显微镜直接计数法.docx

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显微镜直接计数法

验——微生物细胞大小的测定和显微镜直接计数

录入时间:

2011-4-139:

35:

15来源：

天津农学院精品课程

目的

1.1  学习接目测微计的校正方法， 了解血球计数板的构造和计数原理

1.2 学习使用显微镜测微尺测定微生物细胞大小，  掌握用血球计数板测定微生物细胞总数的方法。

2  原理

微生物细胞的大小是微生物分类鉴定的重要依据之一。

微生物个体微小，必须借助于显微镜才能观察，要测量微生物细胞大小，也必须借助于特殊的测微计在显微镜下进行测量。

显微测微计由镜台测微计和目镜测微计两部分组成。

后者可直接用于测量细胞大小。

它是一块圆形玻片（图7—1），其中央有精确等分到度，测量时将其放在接目镜中的隔板上。

由于目镜测微计所测量的是微生物细胞经过显微镜放大之后所成像的大小，刻度实际代表的长度随使用的目镜和物镜放大倍数及镜筒的长度而改变，所以，使用前须先用镜台测微计进行标定，求出某一放大率下，目镜测微计每一小格所代表的长度，然后用目镜测微计直接测被测对象的大小。

镜台测微计是一块中央有精确刻玻片（图7—1），刻度的总长为lmm，等分为100小格，每小格长10um，专用于对目镜测微计进行标定的。

3  材料

3.1  器械

显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺，载玻片、盖玻片、血球计算板、擦镜纸、吸水纸、玻片架、肾形盘、洗瓶、接种环、酒精灯、火柴、滴管。

3.2  菌种

培养48h的啤酒酵母斜面菌体和菌悬液。

3.3  革兰氏染液

4流程

4.1 置目测微计→置台测微计→标定目测微计→测菌体大小→记录结果→用毕擦拭干净

4.2 检查计数板→稀释样品→加样→计数→计算→清洗

5  步骤

5.1  微生物菌体大小的测定

5.1.1  目镜测微尺的校正

5.1.1.1  更换目镜镜头 

更换目镜测微尺镜头（标记为PF）；或者取下目镜上部或下部的透镜，在光圈的位置上安上目镜测微尺，刻度朝下，再装上透镜，制成一个目镜测微尺的镜头。

5.1.1.2  某一倍率下标定目镜刻度

将镜台测微尺置于载物台上，使刻度面朝上，先用低倍镜对准焦距、看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器使两尺重叠，并使二尺的左边的某一刻度相重合，向右寻找另外二尺相重合的刻度。

记录两重叠刻度间的目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数（图7-1C）。

5.1.1.3  计算该倍率下目镜刻度 

目镜测微尺每格长度=镜台测微尺格数/目镜测微尺格数xl0um

5.1.1.4  标定并计算其他放大倍率下的目镜刻度

以同样方法分别在不同倍率的物镜下测定目镜测微尺每格代表的实际长度。

如此测定后的测微尺的长度，仅适用于测定时使用的显微镜以及该目镜与物镜的放大倍率。

5.1.2  菌体大小的测定

5.1.2.1  将啤酒酵母制成水浸片。

5.1.2.2  大小换算

将标本先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺测定每个菌体长度和宽度所占的刻度，即可换算成菌体的长和宽。

5.1.2.3  求平均值

一般测量微生物细胞的大小，用同一放大倍数在同一标本上任意测定l0一20个菌体后，求出其平均值即可代表该菌的大小。

5.2  用血球计数板测定微生物细胞的数量

5.2.1  检查血球计数板 

取血球计数板一块，先用显微镜检查计数板的计数室，看其是否沾有杂质或干涸着的菌体，若有污物则通过擦洗、冲洗，使其清洁。

镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时才可使用。

5.2.2  稀释样品

将培养后的酵母培养液振荡振摇混匀，然后作一定倍数的稀释。

稀释度选择以小方格中的分布的菌体清晰可数为宜。

一般以每小格内含4～5个菌体的稀释度为宜。

5.2.3  加样

取出一块干净盖玻片盖在计数板中央。

用滴管取1滴菌稀释悬液注入盖玻片边缘，让菌液自行渗入，若菌液太多可用吸水纸吸去。

静置5—10分钟。

5.2.4  镜检

待细胞不动后进行镜检计数。

先用低倍镜找到计数室方格后，再用高倍镜测数。

一般应取上下及中央五个中格的总菌数。

计数时若遇到位于线上的菌体，一般只计数格上方（下方）及右方（左方）线上的菌体。

每个样品重复3次。

5.2.5  计算 

取以上计数的平均值，按下列公式计算出每毫升菌液中的含菌量。

菌体细胞数（cfu/mL）＝小格内平均菌体细胞数×400×104×稀释倍数

5.2.6  清洗 

计数板用毕后先用95%的形酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，最后用擦镜纸揩干净。

若计数的样品是病原微生物，则须先浸泡在5%石炭酸溶被中进行消毒，然后再行清洗。

清洗后放回原位，切勿用硬物洗刷。

图7-2 血细胞计数板

6  结果

6.1计算出目镜测微尺在低、高倍镜下的刻度值。

6.2 记录菌体大小的测定结果。

6.3 计算样品中酵母菌浓度。

7  思考

7.1  为什么随着显微镜放大倍数的改变，目镜测微计每格相对的长度也会改变？

能找出这种变化的规律吗？

7.2  根据测量结果，为什么同种酵母菌的菌体大小不完全相同？

7.3  能否用血球计数板在油镜下进行计数？

为什么？

7.4 根据自己体会，说明血球计数板计数的误差主要来自那些方面？

如何减少误差？

8 附录

目镜测数尺有两种：

一是特制的目镜镜头，镜片上刻有50等分或100等分的刻度，使用时直接安装在显微镜上，取代没有刻度的目镜镜头；另一种是一块直径大约17.5 mm的圆玻璃片，其中央刻有50等分或100等分的刻度（图7-1A），使用时将该玻璃片安装在原来的目镜镜头上即可。

由于不同的显微镜放大倍数不同，既使同一显微镜在不同的目镜、物镜组合下其放大倍数也不同，故目镜测微尺每格实际表示的长度随显微镜放大倍数不同而异。

也就是说，目镜测微尺上的刻度只代表相对的长度。

因此在使用前须用镜台测微尺校正，以确定在一定放大倍数下目镜测微尺的每格长度。

血球计数板是一块特别的厚玻片，玻片中央分剖成两个平面，上面各刻有9区，中央一区为计数室，供计数用（图7-2A），此区的长和宽各为1mm。

中央平面两侧有小沟，小沟外有两条突起的平台，平台比中央平面高0.1mm，因此计数室体积为0.1mm3，容积为10-4ml。

通常计数室分为25个大格，每大格又分为16个小格，每小格容积为4×10-6ml，即lml菌液容积相当于400万个小格体积。

因此只要将细胞悬液注人计算室，计算出一定数量小格的平均菌数即可算出每毫升的细胞数。

显微镜直接计数法

基本原理

　　利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。

此法的优点是直观、快速。

将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。

由于计数室的容积是一定的（ 0．1mm2），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。

由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。

　　血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。

中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。

血球计数板构造如图Ⅷ-1。

　　计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格（图Ⅷ-2）；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格（图Ⅷ-1，C）。

但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格，如图Ⅷ-2。

　　每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。

　　在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。

　　下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：

设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数

　　因1ml=1cm3=1000mm3，

 （即0.1mm3中的细菌总数）=A*B*25/5

  故1ml菌液中的总细菌数=A*25*10*1000*B/5　　

　 　　　　　　　　　　=50000A·B（个）

二、器材

　　酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。

三、操作步骤

　　1．稀释

　　将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。

　　2．镜检计数室

　　在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。

若有污物，则需清洗后才能进行计数。

　　3．加样品

　　将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。

注意不可有气泡产生。

　　4．显微镜计数

　　静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。

一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。

每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。

位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。

如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。

计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。

　　5．清洗血球计数板

　　使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。

镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。

若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

四、实验报告   

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微生物数量的测定

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实验三十一平板菌落计数法

实验三十一平板菌落计数法

录入时间:

2009-1-69:

54:

00来源：

青岛海博生物

一、基本原理

　　平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。

计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。

　　这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。

此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。

但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。

二、器材

　　大肠杆菌悬液，牛肉膏蛋白胨培养基， 1ml无菌吸管，无菌平皿，盛有4． 5 ml无菌水的试管，试管架和记号笔等。

三、操作步骤

　　1．编号：

　　取无菌平皿 9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6各3套。

另取6支盛有4．5ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

　　2．稀释

　　用1ml无菌吸管精确地吸取0．5ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出时，管内液体外溢。

然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。

另取一支吸管自10-1试管吸0．5ml放入10-2试管中，吸吹三次，……其余依次类推。

整个稀释过程如图Ⅷ-3。

　　3．取样

　　用3支1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0．2ml，对号放入编好号的无菌培养皿中。

　　4．倒平板

　　于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基约10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待