土壤分析.docx
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土壤分析
土壤微生物的分析测定
土壤微生物(soilmicroorganism)是指生活在土壤中借用光学显微镜才能看到的微生物。
土壤微生物是土壤的重要重要组成部分,特别是在土壤质量的演变过程中,土壤微生物具有相对较高的营养转化能力,土壤中占多数的分别是细菌、放线菌、真菌。
由于在不同地带、不同土壤类型、不同季节和不同的土壤条件及农业措施等影响下,微生物的数量组成是不同的。
为此对某一地区的土壤进行采样并分离菌株,对提纯所得的菌株作生理生化分析,对了解某一区域的土壤微生物性质意义深远。
1.土样的采集及处理
1.1采样工具
GPS导航仪、取土器、铁铲(锹)、小刀、卷尺、采样袋(布袋、纸袋或塑料网袋)、采样标签、记号笔等。
1.2土样采集
土壤采自郊外,采集深度0~20cm,采样时先刮去2-3cm厚的表层土,用铁锹挖成一个深20cm的完整垂直剖面,再取宽10cm、厚2cm的土片,采用5点采集法,共采集6个土样,每个土样500g。
取样时先用铁锹铲出一个耕层断面,然后与断面平行取土。
每个采样点的取土深度及采集数量均一致,样品中上层土与下层土的含量相同;取土器入土时要与地面垂直,且保持同一深度。
用刀和尺将土片削成宽2cm、厚2cm、长(自上而下)15-20cm的土条,捏碎大块,剔除石砾、植物残体等混杂物。
1.3样品的处理
采样多点混合,充分拌匀成为混合土样。
每一个混和土样中称取1kg,样品的数量过多时采用四分法除去多余的土壤,即将样品放在干净的平面上,将其碾碎、混匀,并铺成平面四方形,沿对角线将土壤平均分成四份,对角的两份混匀成为一份,取其中一份。
如果得到的样品仍然比较多,可以再继续采取四分法处理,一直达到需求的数量为止。
1.4土壤稀释液的制备
取土样10g,放入盛有90ml无菌水并带有10粒无菌玻璃珠三角瓶中,震荡10分钟,制成均匀的土壤悬液,取10ml原液于试管,用1支1ml无菌液盛有9ml无菌水的试管中充分混合,再用无菌试管从此试管中再吸取1ml悬液,加入另一盛有9ml的无菌水的试管中,以此类推配制10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6.、10-7不同稀释度的土壤溶液。
2土壤微生物的分离与计数
2.1土壤细菌MPN计数
2.1.1选择性试管分离
按牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的配方(蛋白胨5.0g,琼脂18.0g,牛肉膏3.0g,蒸馏水1000mL,pH7.0~7.2),依次按试剂加入500ml的容量瓶中,加入一定量的无菌蒸馏水,震荡均匀后定容至500ml,将溶液倒入三角瓶内,120℃灭菌20min。
灭菌完毕后,待三角瓶温度降至50℃时,在无菌操作台上将溶液倒入试管。
倒入试管时,右手持盛装培养基的三角瓶置于火焰旁,左手将试管塞塞拔出,瓶口保持对着火焰,然后用右手手掌边缘与无名指夹住瓶塞,左手拿试管并将试管塞在火焰附近打开,迅速倒入,待冷却。
2.1.2试管的标记
选取10-7~10-35个相连的稀释度,将不同的稀释度悬液分别接种至不同培养基的试管中,每管接悬液1ml,每一稀释度重复3管,不同土壤稀释液细菌分离的培养皿标记如下表1所示:
表1不同稀释度土悬液细菌筛选试管编号
土壤浓度10-310-410-510-610-7
I1II1III1IV1V1
试管编号I2II2III2IV2V2
I3II3III3IV3V3
于28℃培养7~14d,根据各稀释系列试管中有无细菌得出数量指标,并根据重复数量不同利用三次重复测数统计表查出细菌近似值。
每克干土中细菌数=
2.2放线菌的分离计数
2.2.1选择性试管分离
按改良高氏I号培养基的配方(蛋白胨5.0g,磷酸氢二钾0.5g,硫酸亚铁0.01g,琼脂18.0g,硝酸钾1.0g,硫酸镁0.5g,氯化钠0.5g,蒸馏水1000mL,pH7.0),临用时在已融化的高氏I号培养基中加入重铬酸钾溶液,以抑制细菌和霉菌的生长,每100ml培养基加入3%重铬酸钾。
按上述方法把培养液倒入试管待冷却。
2.2.2试管的标记
选取10-6~10-25个相连的稀释度,将不同的稀释度悬液分别接种至不同培养基的试管中,每管接悬液1ml,每一稀释度重复3管,不同土壤稀释液细菌分离的培养皿标记如下表2所示:
表2不同稀释度土悬液放线菌筛选试管编号
土壤浓度10-310-410-510-610-7
A1B1C1D1E1
试管编号A2B2C2D2E2
A3B3C3D3E3
于28℃培养7~14d,根据各稀释系列试管中有无细菌得出数量指标,并根据重复数量不同利用三次重复测数统计表查出放线菌近似值。
每克干土中细菌数=
2.3真菌的分离计数
2.3.1选择性试管分离
按马丁培养基的配方(蛋白胨5.0g,磷酸二氢钾1.0g,琼脂18g,琼脂18.0g,葡萄糖10.0g,硫酸镁0.5g,蒸馏水1000mL),为抑制大部分细菌及放线菌的生长,1000ml培养基中加入1%孟加拉红水溶液3.3ml,临用时每100ml培养基加1%链霉素液0.3ml。
按上述方法把培养液倒入试管待冷却。
2.3.2试管的标记
选取原液~10-45个相连的稀释度,将不同的稀释度悬液分别接种至不同培养基的试管中,每管接悬液1ml,每一稀释度重复3管,不同土壤稀释液细菌分离的培养皿标记如下表3所示:
表3不同稀释度土悬液真菌筛选试管编号
土壤浓度原液10-110-210-310-4
a1b1c1d1e1
试管编号a2b2c2d2e2
a3b3c3d3e3
于28℃培养7~14d,根据各稀释系列试管中有无细菌得出数量指标,并根据重复数量不同利用三次重复测数统计表查出真菌近似值。
每克干土中细菌数=
取原液
10ml于土样
试管10g
溶于三角瓶
并震荡10min1ml1ml1ml1ml1ml
1ml1ml
1ml1ml
原液10-110-210-310-410-510-610-7
1ml1ml1ml1ml1ml
1ml1ml1ml1ml1ml
I1II1III1IV1V1
I2II2III2IV2V2
1ml1ml1ml
细菌筛选
试管
I3II3III3IV3V3
1ml1ml1ml1ml1ml1ml
A1B1C1D1E1
1ml1ml1ml1ml1ml
A2B2C2D2E2
1ml1ml1ml1ml1ml
放线菌筛选试管
A3B3C3D3E3
1ml1ml1ml1ml1ml
a1b1c1d1e1
1ml1ml1ml1ml1ml
a2b2c2d2e2
真菌筛选试管
a3b3c3d3e3
2.4土壤细菌、放线菌、真菌的生长情况及计数
7~14天后将上述分离得到的培养细菌、放线菌、真菌的试管取出,观察各试管菌落生长情况、菌落数及计数出每克干土菌种含量,细菌、放线菌、真菌的筛选试验结果分别见下表4、表5、表6所示:
表4土壤细菌的MPN计数
土悬液试管菌体生长菌体重复数数量近似值每克
稀释度编号个数情况平均数指标干土菌数
I1
10-3I2
I3
II1
10-4II2
II2
III1
10-5III2
III3
IV1
10-6IV2
IV3
V1
10-7V2
V3
表5土壤放线菌的MPN计数
土悬液试管菌体生长菌体重复数数量近似值每克
稀释度编号个数情况平均数指标干土菌数
A1
10-2A2
A3
B1
10-3B2
B3
C1
10-4C2
C3
D1
10-5D2
D3
E1
10-6E2
E3
表6土壤真菌的MPN计数
土悬液试管菌体生长菌体重复数数量近似值每克
稀释度编号个数情况平均数指标干土菌数
a1
原液a2
a3
b1
10-1b2
b3
c1
10-2c2
c3
d1
10-3d2
d3
e1
10-4e2
e3
3土壤微生物生理生化分析
3.1细菌的生理生化分析
从培养细菌的试管中挑取长势良好的菌株至250ml三角培养瓶培养皿进行扩大培养,一段时间后将所得的菌株接种至不同配方、不同编号的培养皿中,每个培养皿重复5次,待培养起满后观察菌落在不同培养皿上现象,以判断土悬液的细菌生理生化性质。
接种至
培养皿进行
扩大培养
A1A2A3A4A5
培养瓶
B1B2B3B4B5
C1C2C3C4C5
。
。
,。
。
。
。
。
。
。
。
。
。
。
。
。
。
。
。
。
。
。
。
。
。
Y1Y2Y3Y4Y5
从土壤中分离所得到的细菌的生理生化特性和现象如下表7所示:
表7土壤细菌生理生化特性及现象
试验序号试验名称培养基培养时间温度试剂检验方法不同编号培养皿现象
A1A2A3A4A5
1氧化酶牛人膏1%盐酸
.试验蛋白胨18~24h室温二甲对显红色为
培养基苯二氨阳性、
水溶液、1min内
α-萘酚、显色视
乙醇阴性
B1B2B3B4B5
2接触酶营养琼脂18~24h室温3%H2O2有气泡
试验培养基产生为
阳性
C1C2C3C4C5
3糖(醇)牛肉膏溴麝香草培养液
发酵试验蛋白胨室温酚蓝水溶变黄则
培养基液产酸
D1D2D3D4D5
4碳源利用无机氮14d室温含碳试验
培养基菌生长明
显快者为
阳性,反
之阴性
E1E2E3E4E5
5氮源利用有机碳含氮试验
基础陪14d室温菌生长明
养基显快者为
阳性,反
之阴性
F1F2F3F4F5
6葡萄糖低有机
氧化发酵氮培养18~24h30℃开管时变
试验基黄为氧化
产酸,开
闭管均变
黄发酵
产酸
G1G2G3G4G5
7乙酰甲基基础陪6d室温5%α-萘呈红色为
试验养基酚、阳性,黄
40%色为阴
NaOH性
续表土壤细菌生理生化特性及现象
试验序号试验名称培养基培养时间温度试剂检验方法不同编号培养皿现象
H1H2H3H4H5
8甲基红基础5%α-萘
.试验培养基4d37℃酚、呈红色为
40%阳性、黄
NaOH色为阴性
溶液
菌落周围I1I2I3I4I5
9淀粉水解营养琼脂2~7d室温有无透明
试验培养基圈或有紫
红色
J1J2J3J4J5
10纤维素分胨水基础有透明圈
解试验培养基5~15d室温为阳性
K1K2K3K4K5
11明胶液化明胶培18~24h20℃酸性升菌苔周围
试验养基汞溶液出现清晰
透明圈
L1L2L3L4L5
12硝酸盐还牛肉膏蛋3℅过氧加格利斯
原试验白胨培养5d室温化氢试剂呈红
基色、橙色
M1M2M3M4M5
牛肉膏蛋5d室温奈氏试剂出现黄
13产氨试验白胨培养色或褐色
基沉淀
N1N2N3N4N5
14硫化氢产牛肉膏蛋14d室温铅盐黑色硫化
生试验白胨培养铅沉淀
基
续表土壤细菌生理生化特性及现象
试验序号试验名称培养基培养时间温度试剂检验方法不同编号培养皿现象
O1O2O3O4O5
15吲哚产生胰胨水溶对二甲基
.试验蛋白胨2~7d室温氨基苯红色的玫
培养基甲醛瑰吲哚
P1P2P3P4P5
16石蕊牛奶牛奶石蕊30d室温石蕊根据石蕊一陪养基颜色变化
判断
Q1Q2Q3Q4Q5
17尿素水解琼脂培养酚红指红色圈为
试验基4d室温示剂阳性
R1R2R3R4R5
182d室温本尼迪克
3-酮基乳酵母膏乳特试剂菌落周围
糖产生试糖培养基有黄褐色
验沉淀为
阳性
S1S2S3S4S5
19柠檬酸盐基础培养酚红指指示剂由
试验基3~5d室温示剂淡红色变
为玫瑰色
T1T2T3T4T5
20氰化钾试基础培养1~2d37℃20%
验基KOH、是否能生
硫酸亚铁长
U1U2U3U4U5
21络氨酸营养琼脂7~14d室温是否水解
水解试验陪养基络氨酸
续表土壤细菌生理生化特性及现象
试验序号试验名称培养基培养时间温度试剂检验方法不同编号培养皿现象
V1V2V3V4V5
丙二酸盐丙二酸盐
22试验培养基1~2d室温溴百里培养基生
酚蓝变蓝为阳
性
W1W2W3W4W5
23马尿酸盐马尿酸肉28d室温50℅有针状晶
水解试验汤液H2SO4体出现为
阳性
X1X2X3X4X5
24苯丙氨酸营养琼脂24h室温三氯化呈绿色
脱氨酶测培养基铁为阳性
定
Y1Y2Y3Y4Y5
25色氨酸脱色氨酸脱24h室温三氯化呈红褐
氨酶测定氨酶培养铁色为阳
基性
鉴
定
结
果
3.2放线菌的生理生化分析
从培养细菌的试管中挑取长势良好的菌株至250ml三角培养瓶培养皿进行扩大培养,一段时间后将所得的菌株接种至不同配方、不同编号的培养皿中,每个培养皿重复5次,待培养起满后观察菌落在不同培养皿上现象,以判断土悬液的放线菌菌生理生化性质。
从土悬液中筛选的放线菌的生理生化特性如下表8所示:
表8土壤放线菌生理生化特性及现象
试验序号试验名称培养基培养时间温度试剂检验方法不同编号培养皿现象
a1a2a3a4a5
1明胶液化明胶30d28℃观察明胶
.试验培养基是否分解
b1b2b3b4b5
2牛奶凝固碳酸钙30d28℃凝固后有
与胨化液体出现
c1c2c3c4c5
3淀粉水解淀粉培养透明圈的
试验基20d28℃碘液大小
d1d2d3d4d5
纤维素水30d28℃滤纸上生
4解长情况和
滤纸分解
情况
e1e2e3e4e5
5硫化氢的含硫培养是否有菌
产生试验基7~14d28℃落生成
f1f2f3f4f5
6不同碳源基础培养7d室温是否有菌
试验基落生成
g1g2g3g4g5
黄豆饼粉
7抗菌谱测浸汁琼脂6~7d28℃抑菌圈的
试培养基产生表明
有抗生素
结
果
鉴
定
4土壤中功能微生物的测定
将各稀释度的土悬液进行补贴方法的测定,以鉴定土壤中含有功能细菌的种类,试验结果如下表9所示:
表9土壤中功能微生物的测定
功能微生物类群
培养基
培养温度
培养时间
试剂
稀释度
分离方法
检验法
试验现象
1、氨化细菌
蛋白胨氨化培养基
28℃
3d、5d分别都观察
奈氏试剂
10-9~10-6
稀释法
根据培养基的浑浊度、菌膜、沉淀、气味、颜色等变化判断氨化细菌的有无
2、硝化细菌
改良的斯蒂芬森培养基
28℃
14d
格利斯试剂,二苯胺
10-6~10-3
稀释法
吸取5滴培养液于白瓷板上,加利斯试剂,呈红色
3、反硝化细菌
反硝化细菌培养基
28℃
14d
格利斯试剂,二苯胺
10-7~10-3
稀释法
如有反硝化细菌,培养液变浊,甚至有气泡出现
4、好氧性自生固氮细菌
5、厌氧性自生固氮细菌
阿须贝氏培养基
厌氧性自生固氮细菌培养基
28
℃
28℃
7d
5d
滤纸条
无
10-4~10-1
10-7~10-4
稀释法
稀释法
如滤纸上出现褐色菌落,表示有自生固氮菌的生长
观察气泡及丁酸的生成,同时镜检,以观察菌体
6、硫化细菌
硫化细菌培养基
28℃
15d和30d
氯化钡
10-6~10-2
稀释法
检查时加入氯化钡,如有白色沉淀,即有硫酸根
7、反硫化细菌
反硫化细菌培养基
28℃
14d
柠檬酸铁
10-6~10-2
稀释法
添加5℅柠檬酸铁1或2滴,观察试管底部及管壁是否有黑色沉淀
8、磷细菌
蒙金娜有机磷培养基
28℃
5d
还原剂亚硫酸氢钠
10-7~10-4
稀释法
加入还原剂化学纯亚硫酸氢钠1mL呈蓝色
磷酸三钙无机磷培养基
室温
7d
无
10-6~10-4
平板分离法
计算具有透明圈的菌落数及细菌菌落总数,从透明圈的大小作为产酸解磷能力强弱的指标
9、钾细菌
硅酸盐培养基
28℃
4d
无
10-4、10-3
稀释法
选择大型、透明凸起、十分粘稠而有弹性的菌落
10、铁细菌
铁细菌培养基
28℃
10d
无
10-6~10-2
稀释法
观察铁细菌的生长,得出数量指标
11、纤维分解菌
赫奇逊培养基(好氧性)
28℃
14d
滤纸条
10-5~10-1
稀释法
检查各试管中滤纸条上细菌菌落的出现及滤纸变薄、断裂、色素产生情况
磷酸铵钠培养基(厌氧性)
28℃
14d
滤纸条
10-5~10-1
稀释法
取出检查滤纸上的溶解区及菌落或色斑情况
12、甲烷产生菌
甲烷产生菌培养基
30℃
10d
无
稀释法
培养管内壁凝固成均匀透明的琼脂薄膜
13、光合细菌
光合细菌培养基
室温
无
无
碱性没食子酸法
培养结束后,在无菌条件下推出凝固琼脂或打碎玻璃管
试验记录见下表10所示:
表10土壤细菌、放线菌、真菌的分离计数记录表
菌类培养基菌体土悬稀释度近似值数量值每克生理生化
成分形态特征土壤菌数特性
土壤10-310-410-510-610-7
细菌重
的分复
离测数
定
10-210-310-410-510-6
土壤重
放线复
菌的数
分离
测定
原液10-110-210-310-4
土壤重
真菌复
的分数
离测
定
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