心肌肌钙蛋白的融合表达和分离纯化解读.docx
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心肌肌钙蛋白的融合表达和分离纯化解读
心肌肌钙蛋白Ⅰ的融合表达和分离纯化
劳兴珍1,吴国球2,何贝斌
绵3,沈子龙3
(1.中国药科大学生物信息学教研室,江苏南京210009;2.东南大学附属中大医院检验科,
江苏南京210009;3.中国药科大学生物技术中心,江苏南京210009
摘 要:
目的研究人心肌肌钙蛋白(cTnⅠ
在大肠杆菌中稳定高效的融合表达和分离纯化,以满足临床诊断的需要。
方法人cTnⅠDNA序列由pdf52cTnⅠ质粒经PCR亚克隆而得,然后将其插入pET32a(+载体,构建成
pET32a(+2cTnⅠ表达质粒,以大肠杆菌BL21(DE3为表达菌,在IPTG诱导下进行表达。
硫氧还蛋白(TrxA2cTnⅠ融合蛋白得到高效表达,并经金属螯合亲和色谱一步纯化得到目的蛋白质白质具有cTnⅠ免疫原活性。
结论构建了pET32a(+2cTnⅠ重组质粒,,为建立急性心肌梗死早期诊断试剂奠定了基础。
关键词:
心肌肌钙蛋白Ⅰ;融合表达;; 中图分类号:
R542.22;R786 21678(20060320150203
coliandaffinitypurificationoftroponinⅠ
ing2zhen1,WUGuo2qiu2,HEYun2mian3,SHENZi2long3
(1.ofBioinformaticsofChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China;
2.DepartmentofLaboratory,theAffiliatedZhongdaHospitalofSoutheastUniversity,Nanjing210009,China;
3.TheBiotechnologyCenterofChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China
Abstract:
PurposeThepresentworkwastoexpressastableheterologoushumancTnⅠfusionproteinto
TrxAaspartofanoverallstrategyfortheisolationandpurificationofenoughmaterialforuseasadiagnosticcalibrator.MethodsTheDNAsequencewasisolatedfromthecDNAplasmidpdf52cTnⅠbyPCRandclonedasafusiontotheC2termiusofTrxAandtherecombinantcTnⅠexpressionvectorwasconstructedandex2pressedinhostE.coliBL21(DE3.ResultsWheninducedwithIPTG,thepET32a(+2cTnⅠwashighlyexpressedinE.coli.Thefusionproteinwasaffinity2purifiedoveraHistrapColumn.ThetroponinⅠfusionproteinwasassayedandfoundtoexhibitsimilarimmunogenicresponserelativetonaturalcardiactroponinⅠ.ConclusionTheresultsdemonstratedthatTrxA2cTnⅠwassuccessfullyexpressed.TherecombinantcTnⅠwasapplicableinearlydetectionofacutemyocardialinfarction.
Keywords:
cardiactroponinⅠ;fusionexpression;IrxA;acutemyocardialinfarction;affinitypurifica2tion
收稿日期:
2005210218;修回日期:
2005212214
作者简介:
劳兴珍(19782,女,广西灵山人,硕士,助教,主要研究方向为微生物与生化药学;沈子龙(19402,男,通讯作者,教授,博士生导师,主要研究方向为微生物与生化药学:
025*********。
1995年美国FDA批准心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ作为急性心肌梗死(AMI的最新实验诊断指标。
与
其它指标相比,cTnⅠ在血中出现持续的时间长,且为心肌细胞所特有。
在心肌细胞膜完整的情况下,cTnⅠ不能透出细胞膜进入血循环。
当心肌细胞因缺血、缺氧发生变性坏死时,cTnⅠ可通过破损的细
胞膜释放入血。
由于cTnⅠ相对分子质量(Mr较小并持续从变性细胞中溢出。
因此对AMI诊断敏感性高,特异性强,还可用于AMI的后期监护、预后及疗效判断[1]。
用传统的分离方法从人心肌组织中提取cTnⅠ是非常困难的。
为此,我们以pET32a(+为cTnⅠ克隆基因的表达载体,在大肠杆菌中经诱导后高效表达出TrxA2cTnⅠ融合蛋白,为制备高质量质控产品及建立相关的检测方法打下基础。
1 材 料
pdf52cTnI质粒,中国药科大学生物技术中心
51中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2006年第27卷第3期
构建;pET32a(+,美国Novagen公司;JM109、BL21(DE3,中国药科大学生物技术中心保存;dNTP、10PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶,上海生工生物技术有限公司;T4DNA连接酶,美国Promega公司;cTnⅠTestKit,美国CorteaDiagnostic公司;HisTrapkit,Amersham公司;Ampgene4800PCR仪,北京昊诺斯科技有限公司;其它试剂均为国产或进口分析纯。
2 方 法
2.1 pET32a(+2cTnⅠ质粒的构建[2]
人cTnⅠDNA序列由pdf52cTnⅠ质粒经PCR亚克隆而得。
PCR的条件为:
pdf52cTnⅠ模板1μL,10buffer5μL,10mol/LdNTP1μL,TaqPlus0.5μL,引物各1μL,最后加1滴石蜡油,置于PCR仪,955min变性后,执行94℃1min,56℃,℃1min程序,25个循环后72℃
1.2%
设计有EcoR,先用EcoRⅠ和HindⅢ酶切PCRpET32a(+质粒,分别回收片段和载体,将此片段和载体按适当的比例进行连接,并转化至JM109宿主菌中,经挑选得到阳性重组质粒,命名为pET32a(+2cTnⅠ。
2.2 pET32a(+2cTnⅠ的表达
将重组质粒转化至BL21(DE3菌种,37℃培养过夜,以1%的接种量转接,培养至A600nm值为0.6~0.8时,加入终浓度为1mmol/LIPTG进行诱导表达。
培养4h后,离心收集菌体,使用12%SDS2PAGE检测目的蛋白质。
2.3 TrxA2cTnⅠ融合蛋白的亲和纯化
2.3.1 蛋白质初提物的提取 将菌体悬浮于20mmol/LTris2HCl(pH8.0、0.5mmol/LEDTA缓冲液中。
冰水浴上超声裂菌。
待菌液黏度下降后,
10000r/min离心10min收集菌液上清。
2.3.2 HisTrapkit亲和色谱 将细胞裂解液上清上样于已用平衡缓冲液Ⅰ(pH8.0,20mmol/LTris2HCl,10mmol/L咪唑预平衡过的亲和柱。
上样完毕后,先用平衡缓冲液Ⅰ充分洗柱,后分别用含20,40,60,100,300,500mmol/L咪唑的20mmol/LTris2HCl(pH8.0进行分步洗脱。
取少量供试品进行电泳分析。
2.4 以肌钙蛋白胶体金诊断试剂盒检测目的蛋白质免疫活性
将菌体裂解液上清直接上样于测试板的小孔内,同时含pET32a(+的BL21(DE3同样进行细胞破碎,并将菌体裂解液上清作为阴性对照。
3 结 果
3.1 pET32a(+2cTnⅠ表达载体的构建
将cTnⅠ基因克隆入pET32a(+的EcoRⅠ和HindⅢ位点,通过铺板、培养、扩增、酶切等操作初选出阳性克隆,酶切图谱见图1,重组质粒由上海生物工程有限公司进行测序,结果与预期序列一致
。
(EcoRⅠ+HindⅢ;2.pET32a(+2cTnⅠ重组质粒以EcoRⅠ+HindⅢ进行双酶切;3,4.pET32a(+2cTnⅠ重组质粒分别以EcoRⅠ,HindⅢ进行单酶切
1.λDNAmarkers(EcoRⅠ+HindⅢ;2.pET32a(+2cTnⅠrecombinantplasmiddigestbyEcoRⅠandHindⅢ;3,4.pET32a(+2cTnⅠrecombi2nantplasmiddigestbyEcoRⅠ,HindⅢ,respectively
图1 pET32a(+2cTnⅠ重组质粒的酶切分析
Fig1 RestrictionenzymedigestionanalysisofpET32a(+2cTnⅠrecombinantplasmid
3.2 目的蛋白质的诱导表达和纯化
挑取重组菌单菌落在LB中37℃培养过夜,以1%的接种量转接,培养至A600nm值为0.6~0.8时,加入终浓度为1mmol/L的IPTG,继续培养4h后,离心收集菌体,使用12%SDS2PAGE检测目的蛋白质。
电泳结果显示:
与对照组相比,发现有新的蛋白质条带产生(图2。
观察发现,加入IPTG诱导后,转入空载体的细菌总蛋白质提取物中出现1个Mr为20000的新蛋白质,而转入重组质粒pET32a(+2cTnⅠ的细菌总蛋白质提取物中出现的新蛋白质Mr为44000左右。
分析认为,空载体上产生的蛋白质是TrxA,而重组质粒pET32a(+2cTnⅠ质粒中产生的蛋白质是TrxA2cTnⅠ融合蛋白。
进一步的分析证明目的蛋白质大部分以裂解液上清形式存在。
结果表明载体构建成功,而且适用于蛋白质的高效可溶性表达。
细胞裂解液上清经亲和柱分步洗脱后,纯化的TrxA2cTnⅠ融合蛋白主要位于300mmol/L咪唑洗脱峰中,达到电泳纯(图3。
3.3 TrxA2cTnⅠ的免疫活性
阳性菌落经IPTG诱导后,离心得到菌体并破碎获得上清后,由肌钙蛋白胶体金诊断试剂盒检测到151
中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2006年第27卷第3期
cTnⅠ蛋白免疫原活性(图4。
证明了目的蛋白质
得到正确表达
。
1.诱导前全菌;2.含pET32a(+质粒的诱导后全菌;3.含pET32a(+2cTnⅠ重组质粒的诱导后全菌;4.中Mr标准蛋白质1.UninductedlysateofBL21;2.InductedlysateofBL21[DET32a(+];3.InductedlysateofBL21[pET32a(+2cTnⅠ];4.Proteinmarker图2 Fig2 SDS2PAGEanalysisofproteinbefore
induction1.中Mr标准蛋白质;2.纯化的TrxA2cTnⅠ融合蛋白1.Mediumproteinmarker;2.PurifiedTxA2cTnⅠfusionprotein
图3 纯化蛋白质的电泳分析
Fig3 SDS2PAGEanalysisofpurifiedfusionprotein
4 讨 论
本文采用的原核表达载体pET32a(+,含T7
启动子和转录终止信号,其特点除了能够编码6个组氨酸残基外,还带有大肠杆菌硫氧还蛋白(TrxA基因。
TrxA基因编码109个氨基酸的硫氧还蛋白。
硫氧还蛋白是低Mr的氧化还原酶,在蛋白质折叠过程中可催化二硫键的正确形成,对大肠杆菌表达的重组蛋白质正确折叠更为有效,从而增加蛋白质的可溶性[324]。
外源基因经多克隆位点插入后与TrxA一起融合表达,外源蛋白质与硫氧还蛋白融合表达不仅提高了表达产物的稳定性
而且由于Mr
1.以含pET32a(+质粒诱导后菌体的破碎后上清为阴性对照;2.
含重组质粒诱导后全菌体的破碎后上清
1.InductedlysateofBL21[pET32a(asnativecontrol;2.Inducted
lysateof32a(+2cTn]
4 assayoffusionprotein
S2分析时更容易鉴定。
此外,外源
别位点,从而使外源蛋白质与硫氧还蛋白的分离变得方便。
游离的cTnⅠ在血液中很不稳定[526],易降解,Mr较小,因此把cTnⅠ基因融合在TrxA基因的下游,表达成较大Mr的融合蛋白质,增加其稳定性。
这一目的蛋白质在大肠杆菌中得到高效表达以及快速纯化,为以后制作ELISA快速诊断试剂盒奠定了基础。
参考文献:
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2
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