时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程.docx

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时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程

时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程

一、产前筛查定义及其原理

产前筛查（PrenatalScreening）是指通过经济、简便和较少创伤的检测方法，从孕妇群体中发现怀有某些先天缺陷胎儿的高危孕妇，以便进而进行诊断，以最大限度地减少异常儿的出生。

血清学标志物产前筛查已成为非侵入性产前诊断的重要方法。

目前产前筛查的两种主要疾病是唐氏综合征（Down’sSydrome，DS；又称21三体综合征）和胎儿神经管缺陷（NeuralTubeDefects，NTDs），也包括一部分18三体综合征。

产前筛查可以在妊娠早期（7～13周）或中期（14～21周）进行。

目前用于产前筛查的血清学标志物有：

甲胎蛋白（AFP）、游离β-绒毛膜促性腺激素（F-β-hCG）、游离雌三醇（uE3）、妊娠相关血浆蛋白（PAPP-A）、抑制素A（inhibinA）等。

产前筛查实验测量通用评价指标为中位值倍数（MOM），正常妊娠特定的MOM=标本检测浓度/相应孕周中位值浓度。

产前筛查系统由体外诊断试剂、检测仪器和筛查分析软件组成。

检测仪器配合体外诊断试剂检测出孕妇血清中标记物（AFP、F-β-hCG、PAPP-A等）的浓度，将检测数据及孕妇相关因素输入筛查分析软件中，即可得出唐氏综合征（DS）和神经管缺陷（NTD）筛查的结果。

由于目前的技术水平的限制，产前筛查技术都不能做到筛查100%正确。

假阴性病例因此会误诊，假阳性病例一般在产前诊断实验时被纠正。

二、唐氏综合征的产前筛查

唐氏综合征是人类最常见的一种染色体病，发病率约1/800～1/600，男性多于女性。

1866年英国医生LangdomDown首次对此病进行临床描述，因此命名称为Down，sSyndrome，简称DS。

1959年Lejeune首先发现本病的病因是多了一条21号染色体，故又将其命名为21三体综合征。

唐氏综合征的主要临床表现：

严重智力低下、愚型面容，约50%伴有先天性心脏病、小头畸形等发育异常。

目前对DS尚未有治疗方法，因此通过产前筛查找出高危孕妇，对其进行产前诊断是防止患儿出生的重要手段。

1.以孕妇年龄作为筛查指标

最早用于DS的筛查指标为孕妇年龄。

早期研究发现，DS的发病率随孕妇年龄增高而增高，1977年Hook和Chambers报道了孕妇年龄在20～30岁之间，发病率呈线性增加，而在33岁左右呈对数增加，孕妇年龄为35岁时，发病率约1/384，40岁时约1/110，比30岁时增加了8倍，如图1。

一般认为35岁以上的孕妇是DS的高危人群，是要进行羊膜腔穿刺的指征。

但深入研究统计发现，若仅以孕妇年龄≥35岁作为筛查指标，DS的检出率约20%，而约80%的胎儿DS是在年龄小于35岁的孕妇人群中。

因此，不少国家的筛查机构指出“DS产前筛查应面向所有孕妇而不考虑年龄”。

仅用孕妇年龄指标不够全面，应结合应用孕妇血清标志物指标或超声波形态学联合筛查诊断。

图1孕妇年龄与胎儿发生唐氏综合征风险的关系

2.以孕妇血清标志物为筛查指标

1984年英国Merkatz等最先发现怀有DS胎儿的孕妇血清AFP含量降低，这在产前筛查史上是一个划时代的进步，建议将AFP作为35岁以下孕妇胎儿DS的筛查指标。

这一发现很快被其它实验室证实，1987年Bargot发现怀有DS胎儿的孕妇血清中的hCG的水平是正常孕妇的2倍，以孕妇年龄再结合血清中hCG检测，DS的筛查率可达到63%。

1988年，Canick等发现怀有DS胎儿的孕妇血清中uE3的水平比正常孕妇低25%。

同年，伦敦Bartholomews医院Wald提出AFP、ß-hCG、uE3三联的筛查方法。

1994年美国妇产科学院向全美医学界正式推荐这一组合，并得到广泛应用，一直至今。

在上世纪90年代，有学者还相继发现PAPP-A、inhibinA、糖原抗原125（CA-125）等与孕妇怀DS胎儿有关。

也将逐步应用到DS的产前筛查中。

甲胎蛋白（AFP）是胎儿血清中最常见的蛋白质，1956年由Bergstrandh和Czar在人胎儿血清中发现的一种甲种球蛋白。

早孕期由卵黄囊产生，晚孕期由胎儿肝脏大量产生。

胎儿血中的AFP经排尿进入羊水并通过胎盘屏障渗入母血。

孕10周即可在母血中测出AFP，孕11～20周AFP浓度呈线性升高，32～34周（有文献为28～32周）达到高峰，以后逐渐下降，分娩后几天降为0。

且孕早期以AFP单项筛查胎儿染色体异常无意义，因此母血中AFP的检测在孕中期14～20周进行。

正常孕妇血中AFP含量变化见图2与表1。

当孕妇胎儿患DS时，由于胎儿生长发育迟缓，组织器官发育不全，肝脏、胎盘的功能不良，合成AFP能力降低，致使孕中期母血清AFP水平下降（一般<0.5MOM，有的以<0.4MOM或<0.7MOM为标准）。

但当胎儿出现开放性神经管缺损或腹壁缺损时，破坏了阻止AFP外溢的胎儿屏障，使胎儿体内高浓度的AFP释放，渗透入母体循环，引起母体血清中的AFP显著升高。

因此，AFP也可作为神经管畸形的筛查指标。

参考：

马云宝，顾军，何雪云.医学特种检测的临床应用，第1版.北京：

原子能出版社，1-2.

图2正常妊娠母血中AFP含量变化趋势

表1正常妊娠母血清AFP含量参考值（ug/L）

孕周

中位数

0.4MoM

0.7MoM

2.0MoM

2.5MoM

14-15

41.26

16.50

28.88

82.50

103.15

16-17

54.15

21.66

37.91

108.30

135.38

18-19

69.27

27.71

48.49

138.54

173.18

20-21

91.58

36.63

64.11

183.16

228.95

22-23

127.62

51.05

89.33

255.24

319.05

24-25

155.11

62.04

108.53

310.22

387.78

26-27

190.39

76.16

133.27

380.78

475.98

28-29

252.80

101.13

176.96

505.60

632.00

30-31

250.72

100.29

175.50

501.44

626.80

32-33

321.07

128.43

224.75

642.14

802.68

34-35

203.16

81.26

142.21

406.31

507.89

36-37

184.92

73.97

129.44

369.84

462.30

38-39

226.68

90.67

158.67

453.35

566.69

40-42

140.41

56.16

98.29

280.82

351.03

摘自：

方群.妇产科检验诊断学，第1版.北京：

人民卫生出版社，62.

绒毛膜促性腺激素（hCG）是胎盘的合体滋养层分泌的一种糖蛋白，为胎盘中最重要的激素，由α和β亚基组成，两个亚基可彼此结合，也可游离于血液中。

孕妇血清中的hCG主要以完整的形式存在，游离形式的β-hCG（F-β-hCG）占总hCG的1～8%。

妊娠期母血清中β-hCG水平呈双峰曲线，第1峰于妊娠12周前后（一般8～10周或9～12周），15周后出现生理性下降，20～32周维持低而平稳水平，26周达最低。

第2峰于妊娠37周，明显低于第1峰，至妊娠足月时稍有下降。

在妊娠11周内，血清β-hCG的含量与孕龄密切相关，随妊娠进展呈直线上升，孕龄每增加1天，β-hCG平均增加1.53IU/ml（hCG约每1.3天上升2倍，如未达到此水平，此次妊娠可能是输卵管妊娠—宫外孕，应动态观察），分娩后急剧下降，产后4天降至1IU/ml，产后9天基本消失。

正常妊娠母血清hCG含量见表2与表3。

胎儿患DS时，胎盘重量低于正常水平，组织器官发育不全，肝脏、胎盘的功能不良，因此孕妇血清中hCG浓度下降要比怀正常胎儿的孕妇晚3周左右，致使孕中期（约20周左右）母血清中的hCG浓度呈高水平状态，怀DS儿孕妇血清中游离的β-hCG浓度比正常孕妇至少高2倍（一般>2.5MOM），如图3。

表2正常妊娠母血清hCG含量参考值（U/L）

妊娠期（周）

受精后距末次月经U/L

245~100

35200~3000

4610000~80000

5~127~1490000~500000

13~2415~265000~80000

26~3827~403000~15000

摘自：

周新，涂植光.临床生物化学和生物化学检验，第3版.北京：

人民卫生出版社，435.

表3正常妊娠母血清β-hCG含量参考值（mIU/ml）

孕周1

β-hCG

孕周2

β-hCG

孕周2

β-hCG

1

5~55

13

77335.7±3304.9

20

18568.7±3718.2

2

42~100

14

56146±24314.9

21

18046.1±6691.5

3

106~500

15

48704.5±33045.5

22

20174.2±15022.3

4

63~1000

16

38275.4±21572.4

23

22282.3±5493.3

5~

150~10000

17

29620.6±11921.4

24

16393.1±4735.3

7~

1000~15000

18

28100.5±11952.8

25

19403.9±7825.3

9~12

1200~20000

19

29392.4±13482.8

26

17455±9505.5

摘自：

1.韦振元等.血清β-hCG、HPL和β-hCG/HPL比值对妇产科疾病的临床意义.标记免疫分析与临床，1999，6

（1）：

9-12.

2.王晓雯等.孕中期各周β-hCG正常值测定及其临床意义.中国优生与遗传杂志，2000，8

（2）：

62.

图3ß-hCG在正常孕妇和怀有唐氏胎儿孕妇血清中的分布

游离雌三醇（uE3）是雌二醇（E2）和雌酮（E1）的代谢产物，在非妊娠女性中浓度很低，而在妊娠后期浓度则明显增加。

只有约9%的E3在血液循环中游离为uE3。

在妊娠后期E3由胎儿肾上腺、胎肝和胎盘大量合成，反映了胎儿和胎盘双方面的功能。

母体血清E3约90%来自此合成途径，少量由母体卵巢前体生成。

E3生物合成途径的中断将导致母体血清E3低水平。

造成E3途径中断的情况：

胎儿宫内发育迟缓、无脑畸形、胎盘硫酸酯酶缺乏、死胎、染色体异常等，缺乏E3的孕妇分娩期将推迟。

在胎儿正常发育的情况下，其母体内uE3含量自29～34周逐渐上升，35～36周开始快速上升，在41～42周（37～38周或40～41周）达高峰，正常妊娠孕妇uE3参考值见表4与图4。

uE3被用于胎儿DS筛查主要在孕中期，应注意正常妊娠孕妇uE3是孕中期变化最大的指标，必须核对孕周。

在孕妇怀DS胎儿时，母体血清中uE3表现为降低异常（一般<0.7MOM）。

目前uE3已是多标记联合筛查中用得相当普遍的标记物之一。

表4正常妊娠孕妇血清uE3参考值（

±s,μg/L）

孕周

例数

FE3

孕周

例数

FE3

17

6

2.2±0.6

30

20

11.2±2.7

18

44

3.7±1.1

31

23

12.3±2.7

19

34

4.8±1.4

32

26

14.6±3.5

20

30

5.6±1.5

33

16

21

39

6.6±1.8

34

11

22

39

6.6±1.8

35

9

23

41

8.0±2.1

36

9

15.2±3.9

24

33

8.3±2.2

37

12

15.0±4.2

25

26

8.8±2.0

38

11

17.0±3.7

26

41

8.8±2.6

39

13

24.7±7.1

27

29

8.8±2.5

40

19

25.9±8.6

28

25

8.9±2.4

41

10

36.9±7.0

29

27

9.6±2.4

引自：

徐增秀,徐燕红,彭晓燕,等.正常孕妇血清游离雌三醇动态监测的临床价值.标记免疫分析与临床,2000,7

（2）:

74-75.

图4正常妊娠孕妇血清uE3含量变化趋势

妊娠相关血浆蛋白（PAPP-A）是一种大分子糖蛋白，PAPP-A由胎盘合体滋养层和蜕膜产生，属于α2巨球蛋白，具有激活补体，起免疫抑制的作用（其生物功能目前尚未完全清楚）。

早在1974年Lin等首次报道了孕早期母血中PAPP-A的研究，指出PAPP-A起源于绒毛周围纤维蛋白，其水平随孕周增加而增加。

后来诸多学者分别在孕早期应用PAPP-A结合F-β-hCG（或hCG）作为DS筛查指标，证实PAPP-A是一种最有意义的标志物。

Wald等及Haddow等在综合归纳了9个国家21个产前筛查诊断中心的研究结果的基础上，用孕妇7种血清标志物以不同组合作筛查指标进行比较，结果显示，PAPP-A诊断DS效果较满意，特别是结合F-β-hCG组合时阳性检出率可达60%，其中假阳性率仅为5%。

Zimmermann等检测了1151例21三体和18三体患者的PAPP-A水平，中位数的倍数分别是0.51和0.08，结果显示PAPP-A可作为妊娠DS胎儿产前筛查一个独立的标志物。

孕早期就可以在母体血清中检测到PAPP-A（单胎受精后32天，双胎受精后21天即可在孕妇血清中检测到），随着妊娠进展，母体PAPP-A水平升高，到妊娠足月时达到高峰，此时母血PAPP-A浓度是羊水的10倍，产后6周即测不到。

而整个妊娠期间，胎血中测不道PAPP-A，这是因为PAPP-A分子量大，不能透过胎盘进入血循环。

PAPP-A具有以下优点：

在孕早期阶段，母血中即可测到。

当其他妊娠蛋白水平开始下降时，母血PAPP-A水平仍在升高，它是唯一的一种在母血中浓度最高，羊水中次之，胎血中不含有的妊娠蛋白。

由于DS胎儿的器官包括胎盘均发育不全，胎盘合体滋养层功能下降，合成PAPP-A减少，因此怀有DS胎儿的孕妇，其血清中PAPP-A一般低于0.25MOM～0.51MOM。

在孕早期低水平的PAPP-A是筛查染色体异常胎儿的很好指标，尤其是DS胎儿，阳性检出率可达66％。

此外，有自然流产、异位妊娠、胎儿生长迟缓、胎死宫内时，孕妇血清PAPP-A亦呈低值，这与胎盘功能不全，使其合成减少有关。

正常妊娠孕妇血清PAPP-A参考值见表5与图5。

该指标在孕早期较为敏感，检测PAPP-A前最好以B超检查确定孕龄，孕14周后21三体妊娠与正常妊娠无明显差别，PAPP-A的最佳筛查时间为妊娠10～14周，<0.5MOM应作产前诊断。

PAPP-A<0.5MOM也可见于胸腹腔积液、双肾积水、腹水、羊水过多、死胎等；PAPP-A>2.5MOM可见于唇裂、尿道下裂等。

表5正常妊娠孕妇血清PAPP-A参考值（mIU/ml）

孕周

平均数

中位数

0.5倍中位数

2.5倍中位数

4

0.008

0.012

0.006

0.030

5

0.074

0.034

0.017

0.085

8

0.784

0.321

0.160

0.805

11

4.946

3.269

1.634

8.173

14

11.374

10.880

5.440

27.200

17

16.253

15.783

7.892

39.458

20

22.392

21.920

10.960

54.800

23

26.076

25.820

12.910

64.550

26

24.674

26.635

13.318

66.588

29

30.361

27.210

13.605

68.025

32

28.888

29.540

14.770

73.850

35

35.108

31.310

15.655

78.275

38

34.233

37.360

18.680

93.400

41

31.765

34.460

17.230

86.150

引自：

章晓梅，李春华，冯怀英，等.孕妇血清PAPP-A蛋白测定早期筛查染色体病.中国优生与遗传杂志，2001，9

（2）：

24-38.

注：

4-41周孕妇血清PAPP-A浓度曲线，系列1为浓度平均数，系列2为中位数，系列3为0.5倍中位数，系列4为2.5倍中位数。

图5正常妊娠孕妇血清PAPP-A含量变化趋势

抑制素A（inhibinA）被认为是一个由合胞体滋养层产生的化学物质，1992年有学者开始研究其与DS胎儿的相关性，研究发现孕妇血清中与DS胎儿相关的主要物质是二聚体抑制素A。

Aitken等研究发现，在妊娠7～8周检测二聚体抑制素A，怀DS胎儿的孕妇血清中二聚体抑制素A浓度较正常孕妇的高出2倍。

进一步结合AFP、hCG能大大提高DS的检出率，在一些多标记联合筛查中发现其作用不可忽视，甚至超过uE3的趋势。

糖原抗原125（CA-125）为一种大分子量糖蛋白，其生理功能目前尚有争议。

1990年Cherk等报道孕早期孕妇血清中糖原抗原125水平高于正常值，可能与胎儿自发流产和DS有关。

1997年Wenstrom等用研究数据统计表明，这一标记在筛查DS胎儿时，其阳性率可达45%，并认为这一标记可用于多标记联合筛查。

三、胎儿神经管缺陷的产前筛查

胎儿神经管缺陷（NeuralTubeDefects，NTDs）是出生缺陷最常见疾病类型之一，其发病是由于受精后20～24天内神经盘折叠过程中神经管不能闭合导致的。

多数的神经管缺陷是开放性的，神经组织完全暴露或仅仅盖有一层薄薄的透明膜；只有极少部分损伤是闭合性的，神经组织由皮肤或一层很厚的膜完全覆盖。

无脑畸形、脊柱裂、脑膨出是神经管缺陷三种主要类型。

1977年首次报道血清中AFP水平升高和开放性神经管缺陷畸形有关，因为开放性损伤时胎儿体内高浓度的AFP有可能通过胎儿血液循环到达羊水，再通过羊膜渗入母体循环，引起母体血清中的AFP显著升高。

因此通过检测孕妇血清中AFP浓度可以进行神经管缺陷的产前筛查，可以检出80～90%的开放性神经管缺陷。

在英国，由于开展了神经管缺陷胎儿血清筛查，其神经管缺陷胎儿的出生率从1960年的1/350降至1987年的1/2500,下降了86％。

结果说明AFP是一个很有效的神经管缺陷筛查指标（一般>2.5MOM，它在筛查胎儿神经管缺陷中的作用是其它标志物无法替代的）。

四、18-三体综合征的产前筛查

18三体综合征可以用孕妇血清联合筛查，怀有18三体综合征胎儿的孕妇孕中期血清hCG、AFP和uE3水平降低，以AFP≤0.75MOM；hCG≤0.55MOM；uE3≤0.60MOM为切割值，18三体综合征胎儿阳性检出率可达出60～80%。

五、产前筛查血清标志物的联合应用

产前筛查各种不同血清标志物筛查特性见表6。

表6各种不同血清标志物筛查特性

血清标志物

来源

适用孕周

阳性表现

阳性检出率

筛查胎儿缺陷

使用评价

AFP

胎肝

15~21

21三体↓，

NTDs↑

30%

各种三体综合征，NTDs

作用肯定，

普遍应用

β-hCG

胎盘

8~21

21三体↑

51%

各种三体综合征

作用肯定，

普遍应用

uE3

胎儿肾上腺，

肝脏，胎盘

14~21

21三体↓

30%

各种三体综合征

作用有争议，

应用较普遍

PAPP-A

胎盘合体滋养层

8~14

21三体↓

54%

各种三体综合征

作用肯定，

普遍应用

INHA

胎盘合体滋养层，

黄体

14~21

21三体↓

41%

各种三体综合征

作用有争议，

应用渐增多

21三体综合征：

妊娠中期母血AFP下降，uE3下降，F-β-hCG上升（三联筛查方法）。

PAPP-A和F-β-hCG在妊娠10周左右有较大价值，PAPP-A下降，F-β-hCG上升，检出率达63%，这个组合已成为孕早期筛查最佳组合。

有学者认为四联筛查方法（AFP，uE3，F-β-hCG，INHA）的检出率优于三联筛查方法。

神经管缺陷：

孕早期母血AFP和F-β-hCG正常，PAPP-A下降；孕中、晚期PAPP-A明显下降，AFP上升。

18三体综合征（Edward综合征）：

PAPP-A和F-β-hCG具有孕早期筛查18三体综合征的价值，母血F-β-hCG和PAPP-A下降；孕中期，18三体综合征母血AFP下降，uE3下降，F-β-hCG下降。

13三体综合征（Patau综合征）：

血清标志物变化与是否合并神经管缺陷有关。

Turner综合征：

妊娠中期uE3下降，AFP改变不明显或增高。

如有胎儿非免疫性水肿hCG上升，否则hCG下降。

染色体三倍体：

当为69条染色体时，血清标志物变化各不相同，一般认为AFP上升，uE3下降，F-β-hCG或高或低。

死胎：

孕早期和孕中、晚期死胎，母血F-β-hCG和PAPP-A均明显下降（胎盘功能破坏），而AFP升高（胎肝合成的AFP溢漏）。

多胎：

AFP、uE3、F-β-hCG均升高。

六、产前血清标志物筛查的影响因素

影响血清标志物的因素较多，易造成假阳性或假阴性，需采取措施予以纠正。

1．孕周估计误差：

妊娠周龄对筛查结果计算十分重要，计算方法有两种：

由末次月经（LMP）日期来推算，这种方法对月经周期规律者较好，但对月经周期不规则者不适用。

超声波测量胎儿的双顶骨间径（BPD）是较正确的方法。

当两种方法计算怀孕天数误差超过10天时，则以BPD为准；不足十天的两法均可。

2.多胎的影响：

双胎或多胎妊娠时，血清生化指标明显高于单胎妊娠。

双胎的DS检出率要低于单胎。

3.孕妇体重：

孕妇体重过重由于稀释作用可使AFP、uE3、hCG水平降低。

4.母亲自身疾病：

孕妇患有一些其他疾病时，可影响生化指标。

如孕妇为胰岛素依赖性糖尿病时，母血清AFP比正常同孕周孕妇低20%，而uE3和hCG水平升高。

5.母亲吸烟：

孕妇吸烟使AFP升高3%，hCG降低3%，uE3降低23%。

6.种族差异：

不同种族的人群正常值不同，AFP在亚洲及黑人的水平较西班牙人和白种人高，hCG在非裔美国人中较高。

因此，不同种族人群应建立自己的正常值

7.IVF与自然妊娠相比，hCG明显升高而AFP明显降低。

七、产前筛查流程

产前筛查流程：

（遗传咨询），收集资料，采集血样，检测，风险评估，报告结果，病例追踪，遗传咨询，存档。

如图6、图7与图8。

图6产前筛查流程图

图7唐氏综合征（DS）产前筛查流程图

图8神经管缺陷（NTD）产前筛查流程图

八、产前筛查时间分辨荧光免疫分析法实验操作常规

1.时间分辨荧光免疫分析法试剂盒检测原理：

目前已应用的有标记抗原与未标记抗原（待测或标准品）竞争结合抗体的竞争法、固相抗原与游离抗原（待测或标准品）竞争结合标记抗体的竞争法和固相双位点夹心法等。

应用较多的为固相双位点夹心法，如夹心一步法和夹心两步法。

方法简便，可以得到满意的灵敏度和特异性，批间批内变异系数小，精密度高。

TR-FIA夹心两步法的检测示意图如图9。

图9TR-FIA夹心两步法的检测示意图

2.时间分辨荧光免疫分析法实验室检测流程：

如图10。