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第四讲之十讲生物制药
第四章 细胞培养技术制药
第一节动物细胞制药
一、动物细胞制药的基本原理
·动物细胞制药首先涉及到的就是细胞体外培养的一些基本原理和基本操作,这些和普通的细胞体外培养技术基本一致
·表达过程中能以正确的方式进行折叠和修饰
·大多数能以天然形式分泌到培养基中,从而确保了生产的蛋白质具有天然产物抑制的活性、免疫原性和体内寿命
·一些人用和兽用的重要药物蛋白,尤其是相对较大、复杂或糖基化的蛋白质来讲,动物细胞培养制药是首选的生产方式,如病毒疫苗、干扰素等
1.用于蛋白药物生产的细胞系
CHO(中华仓鼠卵细胞),MRC-5人淋巴母细胞,重组NS0,BHK,鼠杂交瘤细胞,SP2/0,FRh1-2,BIRMA-1细胞系,LB-2细胞,ES-15&ES-4细胞系,MS20
2.细胞的凋亡
·在10升以上的发酵罐中培养密度超过每毫升百万个细胞—技术还不成熟
·为了获得最大的产量,人们把注意力一直放在生物反应器的设计和培养基的优化设计上
·最近,细胞凋亡在限制培养性能方面的影响才开始列入考虑范围
·一般地讲,经受程序死亡的细胞都接受到了一个死亡刺激信号
·信号转变成对细胞的程序性破坏
1)细胞凋亡引发的途径
·至少有两条途径引发细胞凋亡·受体介导途径—胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase
·线粒体介导途径—释放凋亡酶激活因子激活caspase
2)细胞凋亡的诱因
细胞培养中,除了程序性凋亡外,细胞凋亡还和培养的环境有关
外界因素
·营养成分的耗竭,会引起细胞的衰老和凋亡
·培养中产生的活性氧,可能导致细胞凋亡
·培养液中的渗透压提高与细胞凋亡的增加呈正相关,但是增加二氧化碳的分压,并不增加细胞的凋亡
·丁酸能够促进哺乳动物某些启动子(如CMV和SV40)控制的基因表达,但是它也能抑制细胞生长,诱导细胞凋亡
·剪切力是生物反应器环境中另一个导致细胞死亡的潜在原因,高强度的剪切力会导致坏死性细胞死亡,但较低强度剪切力的影响还不清楚
·由于代谢压力而引起的细胞内环境的改变也会诱导细胞调亡,如在低pH的环境下,半胱氨酸蛋白酶(caspases)的激活过程更快
·细胞间信号传递在源于培养的细胞凋亡中起重要作用,如细胞会释放自分泌因子,以响应密度、营养水品或受体介导的毒性代谢物的存在,一些能降低细胞间联系的生长因子抑制剂,如阿拉明可阻止细胞凋亡
3.外源基因在哺乳动物细胞中的表达
1)表达用载体:
启动子,增强子,选择标记,mRNA剪切位点和多聚核苷酸序列,多克隆位点和复制必需成分
2)DNA导入动物细胞常用的技术:
外源DNA导入到哺乳动物细胞的过程称转染,脂质体转染技术,电穿孔技术,基因枪,DEAE-葡聚糖方法,磷酸钙沉淀法
3)DNA在细胞内的表达
·瞬时表达是指外源DNA导入细胞内后,不经过选择培养,外源DNA在细胞增殖过程中逐渐丢失,目的蛋白的表达也是短暂的。
该培养方法简捷,周期短
·永久表达是指外源DNA导入细胞内后,经过选择培养,外源DNA稳定地存在于细胞中,目的蛋白的表达持久恒定
二、转基因动物细胞生产的药物
·干扰素β-1a,治疗回归热性硬结病人临床恶化,CHO细胞生产,2002年上市
·重组糖蛋白,Tenecteplase,可减低急性心肌梗塞死亡率,CHO,2000年上市
·重组糖蛋白,抗血友病因子,CHO,2000年上市
·内源糖蛋白,干扰素α-n1,治疗慢性丙肝,人淋巴母细胞,1999年上市
·重组血友病VIIa因子,治疗A型和B型血友病,BHK,1999年上市
·IgG1和TNF受体融合,治疗风湿性关节炎,CHO,1999年上市
·重组血凝因子IX,控制B型血友病病人的出血,CHO,1997年上市
第二节转基因动物制药
首个转基因动物生产药物-Atryn
·2009年2月6日首次批准了用转基因山羊奶研制而成的抗血栓药物Atryn上市
·山羊奶中产生抗凝血酶,用于治疗遗传性抗凝血酶缺乏症
·马萨诸塞州的GTC生物制药公司研发生产
一、产生重组蛋白的动物组织系统:
血液,尿液,精液,蛋清,蚕茧,乳汁
二、转基因动物操作的原理和方法
1.重组载体的构建:
·编码区·启动子·增强子·调控元件·筛选标记
2.转基因技术:
·直接核DNA显微注射·逆转录病毒载体感染胚胎·囊胚内注射遗传改变的胚胎干细胞
·精子作为基因转移的载体
3.胚胎分割和核移植技术
·胚胎分割就是在动物胚胎早期,每个细胞有全能性的时候,将各个细胞分离开,重新发育成胚胎,而且可以将胚胎能冻保藏,可以将有优良性能的胚胎保持下去
·核移植就是将胚胎的细胞核或体细胞的细胞核,移植到去核的受精卵或卵细胞中,以获得优良遗传性能的动物
第三节植物细胞制药
一、研究概况
·植物细胞培养现在已经是一门专门的学科
·1902年,Haberlandt细胞全息论的理论开始,植物大量培养技术生产植物精细化学产品是发展十分迅速的领域
·植物正成为外源基因重要的表达体系
·可进行翻译后加工和糖基化、不含潜在的人类病原、成本低
·目前应用最多的是药用植物细胞的大规模培养,解决原料和保护环境
·红豆杉,治疗乳腺癌和晚期卵巢癌效果较好
·5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[(2’R,3’S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯
·树皮中有万分之二左右的含量,每提取1公斤紫杉醇就要活剥10吨树皮
·每提取1公斤紫杉醇约需要5万公斤红豆杉干枝叶
·1995年野生红豆杉被列为国家一级保护植物·每克可以制成33克针剂,每支含紫杉醇大约30毫克
·每支进口制剂1500元/支(“泰素”),国产800元/支(“紫素”)
二、药用植物大规模培养
3个基本步骤:
·第一步是诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬浮细胞系·第二步是筛选高产细胞系·第三步是生物反应器中大量培养细胞或细胞团
植物快繁技术
三、植物转基因技术
·将外源基因导入植物细胞的过程叫做细胞的转化·农杆菌转化法·基因枪转化法·花粉管通道转化法
第五章 抗体工程制药
抗体药物的生产
传统的方法——抗血清
淋巴细胞的培养
如何获得需要的淋巴细胞?
如何体外培养淋巴细胞?
第一节抗体药物概念及其特点
一、抗体药物概念
通过细胞工程或基因工程生产的,用于诊断或治疗的单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、基因工程改造的抗体或免疫偶联物统称为抗体药物
免疫偶联物
·生物导弹·是免疫导向药物的形象称呼·由单克隆抗体与药物、酶、毒素或放射性同位素等配合而成
二、抗体药物特点
1.特异性1)与相关抗原的特异性结合2)对靶细胞的选择性
2.多样性1)抗原多样性2)结构多样性3)抗体活性的多样性4)免疫偶联物和融合蛋白的多样性
第二节杂交瘤技术与单克隆抗体
1975年,德国学者Kohler和英国学者Milstein合作研究将经绵羊红细胞免疫后的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,建立了能持续分泌抗棉样细胞抗体的杂交瘤细胞,从而创立了具有划时代意义的新技术,为此获得了1984年医学诺贝尔奖
一、抗体的种类
1.多克隆抗体
·多克隆抗体含有两层意思:
一是有含多个抗原位区的大分子刺激产生的、识别不同抗原位区的各种抗体;二是由体内不同淋巴细胞产生的、可针对同一抗原位区的多克隆抗体
2.单克隆抗体
·仅识别抗原分子上同一抗原位区的由同一克隆细胞产生的抗体为单克隆抗体
·抗原→免疫→传统抗血清(所有抗体混合)
脾脏淋巴結B細胞
二、杂交瘤及杂交瘤技术
·细胞杂交的含义包括同一细胞的自融合或是在诱导物的作用下不同细胞间的融合
·淋巴细胞通过融合剂的作用和肿瘤细胞形成融合的杂交细胞称杂交瘤细胞
·通过肿瘤细胞和淋巴细胞的融合,用于某些细胞特性的研究和生产所期望的免疫分子,称为杂交瘤技术
·目前杂交瘤技术在免疫学领域的应用有两种
·B淋巴细胞杂交瘤,即用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞进行融合而制备抗体,也是引用最广泛的一种
·T细胞杂交瘤技术,肿瘤细胞和T细胞融合而制备具有免疫活性的淋巴因子
·通常人们所述的杂交瘤技术即知B淋巴细胞杂交瘤,也可称为单克隆抗体技术
三、单克隆抗体
·单克隆抗体是由一个骨髓瘤细胞和一个具有分泌抗体能力的B淋巴细胞融合形成的杂交瘤细胞,通过无性繁殖形成的细胞系而获得的
·这个细胞系的每个细胞均具有相同的特性且高度均一,这一细胞系分泌的抗体均一性极高,活性、亚基、亲合力均相同
单克隆抗体的特点
·抗体结构高度均一。
抗体分子在结构上高度均一,甚至在氨基酸的序列和空间结构上都相同
·高度特异性。
抗体识别的是抗原分子上单一的抗原位区
·稳定的生产特性。
产生抗体的细胞是可以无性繁殖的细胞系
第三节杂交瘤细胞系的建立
一、免疫B淋巴细胞的制备
1.抗原
·凡是能具有抗原性质的物质均可制备单克隆抗体,抗原可以是全病毒、亚单位或纯化分子,也可以是蛋白质、多糖、脂类等
·用于制备单克隆抗体的抗原在理论上讲,纯度要求就可以不高,也可以使混合抗原
2.免疫
·动物的选择:
目前常用的骨髓瘤细胞系来自BALB/c小鼠和Lou大鼠
免疫方法:
A.体内免疫法B.脾内免疫法C.体外免疫法
二、骨髓瘤细胞的选择
·在B淋巴细胞杂交瘤技术中,主要是用多发性骨髓瘤细胞作为亲本细胞,这种细胞是来自骨髓造血细胞的一种肿瘤,分泌单一抗体的浆细胞,并且衰变成不表达自身抗体或部分表达
·常见的骨髓瘤亲本细胞系有Sp2/0,NS-1,Y3,YB2
三、免疫脾细胞的制备
经免疫的BABL/c小鼠或Lou大鼠,摘眼球、断颈等方法处死后,无菌摘取脾脏,研磨制取B淋巴细胞悬液,经氯化铵破碎红细胞后,洗涤并调整到(1~5)X107个/ml浓度备用
四、细胞融合
将免疫脾B淋巴细胞和骨髓瘤细胞按照(5~10):
1混合后离心取上清,缓慢加入分子量在4000~6000的50%PEG1ml,间隔1分钟后,缓慢加入无血清培养基,终止融合剂的作用,经洗涤去除融合剂后加入细胞培养液,分种于96孔板中
五、特异杂交瘤细胞的选择
1.杂交瘤细胞的选择
·融合后,有杂交瘤细胞有骨髓瘤-B淋巴细胞、B淋巴瘤细胞-B淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞,还有未融合的骨髓瘤细胞和B淋巴细胞
·一般用HAT培养液进行筛选
2.特异性抗体的筛选
·筛选出的杂交瘤细胞并不是都能分泌所期望的抗体,所以还要对杂交瘤细胞做的二次筛选,即对所分泌的抗体进行检测
·一般地,细胞培养的上清液中,抗体可以达到每毫升微克级的水平,目前检测方法的灵敏度都可以达到。
实验室常用的是酶联免疫的方法,即ELISA方法
以酵素免疫分析法检测样本中的专一性抗原
六、杂交瘤细胞的克隆和建株
1.杂交瘤细胞的克隆化2.杂交瘤细胞系建株
七、单克隆抗体的制备
1.动物体内诱生法2.体外培养法
单株抗体的生产纯化
八、单克隆抗体生产的一般流程
体外培养的骨髓瘤细胞免疫纯系小鼠,取脾脏细胞
↘↙
体外融合
HAT选择培养
抗体检测,阳性孔
克隆化培养,抗体检测
阳性克隆扩大培养→冻存细胞,建立细胞库
↙↘
体外法制备单克隆抗体体内法制备单克隆抗体腹水
↘↙
抗体检测
单克隆抗体产生的流程
第四节基因工程抗体
·鼠单抗对人而言有较强得免疫原性,可以产生较强的人抗鼠抗体(HAMA)反应
·生产成本比较高,难以大规模普及应用
基因工程抗体优点
·降低抗体的免疫原性。
通过基因工程改造技术,可以最大程度地降低抗体的鼠源性,降低甚至是消除人体对抗体的排斥反应
·穿透力强。
基因工程抗体分子一般比较小,更容易到达病灶的核心部位
·可以根据需要,制备多用途的新型抗体
·成本降低。
可采用原核细胞、低等真核细胞和植物等多种系统表达
一、人-鼠嵌合抗体
在基因水平上将鼠源单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来并在合适的宿主细胞中表达,这种抗体称为人-鼠嵌合抗体
鼠源↘
人鼠嵌合抗体
人源↗
二、鼠单抗可变区人源化抗体
1.改行(型)抗体
将鼠单抗的CDR区移植到人单抗的骨架区,就可能使人单抗获得同鼠一样的抗体特异性,并可以最大限度地降低鼠单抗的异源性,这样就得到了改行抗体。
这种改造过的抗体也称CDR移植抗体
鼠源↘
人改型抗体
人源↗
2.表面氨基酸残基的人源化――镶面抗体
将鼠单抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基中改成人源的,就成为了镶面抗体
3.表位印迹选择
表位印迹选择是一种与高效筛选噬菌体抗体库技术相结合的人源化抗体的方法,可以通过数轮筛选得到完全人源的抗体
三、小分子抗体
·小分子抗体是完整免疫球蛋白的一部分,分子量比较小。
1)Fab片段和重组Fab。
Fab片段包括重链Fd段(可变区和第一恒定区)和完整的轻链,如果恒定区片段是人源的,即称为重组Fab。
2)Fv和单链抗体(scFv),Fv是重链可变区和轻链可变区通过非共价键结合在一起,是抗体中完整活性的最小功能片段。
ScFv是在两个可变区间用连接肽连接起来成为一条链。
·双价分子、单域抗体、最小识别单位等。
第六章 疫苗
年龄接种疫苗名称
出生时乙肝疫苗、卡介疫苗
1足月乙肝疫苗
2足月脊灰疫苗
3足月脊灰疫苗、百白破疫苗
4足月脊灰疫苗、百白破疫苗
5足月百白破疫苗
6足月乙肝疫苗
6-18足月流脑疫苗
8足月麻疹疫苗、乙脑疫苗
1.5-2周岁百白破疫苗、麻腮风疫苗、乙脑疫苗
3周岁流脑疫苗
4周岁脊灰疫苗
6周岁白破疫苗、乙脑疫苗、流脑疫苗
第一节疫苗概论
一、疫苗的概念
·通过接种诱导机体产生针对特定致病原的特异性抗体或细胞免疫,从而使机体获得保护或消灭该致病原能力的生物制品统称为疫苗
·疫苗包括蛋白质、多糖、核酸、活载体、感染因子等
·以前疫苗的概念是指由于预防的生物制品,现在这一概念已经扩大,疫苗不仅仅用于预防,也可以用于治疗,如抗肿瘤疫苗和避孕疫苗等
·美国华盛顿州的西北生物治疗公司(OTC BB:
NWBO)于2007年7月9日对外宣布说,已收到瑞士公共健康研究所的使用授权,其DCVax–Brain可以在瑞士用于治疗脑癌·2008年6月,癌症治疗疫苗EGF疫苗在古巴获准上市
·该疫苗由古巴分子免疫学中心(CIM)研发,可用于治疗非小细胞肺癌
·临床研究证实,该药联合标准化疗方案,可将肺癌患者的生存期延长4~5个月甚至更久,并能改善患者的身体素质,增强抵抗力
·这是全球第一个获批准的能引导人体免疫协同对肿瘤发起攻击的抗癌疫苗
二、疫苗学的起源
人类的免疫知识最早起源于天花
·天花病毒引起的急性传染病·天花病毒繁殖速度快、传染性强、死亡率高·潜伏期7~17天(平均约12天)
·经验:
人不会得两次天花
·最早的记载为中国的公元前590年,当时将患者的脓包干燥或干的结痂制成粉,以管子吹入健康人的鼻子或附于棉花上塞入鼻孔
·在宋真宗时期(998~1023年),已经有了关于人痘法预防天花的记载
·明朝隆庆年间(1567~1572)趋于完善,据明朝医学书籍记载,人痘法有痘衣法、痘浆法、旱痘法和水痘法等多种
·1721年,人痘法传入英国·英国的医生E.Jenner注意到感染过牛痘的人不会再感染天花
·1796年Jenner从一挤奶女工感染的痘疱中,取出疱浆,接种于8岁的儿童JamesPhilips的臂上,然后让其感染天花脓疱液,结果该男孩并未感染上天花·1798年,医学界正式承认“免疫接种确实是一种有效的免疫方法”
·世界卫生组织(WHO)于1979年10月26日正式宣布全世界消灭天花·最后一例天花病人于1976年在索马里被治愈,其后未再发现
·1870年,法国科学家L.Pasteur发现,将鸡霍乱弧菌连续培养几代,可以将细菌的毒力降到很低
·给鸡接种这种减毒细菌后,可使鸡获得对霍乱的免疫力,从而发明了第一个细菌减毒活疫苗——鸡霍乱疫苗
Pasteur将此归纳为对动物接种什么细菌就可以使其不受该病毒感染的免疫接种原理,从而奠定了疫苗的理论基础
·疫苗之父巴斯德(1822-1895年,法国微生物学家,化学家。
发明加热灭菌法,建立免疫学)
三、疫苗的分类
·按照所用的材料一般分为细菌性疫苗、病毒性疫苗和类毒素三类
·从疫苗的研制技术可将疫苗分为传统疫苗和新型疫苗两大类
·传统疫苗包括灭活疫苗、减毒活疫苗和用天然微生物的某些成分制成的亚单位疫苗
·新型疫苗主要指基因工程技术研制的疫苗,包括基因工程亚单位疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗、多价或联合疫苗等
四、疫苗的基本成分
1.抗原
·抗原是最主要的有效活性成分,它决定了疫苗的特异免疫原性,它应该具有异物性、特异性、一定的理化性质等特定
·可以做为抗原的生物活性物质有:
灭活的细菌或病毒、活病毒或细菌通过实验室多次传代得到的减毒株、病毒或细菌提纯物、有效蛋白成分、类毒素、细菌多糖、合成肽、疫苗用核酸等
2.佐剂
·佐剂能增强抗原的免疫性应答,理想的佐剂除了应有确切的增加免疫应答作用外,应该是无毒、安全的,并且在非冷藏条件保持稳定。
目前常用的佐剂是铝佐剂
3.防腐剂
·防腐剂主要是防止外来微生物的污染,一般液体疫苗为避免在保存期间微量的细菌繁殖,菌加入适量的防腐剂。
大多数的灭活疫苗都使用防腐剂,如硫柳汞、2-苯氧乙醇、氯仿等
4.稳定剂
·为保证作为抗原的病毒或其他微生物生存并保持免疫原性,疫苗中常加入适宜的稳定剂或保护剂,如冻干疫苗中常用的乳糖、明胶、山梨醇等
5.灭活剂
·灭活细菌或病毒抗原除了可用物理方法如加热、紫外照射等之外,还可以用化学方法灭活,常用的化学灭火剂有丙酮、酚、甲醛等,这些物质对人体又有一定的毒害作用,因此在灭活抗原后必须及时从疫苗中除去,并经严格的检定以保证疫苗的安全性
6.其他成分
·疫苗在制备时还需使用缓冲液、盐类等非活性成分,缓冲液的种类、盐类的含量都可以影响疫苗的效力、纯度和安全性,因此有严格的质量标准
五、疫苗的基本性质和特征
1.免疫原性
·疫苗接种进入人体后引起抗体产生免疫应答的强度和持续时间
·影响免疫原性的强弱包括机体的因素和疫苗的因素,从疫苗的角度看,是由疫苗的抗原决定的
2.安全性
·大多数疫苗用于儿童和健康的人群,因此其安全性要求极高。
疫苗的安全性包括:
接种后的局部和全身反应;接种引起的免疫应答的安全程度;人群接种后引起的疫苗株散播情况等
3.稳定性
·疫苗必须保持稳定,以保证经过一定时间的疫苗储存和冷却运输过程后,疫苗仍能保持其有效的生物活性
第二节经典疫苗和新型疫苗简介
一、经典疫苗
1.灭活疫苗
·灭活疫苗中含有的病毒颗粒或菌体及寄生虫经过灭活剂处理后,其感染性已被灭活剂所灭活,而其抗原仍然保留
·灭活的疫苗一般只能刺激机体产生抗体IgM和IgG,表现一定程度的保护力·目前广泛使用的灭活疫苗有乙型脑炎疫苗、流感疫苗、狂犬疫苗
灭活疫苗优点:
制造工艺简单,免疫原性的稳定性高,易于制备多价疫苗
灭活疫苗缺点
·强毒株常被选择作为制造疫苗的病毒株,在制造过程中需要严格的灭活操作
·灭活疫苗所提供的免疫力较短暂,为完成全程免疫,需要进行多次接种
·有些灭活疫苗,接种免疫后,受接种者在接触自然抗原时,会引起严重的过敏反应
·灭活疫苗不能诱导产生局部免疫抗体IgA,野生型病毒仍然能够侵入某些器官或组织
2.纯化组份疫苗(亚单位疫苗)
·纯化组份疫苗优点:
可以减少或降低机体的反应
·纯化组份疫苗缺点:
分子量小,抗原性弱,需要加入佐剂,以增强免疫效果
3.减毒活疫苗
·制备减毒活疫苗的首要工作就是选择合适的减毒疫苗菌、毒株
·减毒活疫苗优点:
可使机体产生亚临床感染;可以以自然途径,如口服或喷鼻免疫产生广谱的免疫应答,即可以产生IgA
二、新型疫苗
1.基因工程疫苗、重组疫苗、多肽疫苗
·基因工程疫苗包括通过基因工程生产的重组疫苗亚单位(重组多肽疫苗)
·重组疫苗亚单位就是将抗原或抗原表位的基因重组到表达载体上,在表达系统中表达
·这种方法可以生产难以培养病原体的抗原,如乙、丙肝炎病毒,人免疫缺陷病毒等
·这种方法生产的重组多肽和天然的抗原在空间结构上如果不一致,就会改变免疫原性,而且需要免疫佐剂
·重组疫苗是指通过遗传重组的活疫苗
·利用非致病微生物作载体,将病原体的抗原基因和某些调控基因重组到这些载体中,或者通过分子手段改造微生物,获得重组活疫苗
·载体疫苗的突出优点是有减毒活疫苗的特点,可以模拟天然感染途径,而且可操作性强
·但是也有潜在的问题,如病毒在繁殖过程中出现自身修复,发生“毒力回复”,即毒力返祖现象,大量的病毒也会对环境造成污染
·多肽疫苗·化学方法人工合成抗原或者抗原表位,其性质和重组抗原多肽相同
2.核酸疫苗
·核酸疫苗又称基因免疫,或核酸免疫·目前研究最多的是DNA疫苗
·一般泛指的核酸疫苗就是DNA疫苗·由于DNA疫苗不需要任何化学载体,故又称为裸DNA疫苗
·核酸疫苗是利用真核表达质粒,直接在机体内表达抗原,以到达免疫的目的
核酸疫苗的优点:
·进入宿主细胞后,直接表达抗原,一般不需加佐剂·可根据需要设计、选择抗原基因,靶向性明确
·可构建多价疫苗
核酸疫苗的优点
·以重组质粒形式存在,其理化性质稳定,制备、纯化、运输、储存等费用低
·生物体内表达抗原,具有天然构象和免疫原性·不存在毒力回升,安全性较高
3.多价或联合疫苗
·联合疫苗是指能够预防多种疾病的联合制品,或能够预防统一病原体的不同株,或不同血清型引起的同一疾病的多价疫苗
·免疫学上认为,两种以上的抗原混合后在一定的条件下,有时可以相互起到加强作用,即产生所谓的“佐剂”作用,但是有时候会产生免疫抑制现象
第四节疫苗的制备
一、减毒活疫苗
·活疫苗在临床上可以为宿主提供长期的保护效果,通常是以模拟微生物自然感染状态来刺激免疫应答
·活疫苗是减毒形式存在的病原体,减毒一般是以生物学或其他技术减低或消除病原体的致病性,并保存了有效的感染性和免疫原性
·在减毒疫苗的设计中应该充分考虑到减毒不够或毒力返祖的现象
减毒方法:
·体外减毒
·卡介苗,是对牛型结核杆菌通过体外连续传代230次以上,历时13年获得的无致病性分枝杆菌制备的。
牛分支杆菌F(Mycobacteriumbovis)→置于含胆汁的培养基,逐渐增加胆汁的浓度→(13年)→卡介苗BacillusCalmette-Guerin(BCG)
在胆汁中适应性生长,充分减毒成为预防肺结核的疫苗。
减毒方法:
·温度敏感突变株病毒·化学诱变
二、灭活疫苗和亚单位疫苗
1.灭活全菌体
·培养细菌后,用热处理或化学试剂灭活菌体制备而成,最终产品不需要进一步纯化
·菌苗含有所有菌体的细胞成分,以非肠道方式接种非常有效
2.灭活病毒
·出芽方式释放的病毒,可以通过简单的方法从无细胞培养基中分离纯化病毒颗粒
·分裂细胞而获得的病毒,则需要分离纯化
·病毒颗粒的灭活常采用化学方法,如福尔马林处理,并用铝盐作为佐剂免疫
3.蛋白疫苗
·以免疫学、生物化学、遗传学技术为表证的表位选择候选疫苗·免疫用的蛋白可以来自天然蛋白,也可
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