链素等。

其中羟脯氨酸和羟赖氨酸在胶原和弹性蛋白中含量较多。

在甲状腺素中还有3,5-二碘酪氨酸。

（三）非蛋白质氨基酸

自然界中还有150多种不参与构成蛋白质的氨基酸。

它们大多是基本氨基酸的衍生物，也有一些是D-氨基酸或β、γ、δ-氨基酸。

这些氨基酸中有些是重要的代谢物前体或中间产物，如瓜氨酸和鸟氨酸是合成精氨酸的中间产物，β-丙氨酸是遍多酸（泛酸，辅酶A前体）的前体，γ-氨基丁酸是传递神经冲动的化学介质。

二、氨基酸的性质

（一）物理性质

α-氨基酸都是白色晶体，每种氨基酸都有特殊的结晶形状，可以用来鉴别各种氨基酸。

除胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中。

脯氨酸和羟脯氨酸还能溶于乙醇或乙醚中。

除甘氨酸外，α-氨基酸都有旋光性，α-碳原子具有手性。

苏氨酸和异亮氨酸有两个手性碳原子。

从蛋白质水解得到的氨基酸都是L-型。

但在生物体内特别是细菌中，D-氨基酸也存在，如细菌的细胞壁和某些抗菌素中都含有D-氨基酸。

三个带苯环的氨基酸有紫外吸收，F:

257nm,ε=200;Y:

275nm,ε=1400;W:

280nm,ε=5600。

通常蛋白质的紫外吸收主要是后两个氨基酸决定的，一般在280nm。

氨基酸分子中既含有氨基又含有羧基，在水溶液中以偶极离子的形式存在。

所以氨基酸晶体是离子晶体，熔点在200℃以上。

氨基酸是两性电解质，各个解离基的表观解离常数按其酸性强度递降的顺序，分别以K1’、K2’来表示。

当氨基酸分子所带的净电荷为零时的pH称为氨基酸的等电点（pI）。

等电点的值是它在等电点前后的两个pK’值的算术平均值。

氨基酸完全质子化时可看作多元弱酸，各解离基团的表观解离常数按酸性减弱的顺序，以pK1’、pK2’、pK3’表示。

氨基酸可作为缓冲溶液，在pK’处的缓冲能力最强，pI处的缓冲能力最弱。

氨基酸的滴定曲线如图。

（二）化学性质

1.氨基的反应

（1）酰化

氨基可与酰化试剂，如酰氯或酸酐在碱性溶液中反应，生成酰胺。

该反应在多肽合成中可用于保护氨基。

（2）与亚硝酸作用

氨基酸在室温下与亚硝酸反应，脱氨，生成羟基羧酸和氮气。

因为伯胺都有这个反应，所以赖氨酸的侧链氨基也能反应，但速度较慢。

常用于蛋白质的化学修饰、水解程度测定及氨基酸的定量。

（3）与醛反应

氨基酸的α-氨基能与醛类物质反应，生成西佛碱-C=N-。

西佛碱是氨基酸作为底物的某些酶促反应的中间物。

赖氨酸的侧链氨基也能反应。

氨基还可以与甲醛反应，生成羟甲基化合物。

由于氨基酸在溶液中以偶极离子形式存在，所以不能用酸碱滴定测定含量。

与甲醛反应后，氨基酸不再是偶极离子，其滴定终点可用一般的酸碱指示剂指示，因而可以滴定，这叫甲醛滴定法，可用于测定氨基酸。

（4）与异硫氰酸苯酯（PITC）反应

α-氨基与PITC在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-AA），后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-AA）。

这些衍生物是无色的，可用层析法加以分离鉴定。

这个反应首先为Edman用来鉴定蛋白质的N-末端氨基酸，在蛋白质的氨基酸顺序分析方面占有重要地位。

（5）磺酰化

氨基酸与5-（二甲胺基）萘-1-磺酰氯（DNS-Cl）反应，生成DNS-氨基酸。

产物在酸性条件下（6NHCl）100℃也不破坏，因此可用于氨基酸末端分析。

DNS-氨基酸有强荧光，激发波长在360nm左右，比较灵敏，可用于微量分析。

（6）与DNFB反应

氨基酸与2,4-二硝基氟苯（DNFB）在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸（DNP氨基酸）。

这一反应是定量转变的，产物黄色，可经受酸性100℃高温。

该反应曾被英国的Sanger用来测定胰岛素的氨基酸顺序，也叫桑格尔试剂，现在应用于蛋白质N-末端测定。

（7）转氨反应

在转氨酶的催化下，氨基酸可脱去氨基，变成相应的酮酸。

2.羧基的反应

羧基可与碱作用生成盐，其中重金属盐不溶于水。

羧基可与醇生成酯，此反应常用于多肽合成中的羧基保护。

某些酯有活化作用，可增加羧基活性，如对硝基苯酯。

将氨基保护以后，可与二氯亚砜或五氯化磷作用生成酰氯，在多肽合成中用于活化羧基。

在脱羧酶的催化下，可脱去羧基，形成伯胺。

3茚三酮反应

氨基酸与茚三酮在微酸性溶液中加热，最后生成蓝色物质。

而脯氨酸生成黄色化合物。

根据这个反应可通过二氧化碳测定氨基酸含量。

4.侧链的反应

丝氨酸、苏氨酸含羟基，能形成酯或苷。

半胱氨酸侧链巯基反应性高：

（1）二硫键（disulfidebond）

半胱氨酸在碱性溶液中容易被氧化形成二硫键，生成胱氨酸。

胱氨酸中的二硫键在形成蛋白质的构象上起很大的作用。

氧化剂和还原剂都可以打开二硫键。

在研究蛋白质结构时，氧化剂过甲酸可以定量地拆开二硫键，生成相应的磺酸。

还原剂如巯基乙醇、巯基乙酸也能拆开二硫键，生成相应的巯基化合物。

由于半胱氨酸中的巯基很不稳定，极易氧化，因此利用还原剂拆开二硫键时，往往进一步用碘乙酰胺、氯化苄、N-乙基丁烯二亚酰胺和对氯汞苯甲酸等试剂与巯基作用，把它保护起来，防止它重新氧化。

（2）烷化

半胱氨酸可与烷基试剂，如碘乙酸、碘乙酰胺等发生烷化反应。

半胱氨酸与丫丙啶反应，生成带正电的侧链，称为S-氨乙基半胱氨酸（AECys）。

（3）与重金属反应

极微量的某些重金属离子，如Ag+、Hg2+，就能与巯基反应，生成硫醇盐，导致含巯基的酶失活。

5.以下反应常用于氨基酸的检验：

l酪氨酸、组氨酸能与重氮化合物反应（Pauly反应），可用于定性、定量测定。

组氨酸生成棕红色的化合物，酪氨酸为桔黄色。

l精氨酸在氢氧化钠中与1-萘酚和次溴酸钠反应，生成深红色，称为坂口反应。

用于胍基的鉴定。

l酪氨酸与硝酸、亚硝酸、硝酸汞和亚硝酸汞反应，生成白色沉淀，加热后变红，称为米伦反应，是鉴定酚基的特性反应。

l色氨酸中加入乙醛酸后再缓慢加入浓硫酸，在界面会出现紫色环，用于鉴定吲哚基。

在蛋白质中，有些侧链基团被包裹在蛋白质内部，因而反应很慢甚至不反应。

三、色谱与氨基酸的分析分离

1.色谱（chromatography）的发展史

最早的层析实验是俄国植物学家Цвет在1903年用碳酸钙分离叶绿素，属于吸附层析。

40年代出现了分配层析，50年代出现了气相色谱，60年代出现HPLC，80年代出现了超临界层析，90年代出现的超微量HPLC可分离ng级的样品。

2.色谱的分类：

按流动相可分为气相、液相、超临界色谱等；

按介质可分为纸层析、薄层层析、柱层析等；

按分离机制可分为吸附层析、分配层析、分子筛层析等

3.色谱的应用

可用于分离、制备、纯度鉴定等。

定性可通过保留值、内标、标准曲线等方法，定量一般用标准曲线法。

氨基酸的分析分离是测定蛋白质结构的基础。

在分配层析和离子交换层析法开始应用于氨基酸成分分析之后，蛋白质结构的研究才取得了显著的成就。

现在这些方法已自动化。

氨基酸从强酸型离子交换柱的洗脱顺序如下：

Asp,Thr,Ser,Glu,Pro,Gly,Ala,Cys,Val,Met,Ile,Leu,Tyr,Phe,Lys,His,（NH3）,Arg

第三节蛋白质的一级结构

　蛋白质是生物大分子，具有明显的结构层次性，由低层到高层可分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。

一、肽键和肽

一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩水形成的共价键，称为肽键。

在蛋白质分子中，氨基酸借肽键连接起来，形成肽链。

最简单的肽由两个氨基酸组成，称为二肽。

含有三、四、五个氨基酸的肽分别称为三肽、四肽、五肽等。

肽链中的氨基酸由于形成肽键时脱水，已不是完整的氨基酸，所以称为残基。

肽的命名是根据组成肽的氨基酸残基来确定的。

一般从肽的氨基端开始，称为某氨基酰某氨基酰…某氨基酸。

肽的书写也是从氨基端开始。

肽键象酰胺键一样，由于键内原子处于共振状态而表现出较高的稳定性。

在肽键中C－N单键具有约40％双键性质，而C=O双键具有40％单键性质。

这样就产生两个重要结果：

（1）肽键的亚氨基在pH0-14的范围内没有明显的解离和质子化的倾向；

（2）肽键中的C－N单键不能自由旋转，使蛋白质能折叠成各种三维构象。

除了蛋白质部分水解可以产生各种简单的多肽以外，自然界中还有长短不等的小肽，它们具有特殊的生理功能。

动植物细胞中含有一种三肽，称为谷胱甘肽，即δ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。

因其含有巯基，故常以GSH来表示。

它在体内的氧化还原过程中起重要作用。

脑啡肽是天然止痛剂。

肌肉中的鹅肌肽是一个二肽，即β-丙氨酰组氨酸。

肌肽可作为肌肉中的缓冲剂，缓冲肌肉产生的乳酸对pH的影响。

一种抗菌素叫做短杆菌酪肽，由12种氨基酸组成，其中有几种是D-氨基酸。

这些天然肽中的非蛋白质氨基酸可以使其免遭蛋白酶水解。

许多激素也是多肽，如催产素、加压素、舒缓激肽等。

二、肽的理化性质

小肽的理化性质与氨基酸类似。

许多小肽已经结晶。

晶体的熔点很高，说明是离子晶体，在水溶液中以偶极离子存在。

肽键的亚氨基不解离，所以肽的酸碱性取决于肽的末端氨基、羧基和侧链上的基团。

在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链上的。

肽中末端羧基的pK’比自由氨基酸的稍大，而末端氨基的pK’则稍小。

侧链基团变化不大。

肽的滴定曲线和氨基酸的很相似。

肽的等电点也可以根据它的pK’值确定。

一般小肽的旋光度等于各个氨基酸旋光度的总和，但较大的肽或蛋白质的旋光度不等于其组成氨基酸的旋光度的简单加和。

肽的化学性质和氨基酸一样，但有一些特殊的反应，如双缩脲反应。

一般含有两个或两个以上肽键的化合物都能与CuSO4碱性溶液发生双缩脲反应而生成紫红色或蓝紫色的复合物。

利用这个反应可以测定蛋白质的含量。

三、一级结构的测定

（一）一级结构

蛋白质的一级结构是指肽链的氨基酸组成及其排列顺序。

氨基酸序列是蛋白质分子结构的基础，它决定蛋白质的高级结构。

一级结构可用氨基酸的三字母符号或单字母符号表示，从N-末端向C-末端书写。

采用三字母符号时，氨基酸之间用连字符（－）隔开。

（二）测定步骤

测定蛋白质的一级结构，要求样品必须是均一的（纯度大于97％）而且是已知分子量的蛋白质。

一般的测定步骤是：

1.通过末端分析确定蛋白质分子由几条肽链构成。

2.将每条肽链分开，并分离提纯。

3.肽链的一部分样品进行完全水解，测定其氨基酸组成和比例。

4.肽链的另一部分样品进行N末端和C末端的鉴定。

5.拆开肽链内部的二硫键。

6.肽链用酶促或化学的部分水解方法降解成一套大小不等的肽段，并将各个肽段分离出来。

7.测定每个肽段的氨基酸顺序。

8.从第二步得到的肽链样品再用另一种部分水解方法水解成另一套肽段，其断裂点与第五步不同。

分离肽段并测序。

比较两套肽段的氨基酸顺序，根据其重叠部分拼凑出整个肽链的氨基酸顺序。

9.测定原来的多肽链中二硫键和酰胺基的位置。

（三）常用方法

1.末端分析

（1）N末端

蛋白质的末端氨基与2,4-二硝基氟苯（DNFB）在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白质（DNP-蛋白质）。

产物黄色，可经受酸性100℃高温。

水解时，肽链断开，但DNP基并不脱落。

DNP-氨基酸能溶于有机溶剂（如乙醚）中，这样可与其他氨基酸和ε-DNP赖氨酸分开。

再经双向滤纸层析或柱层析，可以鉴定黄色的DNP氨基酸。

丹磺酰氯法是更灵敏的方法。

蛋白质的末端氨基与5-（二甲胺基）萘-1-磺酰氯（DNS-Cl）反应，生成DNS-蛋白质。

DNS-氨基酸有强荧光，激发波长在360nm左右，比DNFB法灵敏100倍。

目前应用最广泛的是异硫氰酸苯酯（PITC）法。

末端氨基与PITC在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来。

产物可用气-液色谱法进行鉴定。

这个方法最大的优点是剩下的肽链仍是完整的，可依照此法重复测定新生的N末端氨基酸。

现在已经有全自动的氨基酸顺序分析仪，可测定含20个以上氨基酸的肽段的氨基酸顺序。

缺点是不如丹磺酰氯灵敏，可与之结合使用。

N末端氨基酸也可用酶学方法即氨肽酶法测定。

（2）C末端

a）C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的α氨基醇。

肽链水解后，再用层析法鉴定。

有断裂干扰。

b）另一个方法是肼解法。

多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。

肼解下来的C末端氨基酸可用纸层析鉴定。

精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。

c）也可用羧肽酶法鉴定。

将蛋白质在pH8.0,30℃与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C末端氨基酸的排列顺序。

羧肽酶A水解除精氨酸、赖氨酸和脯氨酸外所有肽键，羧肽酶B水解精氨酸和赖氨酸。

2.二硫键的拆开和肽链的分离

一般情况下，蛋白质分子中肽链的数目应等于N末端氨基酸残基的数目，可根据末端分析来确定一种蛋白质由几条肽链构成。

必须设法把这些肽链分离开来，然后测定每条肽链的氨基酸顺序。

如果这些肽链之间不是共价交联的，可用酸、碱、高浓度的盐或其他变性剂处理蛋白质，把肽链分开。

如果肽链之间以二硫键交联，或肽链中含有链内二硫键，则必须用氧化或还原的方法将二硫键拆开。

最普遍的方法是用过量的巯基乙醇处理，然后用碘乙酸保护生成的半胱氨酸的巯基，防止重新氧化。

二硫键拆开后形成的个别肽链，可用纸层析、离子交换柱层析、电泳等方法进行分离。

3.肽链的完全水解和氨基酸组成的测定。

在测定氨基酸顺序之前，需要知道多肽链的氨基酸组成和比例。

一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分离测定氨基酸。

目前用氨基酸自动分析仪，2－4小时即可完成。

蛋白质的氨基酸组成，一般用每分子蛋白质中所含的氨基酸分子数表示。

不同种类的蛋白质，其氨基酸组成相差很大。

4.肽链的部分水解和肽段的分离

当肽链的氨基酸组成及N末端和C末端已知后，随后的步骤是肽链的部分水解。

这是测序工作的关键步骤。

这一步通常用专一性很强的蛋白酶来完成。

最常用的是胰蛋白酶（trypsin），它专门水解赖氨酸和精氨酸的羧基形成的肽键，所以生成的肽段之一的C末端是赖氨酸或精氨酸。

用丫丙啶处理，可增加酶切位点（半胱氨酸）；用马来酸酐（顺丁烯二酸酐）保护赖氨酸的侧链氨基，或用1,2-环己二酮修饰精氨酸的胍基，可减少酶切位点。

经常使用的还有糜蛋白酶，水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水残基的羧基形成的肽键。

其他疏水残基反应较慢。

用溴化氰处理，可断裂甲硫氨酸的羧基形成的肽键。

水解后甲硫氨酸残基转变为C末端高丝氨酸残基。

以上三种方法经常使用。

胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。

前者水解疏水残基之间的肽键，后者水解疏水残基的氨基形成的肽键。

金葡菌蛋白酶，又称谷氨酸蛋白酶或V8蛋白酶，水解谷氨酸和天冬氨酸的羧基形成的肽键，但受缓冲液影响。

在醋酸缓冲液中只水解谷氨酸，在磷酸缓冲液中还可水解天冬氨酸。

梭状芽孢杆菌蛋白酶，水解精氨酸羧基形成的肽键，又称精氨酸蛋白酶。

耐变性剂，可经受6M尿素2小时。

可用于水解不易溶解的蛋白。

凝血酶，水解Arg-Gly肽键。

羟胺可水解Asn-Gly，但Asn-Leu和Asn-Ala也能部分裂解。

以上方法中，酶不能水解脯氨酸参与形成的肽键。

多肽部分水解后，降解成长短不一的小肽段，可用层析或电泳加以分离提纯。

经常用双向层析或电泳分离，再用茚三酮显色，所得的图谱称为肽指纹谱。

5.多肽链中氨基酸顺序的测定

从多肽链中部分水解得到的肽段可用化学法或酶法测序，然后比较用不同方法获得的两套肽段的氨基酸顺序，根据它们彼此重叠的部分，确定每个肽段的适当