脓汁和粪便标本中病原菌的检测实验报告模板一_精品文档.doc
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医学微生物学实验报告
姓名_____________
学号___________
年级_______
组别________
实验名称
脓汁和粪便标本中病原菌的检测
实验者
合作者
日期
指导老师
一、实验目的
1、掌握培养基的制备的原则和一般方法
2、掌握细菌的分离培养方法
3、掌握油镜的正确使用,细菌标本图片的制备
4、掌握细菌的形革兰氏染色法以及形态学检查方法
5、熟悉细菌的生化试验方法(糖发酵试验、抗菌素敏感性试验、血浆凝固酶实验、动力学实验)的原理及方法
6、掌握玻片凝集试验的原理及方法
二、实验器材
1、5ml试管15支、托盘天平、锥形瓶、营养肉汤干粉培养基、量筒、使馆狂、酒精灯、洗耳球、刻度吸管
2、脓汁标本1支,粪便标本1支、伊红美兰平板2个,营养琼脂平板2个、接种环、酒精灯
3、斜面4支、细菌分离培养物(上次实验平板)
4、斜面培养物4支,营养肉汤4支,生理盐水2支,镜油瓶、拭镜纸1套,吸水纸1本,载玻片4张
5、斜面培养物4支,营养肉汤培养物(菌液)4支,半固体琼脂4支,营养琼脂平板4个,糖发酵管1套,抗菌素纸片1套,眼科镊子2把。
6、半固体培养物4支,药敏试验培养物4个,微量发酵管培养物1套。
三、方法与步骤
流程图:
营养琼脂培养基的制备
细菌的分离培养
细菌的纯培养
细菌形态学检查
液体培养基接种
细菌的生化实验
1、营养肉汤培养基的制备
①称取1.1g营养肉汤干粉培养基于锥形瓶中,加入50ml蒸馏水溶解
②加热煮沸1次,加热时需要摇动
③分装于15支小试管中,每支3ml
④集中放在试管筐中,罩上硫酸纸和牛皮纸,用橡皮筋包扎好
⑤灭菌
2、细菌的分离培养
平板画线法:
小组分工:
甲→脓汁标本→营养琼脂平板丙→粪便标本→伊红美蓝平板
乙→脓汁标本→营养琼脂平板丁→粪便标本→伊红美蓝平板
步骤:
①点燃酒精灯,把接种环在酒精灯上烧灼灭菌,金属杆快速通过火焰2~3次,以杀灭表面微生物。
②取出标本,在火焰旁边,左手斜持标本管下端,右手小指夹住试管棉塞上端,缓慢拔出棉塞并夹持之,管口迅速通过火焰3次
③将冷却的接种环沾取标本1环,管口迅速通过火焰灭菌后塞上棉塞放回。
④接种环与平板呈30~40度角,在平板表面上方,以曲线的形式,作大幅度来回连续划线,边划边退,线段要划得长而密集,每区划线不少于30条。
画完第一区要烧掉接种环上多余的标本。
转动平板,转动平板,通过第一区5~7次,使接种环重新沾上少量细菌,同样的方法划过第二到五区,接种环呈递减次数地通过第二到第四区。
⑤平板倒置,37℃培养18~24h,观察结果。
3、细菌的纯培养(斜面接种法)
分工:
甲→金黄,乙→白色。
丙→紫黑,丁→粉红。
步骤:
①取制作的平板,在菌落分布最稀疏的区域,选择平板上典型的、容易挑取的单菌落。
(从营养琼脂平板中分别选取金黄色菌落、白色菌落,从伊红美蓝平板上分别选出紫黑色菌落、粉红色菌落。
)
②接种环套住菌落,轻轻刮取细菌。
③接种环取菌后,伸入斜面底部,自下向上先拉一条细菌接种线。
再伸入底部,自下向上,作蜿蜒划线。
④37℃培养24小时,观察结果。
4、细菌形态学检查(革兰氏染色法)
①加样枪取盐水左3ul、右3ul,水滴间距小于2cm。
②挑取菌苔少许(1mm小菌落的半量)与生理盐水混匀,涂成1cm2大小的均匀薄膜
③涂毕,环移至涂膜中央侧立,待环内菌膜破裂,将接种环通过火焰灭菌
④涂片在室温干燥或烘干,手持玻片一端,标本面朝上,在火焰外层快速通过2~3次,将标本固定,促使菌体蛋白质凝固,固定在载玻片上,以免染色水洗的时候,细菌被水洗掉。
⑤革兰染色:
初染:
结晶紫→初染1分钟→水洗
↓
媒染:
卢戈碘液→媒染1分钟→水洗
↓
脱色:
95%乙醇→脱色约20秒钟→水洗
↓
复染:
稀释品红→复染1分钟→水洗
↓
吸干,镜检。
5、液体培养基接种
分组:
甲→金黄乙→白色,
丙→紫黑丁→粉红。
①无菌操作,接种环斜面取菌,在靠近培养基液面管壁上,上下研磨接种。
②在管壁上,将接种环内的菌膜拍破。
退出接种环,烧灼灭菌。
6、细菌的生化实验
(一)半固体穿刺接种法
分工:
甲→紫黑,乙→紫黑;丙→粉红,丁→粉红。
①无菌操作,接种针斜面取菌,从半固体中心,垂直刺入,到达培养基底部5分之4处,再循原来的路线,退出接种针。
②管口、接种针经火焰烧灼灭菌。
(二)细菌的糖发酵试验
分工:
甲→紫黑→①葡萄糖丙→粉红→③葡萄糖
乙→紫黑→②乳糖丁→粉红→④乳糖
①用砂轮在糖发酵管液面上方2~3cm处,切割一道切痕。
将管子打开,管口烧灼灭菌
②接种针针尖斜面取菌,伸入培养基内,在管壁上,上下研磨接种。
③管口朝向相同,放置在平皿内。
(三)抗菌素敏感性试验(纸片扩散法)
①接种环取菌液3~5ul2次,在平板培养基表面,拉出2条细菌接种线,使呈“十字形”(操作时,不得同时握持菌液管和平板,以免菌液倒出来,造成污染)。
②平板密集划线接种细菌(纱窗样)。
每次将平板旋转90°,保证菌液均匀分布。
③设计三点,作标记:
青、链、庆。
呈等边三角距离,点距离平皿边缘约15mm。
④镊子火焰消毒,夹取相应的药物纸片,平贴在已设定的位置上,按压,镊子火焰灭菌。
⑤做标记,37℃18~24小时培养,观察结果。
(四)血浆凝固酶试验
兔血清+白色和黄色
①取2滴兔血浆置于洁净的玻片上。
②分别用接种环取白色和黄色菌苔(约2~3个菌落的菌量)与血浆研磨混合,立即观察结果。
③菌液出现明显凝块者为阳性,否则为阴性。
7、细菌的血清学试验(玻片凝集试验)
①取洁净的载玻片一张,将磨面近端设为对照区,滴加生理盐水15ul。
远端设为试验区,滴加福氏志贺菌诊断血清15ul
②用接种环分别取粉红色菌苔,约2个小菌落的菌量,研磨于盐水或血清内,混合均匀,涂抹展开。
③载玻片来回倾侧,让菌液充分混匀,凝集速度更快、结果更清楚。
④菌液凝集者记为阳性,菌液均匀混浊记为阴性
四、结果与讨论
1、营养肉汤培养基的制备
图1:
营养肉汤培养基的制备
图2.2丙,丁→粪便标本→伊红美蓝平板
图2.1甲,乙→脓汁标本→营养琼脂平板
2细菌的分离培养
平板画线法:
结果观察:
1、由实验结果图可看出,脓汁标本在普通平板上有金黄色、白色两种菌落,菌落直径约2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐、不透明。
2、粪便标本在伊红美蓝平板上,有紫黑色、粉红色两种菌落,颜色不是细菌本身的颜色,其中紫黑色菌落较大较明显,且形成紫黑色具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落。
讨论:
1、粪便标本在伊红美蓝平板上,颜色的产生是因为大肠埃希菌分解乳糖产酸,酸使伊红与美蓝结合,形成紫黑色具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落。
2、从四张平板画线的结果上来看,第三张图分离效果很好,得到的菌落典型。
而其他三张均有不足。
第一二张脓汁的营养琼脂平板,前面两区涂抹太密集,而板的其他部位未充分利用,得不到十分明显的菌落。
第四张粪便的平板第一区太稀疏,未充分利用平板,故在培养后未见到数量较少的粉红菌落,原因是划线时不熟练,不能连续划线。
3、细菌的纯培养(斜面接种法)
图3.1斜面接种产物(右左向右依次为金黄,白色粉红,紫黑菌苔)
结果观察与讨论:
1、从普通平板上挑取的金黄色和白色菌落接种的斜面,菌苔的颜色,仍然呈金黄色和白色。
2、从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面,菌苔已经没有原来菌落的颜色。
菌苔灰白色、表面湿润、光滑、半透明。
4、细菌形态学检查(革兰氏染色法)
图4.1脓汁菌苔(左边为白色菌苔,右图为金黄色菌苔)
图4.2粪便菌苔(左图为粉红菌苔,右图为紫黑色菌苔)
结果观察与讨论:
1、从脓汁标本中分离得到金黄色、白色两种菌落,显微镜油镜下呈紫色为G+球菌,排列不规则,呈葡萄串状,是典型的葡萄球菌。
这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。
2、从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。
显微镜油镜下呈粉红色为G-杆菌,散在排列,从形态上不能鉴别是什么细菌。
5、液体培养基接种
图5液体培养基接种结果
6、细菌的生化实验
(一)半固体穿刺接种法
图6.1(照片拍摄不明显)
结果观察及讨论:
表1.动力试验结果
菌苔半固体
紫黑细菌1+
紫黑细菌2-
粉红细菌1-
粉红细菌2-
+:
阳性-:
阴性
1、紫黑细菌1细菌自接种部位向四周移动、扩散生长,培养基呈云雾状或根须状混浊状态,有鞭毛。
但是实验时发现紫黑菌苔2无任何现象。
经过分析,应当是用接种针取菌苔时,操作者仅针尖前部接触了少量菌苔,导致穿刺后无细菌的生长。
但是结合其他组的结果,我们认为紫黑菌苔应当是动力阳性的。
2、粉红细菌菌苔均沿着直线生长,可看出其无鞭毛。
(二)细菌的糖发酵试验
图6.2.从左至右分别为:
(④粉红→乳糖③粉红→葡萄糖②紫黑→乳糖①紫黑→葡萄糖)
结果观察与讨论:
1、实验结果记录为下表:
①葡萄糖②乳糖③葡萄糖④乳糖
⊕⊕+-
+:
产酸或阳性⊕:
产酸产气-:
阴性
2、紫黑细菌微型发酵关内液体变黄,产生气泡,气泡的高度分别为10mm和17mm,说明紫黑色菌苔既分解葡萄糖也分解乳糖,产酸产气;粉红细菌只分解葡萄糖,不产气,不分解乳糖。
(三)抗菌素敏感性试验(纸片扩散法)
图6.3
结果观察与讨论:
1、表3各菌抑菌圈直径(mm)表
菌苔青霉素头孢曲松庆大霉素
金黄色422530
白色302240
紫黑
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